CC BY
70
УДК615.849.19+616-001.45 И.Д. Косачев', С.А. Варзин2
1 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, С.-Петербург 2С.-Петербургский государственный университет, медицинский факультет
СТИМУЛЯЦИЯ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА В ОГНЕСТРЕЛЬНОЙ РАНЕ
Для стимуляции репаративных процессов в ране эффективен монохроматический красный когерентный свет с длиной волны 0,6328 мкм, который излучают низкоэнергетические гелий-неоновые оптические квантовые генераторы (ОКГ). Лучи гелий-неонового лазера оказывают местное стимулирующее действие на процессы регенерации в ране и общее положительное действие на организм. Некоторые теории, объясняющие механизм этого явления, указывает на способность структурных элементов тканей организма поглощать кванты красного света, излучаемые ОКГ, что приводит к усилению обменных процессов в них [1-5].
В эксперименте на животных и при лечении больных в клинике выявлены противовоспалительные и анальгезирующие свойства лучей лазера, при этом наблюдались укорочение фаз воспалительного процесса, стимуляция репаративной регенерации и ускорение эпителизации раневых поверхностей [6-9]. Сроки выздоровления больных с послеоперационными осложнениями ран при лазеротерапии достоверно короче, чем при применении обычных методов физиотерапии [10, 11]. Результаты
экспериментальных исследований, клинических наблюдений ряда авторов и наш опыт свидетельствуют о высокой эффективности лазеротерапии при лечении ран и трофических язв. Однако имеются единичные сообщения о влиянии лазерного излучения на репаративные процессы в огнестрельной ране [12].
Материал и методы исследования. Для изучения воздействия лучей лазера на течение раневого процессса не использовалиеь гелий-неоновые оптические квантовые генераторы с, длиной волны излучения 0,6328 мкм и еконетруированная нами приставка, позволяющая раефокуеировать луч для охвата всей поверхности раны. Для лазерного облучения огнестрельных ран применялась доза 0,5 X ІО4 Дж/м2, время экспозиции 30 с при мощности излучения 20 мВт. Оптимальная доза облучения получена нами на основе проведения предварительных экспериментов.
Исследования проведены на 112 взрослых кроликах (самцах), которые разделены на две группы: контрольную (32) и опытную (80). Всем животным наносили огнестрельную рану мягких тканей бедра из мелкокалиберного пистолета. Нанесение огнестрельных ран и выведение животных из эксперимента в разные сроки после хирургической обработки ран осуществляли под общим обезболиванием согласно Международным рекомендациям (этического кодекса) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985).
Животных с повреждением костей, магистральных сосудов и нервных стволов из опыта исключали. Первичную хирургическую обработку проводили через сутки после ранения под местной анестезией (0,25%-ный раствор новокаина). Проводили широкое рассечение раневого ка-
О И.Д. Косачев, С.А. Варзин, 2006
нала с удалением сгустков крови и инородных тел. Нежизнеспособные ткани иссекали, карманы раскрывали. Швы на рану не накладывали. В ткани раны в конце операции вводили раствор новокаина с антибиотиками. На следующий день и во вее последующие проводили перевязки. Область раны кроликов второй группы облучались лучами гелий-неонового лазера ежедневно в течение 14 еут, начиная с первого дня после хирургической обработки раны.
Для оценки течения раневого процесса использовали измерение площади ран в динамике, напряжение кислорода (Ро2) в тканях раны, микробиологические, цитологические, гистологические, гистохимические и электронномикроскопические исследования с учетом срока заживления раны в течение 21 еут.
Результаты и обсуждение. Характеристика местных изменений в ране. Из
анализа полученных результатов следует, что после двух-трех облучений уменьшалось количество раневого отделяемого и выраженность отека тканей в области раны. Инфекционные осложнения ран у кроликов опытной группы встречались в два раза реже, чем у животных, не подвергшихся лазерному облучению.
Средняя скорость заживления ран за сутки при лазерном облучении составила 4,2-6,1% от площади раны. Был проведен сравнительный анализ скорости заживления ран в соответствующие сроки у леченых и нелеченых животных. После лазерного облучения ран в первую неделю скорость их заживления возрастала в 1,4 раза, а во вторую неделю в 1,7-1,9 раза. Это свидетельствует о благоприятном воздействии лучей лазера на репаративные процессы как в фазе воспаления, так и в фазе репарации, причем в последней в большей степени.
