CC BY
6
УДК 519.23, 66-96
Демкин К.М., Мочалова М.С., Ловская Д.Д.
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ ПО СВОЙСТВАМ И РАЗМЕРАМ ЧАСТИЦ
Демкин Кирилл Максимович - магистрант 1-го года обучения кафедры химического и фармацевтического инжиниринга; [email protected]
Мочалова Мария Сергеевна - аспирант 2-го года обучения кафедры химического и фармацевтического инжиниринга.
Ловская Дарья Дмитриевна - к. т. н., старший научный сотрудник кафедры химического и фармацевтического инжиниринга.
Описан способ получения микрочастиц геля на основе хитозана масляно-эмульсионным методом. Исследовано влияние параметров получения (концентрации хитозана, концентрации щелочи, концентрации ПАВ, скорости вращения ротора гомогенизатора) микрочастиц на их размер. Получены снимки частиц методом сканирующей электронной микроскопии. Проведен регрессионный анализ влияния параметров процесса получения на медианный диаметр микрочастиц. Выявлено влияние на медианный диаметр микрочастиц всех исследуемых параметров. На основе проведенных экспериментальных исследований и регрессионного анализа сформирован подход, позволяющий получать микрочастицы геля на основе хитозана заданного размера. Ключевые слова: хитозан, масляно-эмульсионный метод, распределение микрочастиц по размерам.
STATISTICAL PROCESSING OF DATA ON PROPERTIES AND PARTICLE SIZES
Demkin K.M., Mochalova M.S., Lovskaya D.D.
"Department of Chemical and Pharmaceutical Engineering", Moscow, Russian Federation
A method for obtaining microparticles of a chitosan-based gel by an oil-emulsion method is described. The influence of the parameters of obtaining (chitosan concentration, alkali concentration, surfactant concentration, speed of rotation of the homogenizer rotor) of microparticles on their size is investigated. Images ofparticles were obtained by scanning electron microscopy. A regression analysis of the effect of the parameters of the production process on the median diameter of microparticles was carried out. The influence of all parameters studied on the median diameter of microparticles was revealed. Based on the conducted experimental studies and regression analysis, an approach has been formed that allows obtaining microparticles of gel based on chitosan of a given size. Keywords: chitosan, oil-emulsion method, microparticle size distribution
Введение
Одна из актуальных задач фармацевтики - поиск способов преодоления гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и доставки АФИ (активного фармацевтического ингредиента) в мозг для лечения таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, от которой страдает около 37 миллионов человек во всем мире [1]. Более 98% низкомолекулярных препаратов и почти 100% высокомолекулярных препаратов не могут попасть в мозг, так как специфическая структура и белки на поверхности ГЭБ ограничивают поступление АФИ в мозг [2]. Интраназальный способ введения лекарственных средств «nose-to-brain» стал альтернативой системной (пероральной и парентеральной) доставке АФИ в мозг. В работе [3] показано, что, попадая в обонятельную полость носа, препарат через нейроны обонятельных рецепторов проникает в головной мозг. Однако размер, применяющихся в качестве матрицы носителя лекарственных средств, должен быть больше 50 мкм, так как частицы меньшего диаметра оседают не в обонятельной области носовой полости, а в трахее и нижних дыхательных путях [4].
Перспективным материалом для получения органических гелей является природный полисахарид хитозан. Хитозан является производным хитина и обладает мукоадгезивными свойствами,
обусловленными электростатическими силами [5]. Это
свойство позволяет матрице-носителю прочно закрепляться на поверхности слизистых оболочек, увеличивая время контакта системы доставки с эпителиальной поверхностью и предотвращая унос частиц мукоцилиарным клиренсом [6]. Кроме этого, хитозан, обладая избыточным положительным зарядом за счет большого количества аминогрупп, проявляет антибактериальную активность, что дополнительно обеззараживает поверхность носовой полости и обеспечивает длительный срок хранения полученных частиц [7-8]. Одним из главных преимуществ хитозана в рамках данного исследования является усиление мембранной абсорбции. Хитозан вызывает обратимые модификации структуры эпителиального барьера и позволяет значительно увеличить абсорбцию АФИ [9].
