CC BY
3
оптимизация протокола децеллюляризации соединительнотканных матриксов ксеногенного происхождения для лечения сердечно-сосудистых заболеваний
Е.В. Чепелева1, М.Б. Васильева2, Е.В. Кузнецова1, Д.С. Сергеевичев1
1 ФГБУ НМИЦ им. академика Е.Н. Мешалкина МЗ РФ, Новосибирск, Россия
2 ФГАОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
e-mail: e_chepeleva@meshalkin.ru
Ключевые слова: тканевая инженерия, ксенографт, децел-люляризация, цитотоксичность, соединительнотканный каркас, сердечно-сосудистая хирургия.
Дефицит донорских аллографтов для замещения пораженных клапанов сердца и кровеносных сосудов малого диаметра порождает необходимость разработки и создания тканеинженерных протезов на основе соединительнотканных матриксов животного происхождения [1]. Децеллюляризированные биологические матриксы обеспечивают механическую анизотропию и повторяют строение стенки нативных клапанов, могут замещать соединительнотканный каркас пораженных тканей и способствовать их рецеллюляризации клетками реципиента в дальнейшем [2]. Оптимизация методов де-целлюляризации направлена на сохранение биомеханических свойств тканей, снижение остаточных количеств донорского клеточного материала и компонентов децел-люляризирующих растворов.
В качестве экспериментального материала использовали фрагменты дуги аорты и легочного ствола свиней породы Ландрас. Для децеллюляризации использовали растворы из комбинации дезоксихолата натрия и доде-цилсульфата натрия в соотношениях 0,5% / 0,5% и 0,5% / 0,1% соответственно, а также раствор из смеси 0,1% дезоксихолата натрия и 1% Тритона Х100. Отмывку производили в стерильном фосфатном буферном растворе (pH=7,4). Прочностные характеристики материала оценивали при одноосном растяжении в продольном и поперечном направлениях, структуру соединительнотканного матрикса оценивали с помощью стандартных гистологических и иммуноцитохимических исследований. Исследование цитотоксичности материала для определения оптимальной продолжительности отмывки было проведено при сокультивировании образцов с фибро-бластами линии L-929 и последующим ХТТ-тестом.
Установлено, что наиболее эффективным составом для удаления клеточных элементов из стенки аорты или легочного ствола свиней с высоким уровнем сохранения структуры и механических свойств матрикса является раствор из 0,5% додецилсульфата и 0,5% дезоксихолата натрия. Для децеллюляризации стенки легочного ствола также может использоваться раствор из 1 % Тритона Х100 и 0,1% дезоксихолата натрия. Для полного удаления клеточного материала из стенки аорты свиньи требуется 24 часа, для легочного ствола — 16 часов. Исследование остаточной токсичности материалов in vitro показало, что число циклов отмывок после децеллюляризации должно быть не менее 8, длительностью не менее 12 часов каждый. Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России № 121031300224-1.
Литература:
1. Horke A., Tudorache I., Laufer G. et al. Eur. J. Cardiothorac Surg. 2020. V. 58. № . 5. P. 1045-1053.
2. VeDepo M.C., Detamore M.S., Hopkins R.A., Converse G.L. J. Tissue Eng. 2017. V. 8. Art. № 2041731417726327.
анализ активации ключевых сигнальных каскадов, регулирующих морфо-генетический потенциал дермальных клеток в коллагеновом геле
Э^. Чермных1, Е.П. Калабушева1, Е.В. Алпеева1, С.П. Домогатский2, 3, Е.О. Осидак2, Е.А. Воротеляк1
1 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, Москва, Россия
2 ООО фирмы «ИМТЕК», Москва, Россия
3 НМИЦ Кардиологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: elinachermnykh@mail.ru
Ключевые слова: эквивалент кожи, дермальные фибробла-сты, клетки дермальной папиллы, коллагеновый гель.
