CC BY
22
УДК 594.35
Т.А. Клочкова, Г.Х. Ким
СТАРЕНИЕ И ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОК У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА МОРСКИХ ЗАДНЕЖАБЕРНЫХ МОЛЛЮСКОВ
ELYSIA RISSO, 1818
Описано явление старения и патогистологические изменения клеток у представителей двух видов морских заднежаберных моллюсков Elysia atroviridis и E. nigrocapitata. Полученные результаты опровергают высказанное ранее мнение о том, что (1) после откладки яиц видам этого рода свойственно явление синхронизированной смерти из-за живущего в их клетках ретровируса и что (2) синхронизированная гибель всей популяции вызывается апоптозом.
Ключевые слова: Elysia, заднежаберные моллюски, зеленые водоросли, клептопластия, аутолизосо-ма, патогистология, старение, трансмиссионный/просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ).
T.A. Klochkova, G.H. Kim
SENESCENCE AND PATHOHISTOLOGICAL CHANGES IN CELLS OF THE MARINE SACOGLOSSAN MOLLUSKS FROM THE GENUS ELYSIA RISSO, 1818
This paper describes the event of aging and pathohistological changes, which occurred in the cells of the marine sacoglossan mollusks Elysia atroviridis and E. nigrocapitata (Opisthobranchia). Our results contradicted the previously expressed opinion that (1) after laying of the eggs, representatives of the genus Elysia exhibit synchronized death due to the disease caused by a retrovirus living in their cells, and that (2) the synchronized death of the whole population is caused by the apoptosis.
Key words: Elysia, sacoglossan mollusks, green algae, kleptoplasty, autolysosome, pathohistology, senescence, transmission electron microscope.
DOI: 10.17217/2079-0333-2016-38-63-73
Введение
В настоящее время существует очень мало данных о старении и продолжительности жизни короткоживущих заднежаберных моллюсков в естественных условиях и в неволе [1-4]. Самым известным объектом исследований в этом направлении стал морской слизень Elysia chlorotica, обитающий на восточном побережье США [5]. Согласно существующим данным, продолжительность его жизни составляет приблизительно 10-11 месяцев, и все взрослые особи погибают весной каждого года, сразу после откладки яиц, причем это происходит как в дикой природе, так и в неволе [1-3]. Считается, что их синхронизированная смерть не определяется естественным ритмом жизнедеятельности/биологическими часами, а обусловлена прогрессированием вирусного заболевания, которое наследуется всеми особями в популяции из поколения в поколение (исследование велось 9 лет) [6]. Это утверждение было сделано на основании того, что в цитоплазме, ядрах, аутолизосомах и даже клептопластидах старых слизней были обнаружены отдельные вирусоподобные частицы, и их нахождение совпадало со временем массовой гибели животных [6]. Хотя морфология, размеры и локализация обнаруженных вирусоподобных частиц значительно различались между собой и их молекулярный анализ не проводился, было высказано смелое предположение, что внутри клеток E. chlorotica находятся ретровирусы и вирусный геном передается к следующему поколению слизней в ДНК моллюсков [6]. Также было высказано предположение, что вирусы реагируют на ежегодные изменения окружающей среды и убивают слизней весной. Эта гипотеза никогда не была подтверждена экспериментально, но она получила достаточно широкое хождение среди специалистов.
Через четыре года после выхода указанной статьи В.Л. Монди и С.К. Пирс опубликовали результаты других исследований и выдвинули утверждение, что ежегодный жизненный цикл
E. chlorotica является результатом апоптоза, а не некроза, и это явление - «первый пример синхронизированной смерти у многоклеточных животных, регулирующейся ежегодным циклом апоптоза» [2, p. 134]. Под апоптозом понимают процесс программируемой клеточной гибели, при котором клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной, а ее фрагменты поглощаются макрофагами либо соседними клетками [7]. Этот процесс обычно продолжается несколько часов и не может остановиться сам по себе естественным образом, поскольку происходит внешняя передача сигнала с помощью рецепторов, располагающихся на поверхности клетки, либо же посредством внутриклеточного сигнала митохондрии высвобождают цитохром с и активируется внутриклеточная протеаза, называемая каспазой [8]. Активация различных каспаз гарантирует контролируемый распад клеточных компонентов, что приводит к гибели клетки, оказывая при этом минимальное воздействие на окружающие ткани [9]. Все же апоптоз можно замедлить или остановить на какое-то время при помощи различных препаратов, ингибирующих действие каспаз и других ферментов, вовлеченных в этот процесс.
