CC BY
36
М. И. Богачев, Е. О. Михайлова, А. Р. Каюмов
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ-СУБСТРАТОВ ПРОТЕИНАЗЫ ClpP В КЛЕТКАХ BACILLUS SUBTILIS
Ключевые слова: протеиназа ClpP, множественное выравнивание, статистический анализ.
Одним из механизмов ответа бактериальной клетки на стресс является перестройка метаболизма путем инактивации одних и активации других белков. Ненужные, а также поврежденные белки удаляются путем протеолиза. В клетках бацилл данную функцию выполняют ряд ферментов, АТФ-зависимых протеиназ: LonA, FtsH, а также протеиназы семейства ClpP. В настоящее время не идентифицирована аминокислотная последовательность для распознавания протеиназой ClpP и последующего протеолиза белка. В данной работы предпринята попытка определения возможного сайта распознавания протеиназой ClpP на основании экспериментальных данных, установленных ранее. Методом множественного выравнивания
идентифицирован возможный сайт распознавания протеиназой ClpP.
Keywords: proteinase ClpP, multiple alignment, statistical analysis.
One of the mechanisms of bacterial cell response to the stress is the metabolism reconstitution by proteins activation and inactivation. Damaged and non-required proteins are removed by the proteolysis. In Bacilli, this role belongs to ATP-dependent proteases LonA, FtsH, as well as the ClpP family proteases. The amino acid sequence recognized by ClpP protease and following protein protolysis remains unknown. Here we tried to identify the putative ClpP recognition site using the experimental data reported previously. By the multiple alignment approach we identified the putative ClpP recognition site.
Введение
В естественной среде обитания бактерии постоянно подвергаются различным стрессам -температурному, холодовому, голоданию по макро и микроэлементам. Ответом клетки на изменение внешних условий в негативную сторону является перестройка метаболизма, заключающаяся в инактивации одних и активации других генов. Ненужные в новых условиях существования белки, а также белки с нарушенной структурой и функцией удаляются путем протеолиза [1; 2]. В клетках бацилл данную функцию выполняют ряд ферментов, АТФ-зависимых протеиназ: ЬопЛ [3], ЬопБ [4], БібН [5], и НбШУ (также называемая С1рУР; 6), а также протеиназы семейства С1р, которые играют ведущую роль во внутриклеточной протеолитической системе клетки, а также в патогенезе болезнетворных бактерий [7; 8; 9].
Протеиназа С1рР в клетках бактерий находится в олигомерном комплексе с АТФазами СірЛ, С1рЕ или С1рХ, и осуществляет направленный протеолиз регуляторных и дефектных белков. Протеиназа С1рР из E.coli распознает субстрат для расщепления по правилу Оконца. Этот механизм маркирования субстрата для протеолиза высоко консервативен и основан на специфичном распознавании олигопептидной последовательности из определенных аминокислот [10]. У многих бактерий, например, таким сигналом является последовательность гидрофобных ароматических аминокислот (тирозин, триптофан, фенилаланин и лейцин) [11]. Необходимо отметить, что белки, содержащие маркер ^концевого правила, как правило, не образуются при нормально протекающих процессах трансляции и М-концевого процессинга, а возникают в результате расщепления эндопротеиназами [12]. В настоящее время в ряде работ были экспериментально установлены
белковые субстраты, распознаваемые протеиназой CplP и ее АТФазами ClpC и ClpX [1]. Тем не менее, остается неидентифицированной аминокислотная последовательность, являющаяся маркерной для распознавания протеолитическим комплексом и последующего протеолиза белка. В данной работе предпринята попытка определения возможного сайта распознавания протеиназой ClpP на основании экспериментальных данных, установленных ранее.
Результаты и обсуждение
Выборки аминокислотных
последовательностей белков, подверженных деградации протеиназой ClpP составляли на основании данных [1]. Список белков представлен в таблице 1. В таблице жирным выделены белки, для которых факт расщепления протеиназой ClpP был ранее подтвержден экспериментально in vitro.
Таблица 1 - Субстраты для распознавания АТФазой ClpC
Субстраты для распознавания АТФазой ClpC_________
ComK, SpoIIAB, CtsR, MurAA, GlmS, AroAl, CarB, IlvA, IlvB, GltA, LeuC, LeuD, LysC, NrdEN, PurF, PurL, PurQ, PyrB, BioB, ThiC, ThiDC, YjbV, ThrZ, Ctc, MtnK(YkrT), MtnS(YkrS)______________________
Мы предположили, что все субстраты протеиназы С1рР должны обладать единой гомологичной областью, являющейся консенсусной для распознавания. Для ее поиска и идентификации использовался алгоритм локального
множественного выравнивания, представляющий собой модификацию подхода Smith-Waterman [8]. На первом этапе провели выравнивание аминокислотных последовательностей белков СотК, 8ро11АВ, ОлК, МигАА, достоверно распознаваемых АТФазой С1рС, и обнаружили
участки гомологии на Оконце белков (рис. 1), а также в центральной их области (рис. 2).