Как в контрольной группе, так и при лазерном облучении отмечено снижение парциального напряжения кислорода в тканях раны. Так, Ро2 в ранах контрольных животных в первые сутки составляло 13,5+0,5 гПа, а после двух облучений — 20,0+0,5 гПа. При последующем облучении происходило восстановлениеРо2 в тканях раны и к 21 сут достигало первоначального уровня (30,0+0,5;р < 0,05). Начиная с трех суток Ро2 при лазерном облучении в соответствующие сроки было достоверно выше, чем без лечения. Наиболее отчетливая разница между группами наблюдалась с 7-х по 14-е сутки С < 0,05).
Бактериологические исследования. Через 3 сут после лазерного облучения ран микробная обсемененность их снижалась и в процессе последующего лечения в соответствующие сроки исследования была значительно ниже, чем в ранах контрольных животных. Изучение качественного состава микрофлоры, выделенной из облучавшихся ран на 7-е и 14-е сутки, свидетельствовало о снижении числа колоний золотистого стафилококка в три раза, аЯ-гемолитического стрептококка в два раза. Микробные ассоциации к 14 сут встречались только в 20% случаев (в 2 раза реже, чем в контрольной группе).
Цитологические исследования. После лазерного облучения уже через 3 сут в мазках-отпечатках наблюдалось большое количество полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов с высокой активностью. Отмечено большое количество микробов и разрушенных клеток, подвергавшихся фагоцитозу. На 7-е сутки нейтрофильная инфильтрация уменьшалась, процессы фагоцитоза активизировались, появилось значительное количество мононуклеаров, клеток фибробластического ряда (профибробласты). На 14е сутки отмечено существенное снижение микробной обсемененности, местами сохранялось фагоцитирование раневого детрита, появилось значительное количество профибробластов, зрелых фибробластов, гистиоцитов; дистрофически измененных клеток было мало. На 21-е сутки микробы и гранулоциты не определялись, встречалось много зрелых фибробластов и фиброцитов. Следовательно, лазерное облучение активизирует процессы фагоцитоза и репарации, снижает микробную обсемененность ран.
Гистологические, гистохимические и электронно-микроскопические исследования. После одного-двух облучений ран лучамилазера в тканях, формирующих стенку раневого канала, отсутствовал или был слабо выражен геморрагический компонент воспалительной реакции, характерный для животных контрольной группы. В серозно- фибринозном экссудате преобладали нейтрофильные гранулоциты с высокой активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) и немногочисленныелимфоциты. В это же время выявлялись признаки формирования демаркационного лейкоцитарного вала, а в рыхлой соединительной ткани эндомизия выражены более, чем в контроле, гиперплазия и гипертрофия периадвентициальных клеток и эндотелиоцитов, что сопровождалось усилением активности в них ЩФ. В глубине раны увеличивалось количество клеток фиб- робластического ряда с вакуолизированной базофильной цитоплазмой и положительной реакцией на ЩФ, а также клеток моноцитарно-макрофагального ряда с довольно высоким содержанием кислой фосфатазы (КФ) в цитоплазме.
В последующие 3 сут после лазерного облучения в зоне травматического отека нарастала инфильтрация тканей раны нейтрофильными гранулоцитами, часто с гипер- сегментированными ядрами или ядрами в состоянии распада. Одновременно формировался четкий демаркационный лейкоцитарный вал, под который со стороны кожи начинал подрастать пласт эпителия. В отличие от контрольной группы у кроликов, леченных лазером, в
периферических
пов. Наряду с юными фиброблостями с обычной ультраструктурной организацией (узкие цистерны гранулярного р„. 1. Макрофаг в
тканях огнестрельной раны; эндоплазматического ретикулума, сла-3-и сутки облучения лазером; ув. х 10 000: бо развитые пластинчатые комплексы, я - ядро макрофага; Фл - фаголизосома; ШЕР - крупное ядро), имелись фибробласты с шероховатый
дпдоплазматический ретикулум
цитологическими признаками дистрофии и некроза (в цитоплазме многочисленные крупные электроннопрозрачные гранулы, вакуолизированные крупные митохондрии, отсутствие целостности плазмалеммы и признаки выхода гранул в межклеточное пространство).