Отметим, что авторы В.Л. Монди и С.К. Пирс не выполнили никаких экспериментов по ин-гибиции апоптоза у E. chlorotica, и сделанный ими вывод в большей мере основывался на том, что наряду с некоторыми другими цитологическими признаками, характерными для апоптоза, в клетках присутствовало большое количество аутолизосом. Также отметим, что они не отказались от своей предыдущей гипотезы о ежегодной смерти популяций моллюсков от вирусов (т. е. от некроза), сказав только, что им «не известно, связана ли ежегодная экспрессия вирусов с началом апоптоза, но вирусы не вызывают некроз клеток» [2, р. 134]. Как было ими сказано, «помимо экспрессии вирусов, одновременно с гибелью популяции происходят несколько других внешних и внутренних событий, которые могут быть вовлечены в передачу сигналов апоптоза. К ним относятся очевидные факторы, такие как повышение температуры воды, увеличение фотопериода и гормональные изменения, связанные с откладкой яиц, но фактический механизм [начала апоптоза] остается неизвестным» [2, р. 134].
Примечательно, что ни в одной из указанных выше статей по E. chlorotica не принималось во внимание и не обсуждалось такое явление, как естественное старение особей, и все, что об этом известно, суммировано в одной фразе «В природе взрослые особи живут приблизительно 10 месяцев и часто стареют после спаривания в весенний период» [3, р. 307]. Авторами настоящей статьи была проведена серия наблюдений за представителями двух видов рода морских заднежаберных моллюсков Elysia в лабораторных условиях. Ниже мы приводим первое описание процесса старения моллюсков E. atroviridis и E. nigrocapitata, а также происходящих при этом морфологических и цитологических изменений. Мы также изучили срезы тканей особей E. nigrocapitata, перенесших 5-месячное голодание и потерявших 97% исходного веса, чтобы ответить на вопрос, насколько присутствие множественных активных аутолизосом в клетках отражает начало апоптоза.
Материалы и методы
Для проведения лабораторных исследований животных отбирали в периоды максимального пика численности генераций (с 10 по 30 октября для Elysia nigrocapitata; с 1 декабря по 10 марта Elysia atroviridis). Некоторое количество животных выращивали в инкубационных шкафах в чашках Петри размером 9 х 5 см, наполненных морской средой IMR medium. В термостате поддерживали следующие постоянные условия: температура - 20°C, долгота дня - 12 ч свет : 12 ч темнота, освещенность - 15 цмоль фотонм-2с-1. Остальные животные находились в постоянно аэрируемом аквариуме 150 см длиной, 60 см шириной и 60 см высотой, наполненном профильтрованной морской водой. Аквариум находился в лабораторной комнате при естественном освещении, а температура воды в нем поддерживалась в диапазоне 20±1,5°C.
Водоросли, употребляемые в пищу изученными моллюсками, место их сбора и лабораторные условия для культивирования приводятся в работе Klochkova et al. [10]. Во время проведения экспериментов по кормлению моллюсков водоросли подкладывали в чашку Петри, в которой содержался моллюск, и оставляли там до тех пор, пока все протоплазматическое содержимое водорослевых клеток не было полностью поглощено животным. Затем моллюсков переносили в новые чашки Петри с чистой культуральной средой и свежими талломами вод о-рослей. Исследуемых животных содержали в инкубационных шкафах, где поддерживали сле-
дующие постоянные условия: температура - 20°C, долгота дня - 12 ч свет : 12 ч темнота, освещенность - 15 цмоль фотонм-2с-1. Во время голодания животных держали в тех же условиях, но полностью без водорослевого корма. Эксперименты «кормление-голодание» провели для двух генераций с использованием 20 особей для каждого эксперимента.