Активация ключевых сигнальных каскадов, регулирующих морфогенетический потенциал клеток дермальной папиллы (ДП) и дермальных фибробластов (Фб), была проанализирована на модели дермального эквивалента кожи. Для исследования состояния каждого сигнального пути (BMP, Wnt, TGF-p) коллагеновые гидрогели плотностью 5 мг/мл, содержащие клетки ДП или Фб, обрабатывали специализированными ингибиторами или активаторами данных каскадов (Bmp4, CHIR 99021, LDN-193189, Y-27632, SB-431542, SU6656).
При исследовании морфологии клеток и их отростков было обнаружено, что ингибирование каскадов TGF-p/ BMP (LDN-193189) и активация Wnt-пути (CHIR 99021) препятствуют распластыванию клеток и формированию их отростков. Культивирование клеток с добавлением Rock-ингибитора (Y-27632), наоборот, усиливало рас-пластанность клеток. Остальные вещества не оказывали значительного влияния, по сравнению с контролем. При помощи иммуногистохимического исследования была исследована экспрессия MKL1, NF-kB и SMAD4. Была выявлена повышенная экспрессия MKL1, NF-kB и SMAD4 в Фб, что может говорить об их склонности к фибротическим изменениям, к которым эти клетки склонны и в условиях in vivo. Экспрессия MKL1 в клетках ДП была ниже, чем в Фб, что свидетельствует об их меньшей склонности к фиброзу.
Для изучения механизмов наблюдаемых эффектов требуются дальнейшие углубленные исследования. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-29-04060.
стимуляция адипогенеза аутологичными сыворотками в культуре эксплантов жировой ткани кроликов с экспериментальной гиперлипидемией
М.В. Черноруцкий, М.Б. Белякова, Н.В. Костюк, О.В. Волкова, М.Н. Калинкин
ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава РФ, Тверь, Россия
e-mail: michail1911@mail.ru
Ключевые слова: адипогенез, аутологичные сыворотки, культивирование жировых клеток, модель гиперлипидемии.
В данной работе моделировалась гиперлипидемия у кроликов и изучалось изменение адипогенного потенциала их жировой ткани в культуре, с использованием аутологичных гиперлипидных сывороток взрослых животных с целью выявить значимость воздействия системных организменных факторов на адипогенез.
Забор материала производили с соблюдением биоэтических норм. Кроликам делали внутривенные инъекции липидсодержащей эмульсии 21 день по 1 мл/кг, последний забор сыворотки проводили спустя 1,5 месяца после формирования гиперлипидемии. Культивирование экс-плантов проводили в среде ОМБМ с высоким содержанием глюкозы и добавлением аутологичных сывороток кроликов на разных сроках гиперлипидемии. Оценивали миграцию и пролиферацию адипоцитов из эксплантов, а также способность к накоплению липидов под действием инсулина.
Клетки от экспериментального животного при культивировании с аутологичной сывороткой, полученной до гиперлипидемии, отвечали на стимуляцию инсулином ускорением пролиферации клеток и в малой степени — накоплением жировых капель. Если использовалась сыворотка, полученная в ходе эксперимента с этим же животным, накопление липидов становилось быстрым и выраженным.
Клетки интактного кролика пролиферируют сильнее в сравнении с клетками животного, которое уже побывало в эксперименте, однако самая активная пролиферация отмечалась при культивировании с аутологичной сывороткой, собранной спустя 1,5 месяца от формирования экспериментальной гиперлипидемии. В данном эксперименте отмечались самый плотный застил клеток с потерей контактного торможения и наибольшее количество делящихся клеток.
Гиперлипидемическая модель животного в данной работе показала, что ответ жировой ткани меняется не только в ходе гиперлипидемии, но и сохраняется после нормализации транспорта липидов в такой клеточной популяции. Также и плазма крови, нормальная по содержанию липидов, сохраняет системные факторы адипоге-неза и остается способной стимулировать его в клетках нормальной ткани в культуральных условиях.