11а 5-е сутки поверхность огнестрельной раны кроликов после лазерного облучения покрывалась узким лейкоцитарнонекротическим слоем, под которым был виден широкий пласт грануляционной ткани. В центральной части раны она представлена хаотично расположенными фибробластами, новообразованными кровеносными сосудами, нейтрофильнымилейкоцитамис высокой активностью ЩФ (рис. 2) и аморфным межклеточным веществом. В периферических отделах раны грануляционная ткань становилась более оформленной, в ее глубоких слоях на границе со скелетными мышечными волокнами обнаруживался узкий слой горизонтально расположенных фибробластов (рис. 3) с высоким уровнем содержания ЩФ и КФ. Среди клеток грануляционной ткани были видны конгломераты некротизированных мышечных волокон. Однако после лечения участки некроза были окружены многочисленными макрофагами с резко положительной реакцией на КФ. Кроме того, наблюдались четкие признаки регенерации мышечных волокон в виде миотуб, миобластов и миосимпластов. При электронно-микроскопическом исследовании наряду с юными фибробластами иногда встречались клетки с признаками дистрофии.
Спустя 7 сут в тканях огнестрельной раны леченых кроликов интенсивнее были выражены признаки регенераторно-репаративных процессов. Эпидермальный регенерат покрывал значительную площадь поверхности раны. Под новообразованным эпителием располагалась оформленная грануляционная ткань (рис. 4). В стенках некоторых кровеносных капилляров обнаружена резко
положительная реакция на ЩФ, в цитоплазме фибробластов этого фермента содержалось немного. Под узким лейкоцитарно-некротическим слоем, покрывающим поверхность раны, и вокруг некротизированных мышечных волокон локализовались немногочисленные макрофаги с высокой активностью КФ. Здесь же при электронномикроскопическом исследовании выявлялись микробные колонии (рис. 5). Высокая активность КФ выявлялась также в цитоплазме большинства фибробластов грануляционной ткани. Выявлена неодинаковая ультраструктурная организация макрофагов и фибробластов. Обнаружены ультра-структурные признаки как высокой, так и низкой их функциональной активности. Функционально активные макрофаги имели многочисленные цитоплазматические отростки(псев
Рис. 2. Высокая активность щелочной фосфатазы в нейтрофнльных лейкоцитах в разрушенных тканях огнестрельной раны; 5-е сутки облучения лазером; методика но Берстону на щелочную фосфатазу; об. 100; ок. 10
Рис. 3. Активные фибробласты (АФ) с хорошо развитой цитоплазматической сетью (ШЕР);
5-е сутки облучения лазером; ув. х 3300: в межклеточном веществе находятся скопления элементарных коллагеновых фибрилл; Я — ядро фибробласта; КВ — коллагеновые волокна
доподии) и инвагинации цитоплазмы, с помощью которых осуществлялись захват и резорбция клеточного детрита, фибрина, эритроцитов и распавшихся коллагеновых волокон (рис. 6). В цитоплазме этих клеток располагались многочисленные фагоцитарные вакуоли, четко отграниченные мембраной и содержащие остатки фагоцитированного материала. Малоактивные макрофаги имели небольшое количество псевдоподий и фагоцитированных вакуолей. В фибробластах, как правило, была хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть с узкими цистернами. В их цитоплазме также имелись единичные округлой формы гранулы слабой электронной плотности и митохондрии.
Через 9 сут у животных опытной группы значительная часть поверхности огнестрельной раны была покрыта лейкоцитарнонекротическим слоем, в который со стороны неповрежденной кожи врастал утолщенный пласт эпителия с признаками гиперкератоза. В тканях, формирующих стенки раневого канала, в этот период сохранялась инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами (рис. 7). В фибробластах и в стенках вертикально идущих кровеносных сосудов грануляционной ткани (рис. 8) отмечался более высокий уровень содержания ЩФ, а в фибробластах и макрофагах - КФ. При электронно-микроскопическом исследовании грануляционной ткани были выявлены два типа фибробластов. Один — клетки удлиненной формы, функционально более активные. Ядро с крупным ядрышком, в цитоплазме много умеренно расширенных цистерн гранулярной эндоплазматической сети, заполненных мелкозернистым содержимым. Митохондрии овальной формы, со светлым матриксом. В фибробластах другого типа преобладали узкие, слабо развитые цистерны гранулярной эндоплазматической сети. Немногочисленные митохондрии небольших размеров имели плотный матрикс, в цитоплазме выявлялись гранулы липидов, отдельные лизосомы, гранулы высокой электронной плотности и вакуоли с миелиноподобными структурами и обрывками мембран. В межклеточном пространстве определялись скопления про- тофибрилл, коллагеновых волокон.