Для фотографирования объектов в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) моллюсков содержали в следующих лабораторных условиях: температура - 20°C, долгота дня -12 ч свет : 12 ч темнота, освещенность - 15 цмоль фотонм- с- . Образцы тканей моллюсков изготавливали из отсеченных кусочков параподий после фиксирования всего тела в течение 6 ч при температуре 4°C в фосфорно-солевом растворе (PBS buffer, 22 г NaCl), содержащем 2,5% глутеральдегида. После фиксации в глутеральдегиде образцы тщательно отмывали от фиксирующего раствора путем погружения в морскую воду (3 раза по 5 мин), затем кусочки парапо-дий отсекали лезвием и помещали в 1%-ный раствор OsO4 в фосфорно-солевом буферном растворе, содержащем ферроцианид калия (K4Fe(CN)63H2O) на 2 ч при температуре 4°C. После постфиксации в растворе OsO4 образцы дегидрировали в сериях растворов этилового спирта с увеличивающейся концентрацией (от 10 до 100%, время каждого выдерживания - 20 мин; 100% - 3 раза). Затем спирт удаляли из образцов путем выдерживания в сериях растворов эпоксидной смолы (Spurr's epoxy resin) с увеличивающейся концентрацией (25, 50, 75%: время каждого выдерживания - 2 ч; 100%, 3 раза: время выдерживания - 2 раза по 6 ч, последний, 3-й раз - 24 ч). Обработанные образцы закатывали в смолу, содержащую затвердитель, и высушивали в течение 1,5 дня в печи при температуре 72°C. Затем их резали на ультрамикротоме с использованием алмазного ножа (толщина срезов - 150 нм), после чего окрашивали 4%-ным раствором уранилацетата и 1%-ным раствором цитрата свинца. После напыления защитного углеродного микрослоя на мембрану-держатель образцов их помещали в трансмиссионный электронный микроскоп Hitachi H-300 (Tokyo, Japan) для дальнейших исследований.
Исследования были выполнены при финансовой поддержке Национального исследовательского фонда Республики Корея и гранта Г.Х. Кима «Extreme Genomics Program». Дополнительное финансирование было получено из проектов «Golden Seed Project» (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs) и программы исследований по морским биотехнологиям («Marine Biotechnology Program», PJT200620, genome analysis of marine organisms and development of functional applications, funded by Ministry of Oceans and Fisheries, Korea, to GHK).
Результаты и обсуждение Старение E. atroviridis
Вид E. atroviridis является так называемым фотосинтетическим моллюском, способным ассимилировать водорослевые хлоропласты (т. е. клептопластиды) в свои клетки и длительное время поддерживать их в живом состоянии в качестве резервного пищевого ресурса [5, 10]. Наши наблюдения показывают, что особи E. atroviridis являются синхронными гермафродитами, и у них происходит перекрестное спаривание, то есть каждое половозрелое животное производит как сперматозоиды, так и яйцеклетки. В лабораторных условиях одна особь может отложить яйца 3-5 раз, по 1-2 кладки за один раз, обычно это происходит на 5-6-й месяцы их жизни. После откладки яиц все взрослые особи никогда не погибали синхронно и продолжали жить в лаборатории несколько месяцев. У них резко снижался аппетит и уменьшалось потребление корма (диета на 100% состояла из Bryopsis spp.). После 8-го месяца жизни они переставали есть и практически не двигались. Наблюдения за поведением животных в лабораторных культурах показали, что в более молодом возрасте они могут устраивать сами себе периоды голодания, отказываясь от любого корма, и несколько недель жить за счет ресурсов клептопластид, регулируя, таким образом, свое физиологическое состояние и тем самым управляя физиологическими процессами и «временем» своей жизни. Однако для откладки яиц им необходимо обильно питаться водорослями, чтобы достичь определенных размеров тела. Это обсуждалось в наших ранних работах по E. nigrocapitata [4-5].