гиперэкспресиия bcl-2k17d при помощи aav-вектора снижает число амилоидных бляшек в мозге 5fad мышей с болезнью альцгеймера
Д.П. Чернюк1, М.И. Полозова1, Е.И. Пчицкая1, Г. Балтынк2, И.Б. Безпрозванный1, 3
1 Лаборатория молекулярной нейродегенерации, Санкт-Петербургский политехнический Университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Лаборатория молекулярной и клеточной сигнализации, КУ Левена, Левен, Бельгия
3 Отделение физиологии, Юго-Западный медицинский центр штата Юта, Даллас, США
e-mail: dashachernuk@gmail.com
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, аденоассоции-рованные вирусы, Bcl-2, кальциевый сигналинг, IP3R, RyR, 5FAD, амилоидные бляшки.
Одно из самых распространенных нейродегенератив-ных заболеваний — болезнь Альцгеймера (БА), является самой частой причиной развития деменции. По одной из гипотез патогенеза БА причиной заболевания может
служить продуцируемый в нейронах токсичный бета-амилоид. По другой гипотезе к гибели нейронов приводит неправильная регуляция ионов кальция [1]. Нейроны очень чувствительны к внутриклеточному Ca2+ гомеостазу, поэтому даже самые малые аномалии в Са2+ сигнализации могут привести к разрушительным последствия в течение длительного периода времени.
Последние исследования показали, что экспрессия белков семейства Bcl-2 ингибирует активность IP3R1 [2] и RyR2 [3], которые являются основными каналами выхода Ca2+ из эндоплазматического ретикулума (ЭР) во внутриклеточное пространство. Таким образом, мы предположили, что гиперэкспрессия белков Bcl-2 может оказать положительный эффект на дисрегуляцию Ca2+ гомеоста-за при патологии БА. Чтобы проверить данную теорию in vivo мы использовали аденоассоциированные вирусы для экспрессии белков Bcl-2 в СА1 область гиппокампа 5FAD мышиной модели БА на ранних стадиях развития болезни. Для того, чтобы оценить важность специфичной ассоциации с IP3R1 или RyR2, экспрессировалась также и мутантная форма Bcl-2K17D. Мы произвели проверку взаимодействия белков Bcl-2 и Bcl-2K17D с IP3R1 и RyR2 в гиппокампе 5FAD мышей при помощи метода ко-иммунопреципитации. Результаты подтвердили, что белок Bcl-2 взаимодействует с IP3R1 и RyR2, а Bcl-2K17D связывается только с RyR2. Далее был проанализирован эффект двух форм Bcl-2 на число амилоидных бляшек в мозге 5FAD мышей. Данные показали, что гиперэкспрессия белка Bcl-2 не снижает числа амилоидных бляшек в мозге 5FAD мышей, в то время как Bcl-2K17D значительно сокращает число бляшек.
Резюмируя, мы можем сделать предположение, что на 5FAD мышиной модели БА ингибирование только RyR2-зависимого кальциевого выхода из ЭР приводит к большему терапевтическому эффекту, нежели блокировка и RyR2, и IP3R1 каналов. Обнаруженные нами особенности сигнального Ca2+ пути в нейронах при патологии БА являются перспективной мишенью для дальнейшего поиска терапии БА. Поддержано РНФ № 20-45-01004
Литература:
1. Bezprozvanny, I. (2009). Trends Mol Med 15(3): 89-100.
2. Rong, Y. P., et al. (2008). Mol Cell 31(2): 255-265.
3. Vervliet, T., et al. (2014). J Cell Sci 127(Pt 12): 2782-2792.
изучение морфологических изменений церебральных органоидов человека при оверэкспрессии белка contactin 6
С.А. Чечеткина1, А.М. Юнусова2, И.Е. Пристяжнюк2, Т.А. Шнайдер2
1 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
2 ФИЦ ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, Россия
e-mail: s.tschetschetkina@gmail.com
Ключевые слова: умственная отсталость, церебральные органоиды человека, Contactin 6.
Развитие головного мозга человека представляет собой последовательный многоэтапный процесс, в котором любые отклонения могут приводить к расстройству интеллектуальных функций. Нарушения нейрогенеза представляют разнородную группу заболеваний. Одной из встречающихся патологий является умственная отсталость, ассоциированная с мутациями в гене CNTN6 [1]. У млекопитающих