Через две недели после первичной хирургической обработки у животных обеих группах поверхность раны была покрыта струпом, под который подрастал эпидермальный регенерат. Свободный его край был утолщен, эпителиальные клетки диссоциированы, межклеточные промежутки расширены и инфильтрированы лейкоцитами, мно-
Рис. 1. Формирование грануляционной ткани с множеством новообразованных сосудов; 7-е сутки облучения лазером; окраска гематок-Х2Х2
Рис. 5. Колонии микробов (КМ), распадающиеся гранулоциты (Тр) и эритроцит (Эр) в лейкоцитарно-некротическом слое; активный гранулоцит (2Гр); 7-е сутки X
Рис. 6. Фагоцитоз гранулоцитом (Гр) клеточного детрита (Д); 3-и сутки X Я — ядро грапулоцита; Фл — фаголизосома; Лз — лизосома
Рис. 7. Инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами тканей огнестрельной раны; 9-е сутки облучения лазером; методика ио
гие эпителиальные клетки имели признак деструкции. Несколько в стороне от края! эпидермального регенерата эпителий был| утолщен, образовывал глубокие воспалительные| разрастания в подлежащие ткани (рис. 9). По, струпом, состоящим из распавшихся лейкоцитов располагался узкий лейкоцитарно-
некротический СЛОЙ, который глубже ПереХОДИЛ| в мощный пласт грануляционной ткани. О: содержал много вертикально идущих! кровеносных сосудов, фибробластов.1
Поверхностная часть этого слоя диффузно! инфильтрирована нейтро- фильными^
лейкоцитами, в глубине видны
немногочисленные микроабсцессы.
В большинстве клеточных элементов и^ структур грануляционной ткани (нейтро- филы. фибробласты, эндотелий стенки кровеносных:' ^ сосудов) обнаружена высокая активность ЩФ.' особенно в поверхностных
неэпителизированных ее участках. В более глубоких слоях раны активность фермента снижалась, но оставалась достаточно высокой в фибробластах и лейкоцитах. Фибробласты поверхностных слоев раны содержали в цитоплазме довольно много КФ, в то время как в глубине раны в этих клетках активность фермента снижалась, а в клетках макрофагального ряда повышалась.
Спустя три недели почти вся поверхность огнестрельной раны подопытных животных, в отличие от контрольных, была покрыта!
утолщенным эпителиальным пластом, дающим погружные разрастания в подлежащие ткани.1 Под эпидермальным регенератом располагалась молодая соединительная ткань с высоким
уровнем содержания ЩФ. Основную массу ткани составляли тонкие извитые пучки коллагеновых! волокон и фибробласты, среди которых
преобладали зрелые формы, дающие поло-, жительную реакцию на ЩФ. Реакция на КФ в. них была слабо выражена. Среди этих структур' были видны многочисленные тонкостенные кровеносные сосуды, эндотелий которых также имел положительную реакцию на ЩФ и КФ.
Рис. 8. Вертикально ориентированные сосуды (инъекция смесью туши и желатина) грануляционной ткани; 9-е сутки облучения лазером; окраска гематоксилин-никрофуксином; о6.х20; окхЮ
Рис. 9. Разрастание эпителиальных клеток в глубине раны вокруг воспалительного инфильтрата; 11-е сутки облучения лазером; х
ок.х 10
B отличие от контрольной группы, в которой к 28 сут у подавляющего большинства животных поверхность огнестрельной раны оставалась частично эпителизирован- ной, у кроликов после лазерного облучения к этому сроку раны полностью покрывались эпителием. Новообразованный пласт эпителия был незначительно утолщен и образовывал неглубокие выросты в подлежащие ткани. Под эпителием располагался мощный слой грануляционной ткани, в котором не было придатков кожи. По сравнению с тканью контрольных животных в ней значительно сильнее были развиты слой горизонтально расположенных фибробластов и фиброзный слой, содержащий многочисленные пучки утолщенных коллагеновых волокон. Единичные нейтрофильные лейкоциты с высокой активностью ЩФ в цитоплазме выявлялись преимущественно в поверхностных участках грануляционной ткани и вокруг остатков некротизированных тканей. B подавляющем большинстве фибробластов грануляционной ткани обнаружена слабо положительная реакция на ЩФ и КФ. Высокая активность ЩФ отмечалась лишь в области погружных разрастаний эпителия, а КФ — в единичных макрофагах и в гигантских клетках гранулем инородных тел, выявляемых в глубоких слоях раны.
При электронномикроскопическом исследовании грануляционной ткани леченых животных выявлялись преимущественно зрелые фибробласты. Они характеризовались крупными овальными ядрами с множественными инвагинациями. B ядрах четко определялись одно-два ядрышка. Цитоплазма содержала ориентированные вдоль оси клеток параллельные ряды узких цистерн гранулярной эндоплазматической сети. B межклеточном пространстве располагалось большое количество новообразованных коллагеновых фибрилл. Наряду с подобными клетками выявлялись также фибробласты, в цитоплазме которых обнаруживались гранулы слабой электронной плотности и гомогенезированные митохондрии. B единичных макрофагах отмечались ультраструктурные признаки высокой функциональной активности.