Получение частиц на основе хитозана состоит из следующих этапов: приготовление раствора хитозана, формирование геля, сушка. Формирование геля может происходить разными методами, среди них: капельный метод, метод вибрирующего сопла, электростатический метод, распыление форсункой и другие [10]. Из них можно выделить масляно-эмульсионный метод, в котором отдельно готовится эмульсия биополимера и эмульсия сшивающего агента, после чего они смешиваются для осуществления этапа гелеобразования. Преимуществом этого метода является высокая производительность и возможность получения частиц заданного размера при варьировании
параметров процесса получения и физико-химических свойств смешиваемых фаз (например, вязкость, поверхностное натяжение др.).
Несмотря на наличие в научно-технической литературе исследований, в которых микрочастицы хитозана получаются масляно-эмульсионным методом, на данный момент отсутствуют работы, в которых проводятся исследования влияния параметров процесса получения на характеристики получаемых микрочастиц. Целью данного исследования является разработка лабораторного метода получения микрочастиц заданного размера с использованием масляно-эмульсионного подхода. Экспериментальная часть План экспериментальных исследований При построении плана эксперимента следующие параметры: концентрация хитозана, концентрация щелочи, концентрация ПАВ и скорость вращения ротора гомогенизатора, были выбраны как ключевые (Таблица 1).
Таблица 5. Параметры процесса получения микрочастиц геля на основе хитозана
№ схит, масс% сщел; М спав, масс% vгомоген, об/мин
О-1 0 3000
О-2 0,1 6000
О-3 1 3000
О-4 6000
О-5 1 0 3000
О-6 1 6000
О-7 1 3000
О-8 6000
О-9 0 3000
0-10 0,1 6000
0-11 1 3000
0-12 2 6000
0-13 0 3000
0-14 1 6000
0-15 1 3000
0-16 6000
Концентрация хитозана напрямую влияет на вязкость раствора и дзетта-потенциал получаемых микрочастиц геля; концентрация щелочи влияет на
скорость гелеобразования хитозана; концентрация ПАВ также влияет на дзетта-потенциал и поверхностное натяжение на границе раздела фаз; скорость вращения ротора гомогенизатора напрямую влияет на эффективность гомогенизации.
Процесс получения микрочастиц на основе хитозана
Процесс получения микрочастиц на основе хитозана состоит из следующих стадий: приготовление раствора хитозана и сшивающего агента, эмульгирование полученных растворов в масле, формирование геля хитозана, отмывка микрочастиц от масла, после чего следует стадия сушки.
Хитозан в заданных концентрациях (1 и 2 масс %) растворяли в 0,1 молярной уксусной кислоте и к полученному раствору добавляли поверхностно-активное вещество Tween-80 (0 и 0,1 масс %) в качестве стабилизатора эмульсии. Далее раствор хитозана вводили в масло и гомогенизировали при помощи гомогенизатора IKA ULTRA-TURRAX T 25 (3000 и 6000 об/мин). Раствор гидроксида натрия (0,1 и 1 М) смешивали с маслом с помощью лопастной мешалки. Объемное соотношение водной и масляной фаз в обоих эмульсиях составило 3:1. Затем, при непрерывном перемешивании проводили объединение эмульсий. Полученную смесь выдерживали 24 часа до завершения процесса гелеобразования. Полученные микрочастицы геля многократно промывали гексаном и водой для удаления масляной фазы. Далее осуществляли сушку полученных частиц в тепловом шкафу при 30 °С.
Аналитические исследования
Для получения распределения микрочастиц геля по размерам и вычисления медианного диаметра проводились экспериментальные исследования на лазерном дифрактометре Analysette 22 Nano Tec. Медианный диаметр определялся с помощью анализа интегральных кривых распределения микрочастиц по размерам.