_ J
CONSENSUS D M H L E N Y E V S - N - S
О г---
ComK d a p 1 e s У e V n g a t і
SpoIIAB Й m h 1 e f s 3 1 S q n e S
CtsR s d і і e q »
MurAA Id V h f e n n * V t V n a s
Рис. 1 - Гомологичный участок белков ComK, SpoПAB, CtsR, MurAA, достоверно распознаваемых АТФазой ClpC, расположенный на Оконце белка
Рис. 2 - Гомологичный участок белков ComK, SpoПAB, CtsR, MurAA, достоверно
распознаваемых АТФазой ClpC, расположенный в центральной области белка
Как видно, у данных четырех белков отсутствует выраженный гомологичный участок, однако идентифицируется область из гидрофобных аминокислот в участках гомологии. Оба участка содержат гидрофобные аминокислоты лейцин (Ъ), изолейцин (I) и валин (V). В ранних работах было показано, что с активным центром С1рР протеаз связываются дипептиды LV (лейцин-валин) и БЯ (фенилаланин-аргинин) [14; 15]. Учитывая высокую гомологию С1рР протеаз бактерий, найденный участок гомологии, содержащий дипептид
изолейцин и валин, может являться сайтом распознавания (Рис. 1 б).
Затем было проведено множественное выравнивание этих четырех белков с остальными потенциальными субстратами для распознавания АТФазой С1рС [1]. Множественное выравнивание не позволило установить единый участок гомологии у всех белков. Поэтому мы использовали разработанный нами ранее алгоритм предварительного отбора белковых
последовательностей для множественного
выравнивания в условиях априорной неопределенности на основе теории графов (Рис. 3) [16]. Результаты показали, что при анализе 63% объема выборки удается идентифицировать участок гомологии, присутствующий во всех анализируемых
белках (рисунок 2), включающий гидрофобные аминокислоты валин (V), лейцин (Ъ) и изолейцин (I), и совпадающий с ранее идентифицированным сайтом 3 (рис. 1 б).
CONSENSUS
К К Т I
Spoil л в
CtsR
Mu.AA
GlmS
CarB
IluB
GltA
NrdEN
Ри.Г
PuiL
Тії і С
Тії ■ ПС
YjbV
■
SRAMENVV I
К К G
300
. T , „ —n —і і
*
D ::
F Q F E
.TP! k e k .
F F |V
б
Рис. 3 - Гомологичный участок белков,
составляющих 63% выборки. Аминокислота, являющаяся возможным сайтом распознавания АТФазой ClpC, выделена красным (а). Гидрофобные аминокислоты, вероятно участвующие во взаимодействии с АТФазой ClpC выделены желтым (б)
Таким образом, метод множественного выравнивания позволил идентифицировать вероятный участок для распознавания протеиназой. Нам удалось обнаружить гомологичный участок, присутствующих во всех исследуемых белках, содержащий гидрофобные аминокислоты, необходимые для распознавания [15]. Принимая во внимание факт распознавания протеиназой С1рР не конкретной последовательности, а трехмерной пространственной структуры [17], можно предположить, что обнаруженная гомологичная область может являться сайтом узнавания для дальнейшего протеолиза.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП ".Научные и научно-педагогические кадры инновационной России", номер
государственного соглашения 14.A18.21.0185.
Литература
1. U. Gerth, H. Kock, I. Kusters, S. Michalik, R. L. Switzer, M. Hecker, J. of bacteriology, 190, 1, 321-331 (2008).
2. A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer, Microbiology, 154, 2348-2355 (2008).
3. S. Riethdorf, U. Volker, U. Gerth, A. Winkler, S. Engelmann, M. Hecker, J. Bacteriol., 176, 6518-6527 (1994).
4. M. Serrano, S. Hovel, C. Moran, A. Henriques, U. Volker, J. Bacteriol., 183, 2995-3003, (2001).
5. S. Zellmeier, U. Zuber, W. Schumann, T. Wiegert, J. Bacteriol., 185, 973-982 (2003).
6. M. Kang, B. Lim, I. Seong, J. Seol, N. Tanahashi, K. Tanaka, C. Chung, EMBO J., 20, 734-742 (2001).
7. U. Gerth, E. Kruger, I. Derre, T. Msadek, M. Hecker,. Mol. Microbiol, 28, 787-802 (1998).
8. K. Turgay, J. Hahn, J. Burghoorn, D. Dubnau, EMBO J., 17, 6730-6738 (1998).
9. А. Р. Каюмов, М. И. Богачев, Е. О. Михайлова, Вестник Казанского технологического университета, 7, С. 175-180 (2011)
10. A. Bachmair, D. Finley, A. Varshavsky, Science, 234, 179-186 (1986).
11. J.W. Tobias, T.E. Shrader, G. Rocap, A. Varshavsky, Science, 254, 1374-1377 (1991).
12. A. Mogk, R. Schmidt, B. Bukau, Trends Cell Biol, 17, 165-172 (2007).
13. T. F. Smith, M. S. Waterman, J. Mol. Biol,.147, 195-197 (1981).
14. D.Y. Kim, K. K. Kim, J. Mol. Biol, 379, 760-771 (2008).
15. R.L. Ninnis, S.K. Spall, G.H. Talbo, K.N. Truscott, D.A. Dougan, EMBO J., 28, 1732-1744 (2009).
16. М.И. Богачев, А.Р. Каюмов, О.А. Маркелов, Биотехносфера, 5, 7-11 (2011).
17. V.J. Schuenemann, S.M. Kralik, R. Albrecht, S.K. Spall, K.N. Truscott, D.A. Dougan, K. Zeth, EMBO J., 10, 5, 508514 (2009).
© М. И. Богачев - канд. техн. наук, доц. каф. радиосистем С-Петербургского госуд. электротехнического ун-та, rogex@yandex.ru; Е. О. Михайлова - канд. биол. наук, асс. каф. химической кибернетики КНИТУ, katya_o_m@rambler.ru; А. Р. Каюмов - канд. техн. наук, асс. каф. генетики К(П)ФУ, kairatr@yandex.ru.