Таким образом, из результатов гистологического, гистохимического и электрон- номикроскопического изучения динамики заживления огнестрельных ран следует, что под влиянием лучей лазера уменьшается длительность воспалительной реакции и связанная с ней частота инфекционных осложнений, раньше появляются начальные признаки пролиферации клеток. B дальнейшем отмечалось ускорение дифференцировки фибробластов и усиление их коллагенсинтезирующей активности, нарастало число функционально активных макрофагов с высоким уровнем содержания в цитоплазме КФ. C данными явлениями коррелирует повышение уровняРо2 в тканях раны, высокое содержание ЩФ и КФ в цитоплазме клеток грануляционной ткани. Bce описанные явления приводили к более раннему созреванию грануляционнойткани и ускоренной эпители- зации раневой поверхности (на 5-7-е сут).
Summary
Kosache v I.D., Varzin SA. Application of laser irradiation for stimulation of gun wound reparation process.
We carried out a study of action of helium-neon laser irradiation on the course of the wound process. For this purpose we used helium-neon optic quantum generator with the emission wavelength of 0.6328 м The eytologieal and microbiological study has shown that the laser irradiation activates processes of phagocytosis and reparation and reduces microbial insemination of wounds. The histological, histochemieal, and electron microscopic studies of the dynamics of gun wound healing have shown that under effect of laser irradiation, duration of the inflammatory reaction and the associated incidence of infectious complications were reduced; the initial signs of cell proliferation appeared sooner. Further, acceleration of differentiation of fibroblasts and an increase of their collagen-synthetic, activity were noticed.
Keywords', helium-neon laser, gun wound, regeneration.
Литература
1. Шортанбаев А.Л. Влияние низкоэнергетического лазерного излучения на окислительно-восстановительный потенциал и кислородный баланс ткани при экспериментальном воспалении: Автореф. дис.... канд. мед. наук. Алма-Ата, 1977. 21 с.
2. Богданович У.Я., КаримовМ.Г., Краснощекова Е.Б. Лазеры в травматологии и ортопедии. Казань, 1978.104 с.
3. Гейниц A.B., Вайнштейн КЛ. Генетические обоснования лазерной терапии (обзор литературы) // Лазер, мед. 2004. T.8. №1-2. С.57-59.
4. Гейниц A.B., Цыганова Г.И. Аналитический обзор научно-исследовательс,- ких работ, выполненных в 2003 году в учреждениях здравоохранения Российской Федерации по проблемам лазерной медицины // Там же. 2004. Т. 8. № 4. С. 49-56.
5. CinterH., Harb H., Horab N., Kyrtle P. Anwendung der Laserstralen in der Chirurgie // Zentr. Bl. Chir. 1979. Bd 104. H. 1. S. 23-29.
6. ПетровВ.П., Романенко Ф.Г. Применение лучей лазера в клинической хирургии // Воен.-мед. журн. 1981. № 12. С. 56-57.
7. Шимко B.B., Новолодский В.И., Симонова О.П. и др. Применение лазерного излучения в лечении гнойных ран и трофических язв венозной этиологии // Лазер, мед. 2004. Т. 8. Вып. 3. С. 55.
8. Шурыгина Е.П. Обоснование показаний к различным методам применения лазерного излучения в комплексном лечении острой гнойной хирургической инфекции мягких тканей // Там же. 2005. Т.
9. Вып. 3. С. 18-23. 9. ХромовБ.М. Лазерная терапия заболеваний и повреждений // Врачеб. дело. 1978. № 10. С. 115-119.
10. Хромов Б.М., Антонов A.M., Белый И.П. и др. Лазерная терапия хирургических заболеваний // Вестн. хирург. 1979. Т. 122. № 2. С. 31-36.
11. Дуванский B.A., Елисеенко В.И. Фотодинамическая терапия и воздушно-плазменные потоки в комплексном лечении больных с осложненными формами рожи // Лазер, мед. 2004. Т. 8. № 1-2. С. 54-56.
12. Ахмедов Б.А., Amaee A.P., Толстых М.П., Белов И.Н. Антиоксиданты и лазерное излучение в комплексном лечении огнестрельных ранений мягких тканей, огнестрельных переломов и их инфекционных осложнений // Там же. 2004. Т. 8. Вып. 3. С. 7-8.
Статья поступила в редакцию 13 июля 2006 г.