Для исследования морфологии поверхности полученных после сушки образцов использовался метод сканирующей электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа JEOL 1610LV. Исследования проводились в Центре коллективного пользования РХТУ им. Д.И. Менделеева. Некоторые результаты представлены на рисунке 2.
SEI 1SkV WD12mm SS1S MUCTR
х5,0оо bpm
22131
Рис.2 Снимки сканирующей электронной микроскопии. А -образец О-10 при увеличении 5000раз,
Б - образец О-8 при увеличении 5000 раз
Изображения сканирующей электронной микроскопии показывают, что все образцы имеют гладкую поверхность, обусловленную особенностями процесса образования геля, а также сферическую форму.
В данном исследовании в качестве параметра, характеризующего распределение микрочастиц по размерам, был взят медианный диаметр, который более адекватно характеризует полидисперсные системы чем средний диаметр [11]. Результаты исследований, проведенных методом лазерной дифракции представлены в таблице 2.
Таблица 2. Квантили распределения частиц по размерам различных образцов микрочастиц на
основе хитозана
Образец dl0, мкм d50, мкм d90, мкм
О-1 13,5 45,5 87,5
О-2 10,5 20,9 39,9
О-3 10,4 24,2 88,7
О-4 7,6 16,5 53,6
О-5 20,8 68,7 130,5
О-6 (1) 10,6 36,4 84,5
О-6 (2) 11,5 47,8 96,6
О-6 (3) 12,1 42,8 87,1
О-7 12,5 53,9 106,7
О-8 9,5 32,6 87,4
О-9 7,9 23,5 59,7
0-10 10,1 42,1 88,3
0-11 10,0 27,1 77,9
0-12 12,5 53,1 102,9
0-13 10,8 41,5 85,8
0-14 15,9 57,1 104,4
0-15 21,4 72,2 133,1
0-16 22,3 69,7 130,3
Только шесть образцов обладают медианным диаметром d5o больше 50 мкм, следовательно, при интраназальном введении данных частиц их осаждение будет происходить в носовой полости. Таким образом данные образцы являются наиболее перспективными для доставки АФИ по механизму «Ко8е-То-Вгат».
Регрессионный анализ
Для оценки влияния параметров процесса получения микрочастиц на их медианный диаметр проводился многофакторный регрессионный анализ с дополнительной серией экспериментов (серия из трех опытов для образца О-6). Методика регрессионного анализа подробно изложена в работе [12].
Было получено регрессионное уравнение (1), описывающее влияние параметров процесса на медианный диаметр микрочастиц.
у = 43.17 + 5.12х1 + 11.55х2 + 6.74х1х3 + 8.62х1х4
(1)
где безразмерные переменные: у - расчетный медианный диаметр микрочастиц, х1 -концентрация хитозана, х2 — концентрация щелочи,
х3 — концентрация ПАВ, х4 — скорость гомогенизатора.
Дисперсия воспроизводимости серии опытов составила Sвоспр2 = 32,96, а дисперсия адекватности равнялась Sад2 = 127,98. Проверка полученного уравнения с помощью критерия Фишера показала, что уравнение регрессии адекватно описывает эксперимент ^расч = 6,73 < Бтабл = 19,3).
Полученное уравнение регрессии отражает основные зависимости характеристик хитозановых микрочастиц от параметров процесса получения и может быть использовано для подбора параметров ведения процесса.
Таким образом, согласно уравнению (7) на медианный диаметр микрочастиц на основе хитозана влияют все варьируемые параметры процесса получения. Можно предположить, что вследствие повышения концентрации щелочи, скорость гелеобразования растет. В результате повышается скорость образования микрочастиц с наименьшим размером, которые в свою очередь сильно подвержены агрегации.
В случае концентрации хитозана, ПАВ и скорости вращения ротора гомогенизатора нельзя выделить какой-либо один процесс, влияющий на диаметр микрочастиц, поэтому данные параметры имеют значимость в коэффициентах парного взаимодействия. Так при увеличении концентрации хитозана, увеличивается вязкость раствора и, как следствие, ослабевает эффективность
диспергирования гомогенизатором, однако капли с высокой концентрацией хитозана обладают большим дзетта-потенциалом, что препятствует их агрегации.
Скорость вращения ротора гомогенизатора увеличивает эффективность процесса
диспергирования эмульсии и уменьшает размер капель, однако, при образовании слишком мелких капель, может происходить их агрегация. Добавление ПАВ может способствовать понижению поверхностного натяжения, а также возникновению на границе капель избыточного заряда и адсорбционно-сольватных слоев, что также препятствует агрегации. Однако при значениях концентрации ПАВ выше критической происходит образование мицелл и увеличение вязкости раствора, что также снижает эффективность гомогенизации. Заключение
В результате проведенного исследования была разработана лабораторная методика получения масляно-эмульсионным методом микрочастиц на основе хитозана с контролируемым размером частиц. Варьирование параметров процесса получения микрочастиц на основе установленных закономерностей позволяет формировать частицы заданного размера, что важно для разработки современных систем доставки лекарственных веществ. Таким образом, с помощью разработанного метода получения микрочастиц на основе хитозана в будущем можно будет получать современные неинвазивные системы доставки лекарств с заданным
размером, например, интраназальные или ингаляционные.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования России,
FSSM-2022-0004
Список литературы
1. Prince M. et al. Improving healthcare for people living with dementia: Coverage, quality and costs now and in the future //World Alzheimer Report. - 2016. - Т. 2016.
2. Gao H. Perspectives on dual targeting delivery systems for brain tumors //Journal of Neuroimmune Pharmacology. - 2017. - Т. 12. - №. 1. - С. 6-16.
3. Agrawal M. et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs //Journal of controlled release. - 2018. - Т. 281. - С. 139-177
4. А.В. Соболев. Значение микромицетов в патологии легких у человека //Проблемы медицинской микологии. - 1999. - Т. 1. № 3 - C. 4 - 9.
5. Ariful Islam M. et al. Mucoadhesive chitosan derivatives as novel drug carriers //Current pharmaceutical design. - 2015. - Т. 21. - №. 29. - С. 4285-4309.
6. Бахрушина Е. О. и др. Интраназальные системы доставки in situ: перспективы применения и основные фармацевтические аспекты разработки (обзор)
//Разработка и регистрация лекарственных средств. -2021. - Т. 10. - №. 4. - С. 54-63.
7. J.H. Li, Y.G. Wu, L.Q. Zhao, Antibacterial activity and mechanism of chitosan with ultra high molecular weight //Carbohydr. Polym. - 2016. - №.148. С. 200205.
8. C. Duan, X. Meng, J.R. Meng, M.I.H. Khan, L. Dai, A. Khan, X.Y. Aa, J.H. Zhang, T.Z. Huq, Y.H. Ni, Chitosan as a preservative for fruits and vegetables: a review on chemistry and antimicrobial properties. //Journal of Bioresources and Bioproducts. - 2019 - Т.4.
- №.1. - С. 11-21.
9. M. Ways T. M., Lau W. M., Khutoryanskiy V. V. Chitosan and its derivatives for application in mucoadhesive drug delivery systems //Polymers. - 2018.
- Т. 10. - №. 3. - С. 267.
10. Ganesan K. et al. Review on the production of polysaccharide aerogel particles //Materials. - 2018. - Т. 11. - №. 11. - С. 2144.
11. Ганин Д. Р. и др. Анализ способов оценки эквивалентного диаметра гранул окомкованной агломерационной шихты в условиях ОАО «Уральская сталь» //Теория и технология металлургического производства. - 2015. - №. 1 (16). - С. 5-11.
12. Ахназарова С. Л., Кафаров В. В. Методы оптимизации в химической технологии: Учеб. Пособие для хим.-технол. спец. вузов.-2-е изд., перераб. и доп //М.: Высш. шк. - 1985. - С. 327-328.