К 8-му месяцу жизни у E. atroviridis начиналось истощение тканей тела и появлялись видимые дегенеративные изменения. Так, в пищеварительной железе стареющих особей начинал откладываться красно-оранжевый пигмент (рис. 1, а), а у старых особей (10-11 месяцев) все тело было в красно-бурых рубцах, в параподиях возникали бугры, заломы и спайки, а также разрывы
на их краях (рис. 1, б). Затем в начале 11-го месяца жизни тело особей E. atroviridis начинало самоуничтожаться (у >70% особей), так что от всего тела живой оставалась только голова. В среднем отмирало и полностью разрушалось до 70-80% тела. Отмирание и отслаивание клеток всегда начиналось от кончика хвостовой части и постепенно продвигалось к основанию шеи (рис. 1, в). При этом в течение 2-3 недель моллюски оставались живыми и реагировали на механические раздражители, например на касание пинцетом: передвигались по дну чашки Петри на остатке ноги, двигали головой и ринофорами. Автолиз параподий не был вызван инвазией патогенных организмов, например грибков или бактерий, поскольку во всех случаях разрушающийся край оставался неинфицированным. Поскольку мы наблюдали это явление в разные годы у многочисленных особей из трех генераций, и оно всегда начиналось на излете их жизни, мы полагаем, что это возрастные изменения E. atroviridis, предшествующие ее естественной смерти. Максимальная продолжительность ее жизни в неволе составила 11 месяцев. В природе этот вид моллюсков является сезонным, и взрослые особи погибают ежегодно [2010].
п а «
Рис. 1. Старые особи atroviridis и произошедшие с ними изменения:
а - через 7 месяцев жизни моллюска в пищеварительной железе начинал откладываться красно-оранжевый пигмент; б - к 10-му месяцу жизни моллюска все его тело было в красно-бурых рубцах, в параподиях возникали бугры, заломы и спайки; в - к концу 11-го месяца жизни от моллюсков оставалась только голова с практически полностью разрушенным телом, при этом моллюски оставались живыми
Fig. 1. Old animals of Elysia atroviridis and changes, which happened to them: a - some red-orange colored pigment started to appear in the digestive gland of 7 months-old mollusk; 6 - in 10 months-old mollusks the whole body was covered with red-brown scars, bumps and creases; b - at the end of the 11th month of the mollusk's life only the head remained, while the body was almost completely destroyed; the mollusk was still alive at this stage
Второй изученный нами моллюск, Е. nigrocapitata, также является «фотосинтетическим», и он примечателен тем, что способен выжить без пищи пять месяцев [4, рис. 2]. Описание цитологического строения откормленных особей приводится в нашей ранее опубликованной статье [4]. В настоящей работе мы впервые показываем срезы тканей особей, перенесших голодание в течение пяти месяцев (рис. 3). У них отсутствуют хорошо оформленные, дифференцированные слои вакуоль- и хлоропластсодержащих клеток, которые всегда присутствуют у откормленных особей [4]. Анатомия саккоглос, перенесших длительное голодание, до сих пор детально никем не изучалась, поэтому мы не можем с уверенностью сказать, что происходит с их внутренними органами, в частности с пищеварительной железой. Найти принадлежащие ей специфические клетки нам не удалось, поэтому мы предполагаем, что в ходе длительного голодания она атрофируется.
Цитологические изменения у E. nigrocapitata, вызванные длительным голоданием
Рис. 2. Различия размеров тела у одной и той же особи Elysia nigrocapitata: a - откормленной; б - перенесшей 5-месячное голодание; в - увеличенная фотография особи, перенесшей голодание; г - абсолютные изменения размеров тела у особи, показанной на рис. а - б
Fig. 2. Differences in the body sizes in the same animal of Elysia nigrocapitata: a - well-fed mollusk; б - after 5 months of starvation; в - enlarged photo of the mollusk, which survived for 5 months without any food algae; г - absolute changes in the body sizes of the animal shown in figs. а - б
Рис. 3. Микрофотографии цитологического строения Elysia nigrocapitata, полученные с помощью ТЭМ: а - в клетках особей, подвергшихся голоданию в течение 5 месяцев, очень много аутолизосом; б - ядро в непосредственной близости от липидной капли. лк - липидная капля, лзм - аутолизосома, м - митохондрия, я - ядро
Fig. 3. Transmission electron micrographs
of the cells in Elysia nigrocapitata: а - the cells of 5 months-starved mollusks contained numerous autolysosomes; б - nucleus, which is located next to the lipid droplet. лк - lipid droplet, лзм - autolysosome, м - mitochondrion, я - nucleus
Мы полагаем, что в ходе голодания имеет место автолиз и самопереваривание содержимого вакуоль- и хлоропластсодержащих клеток и межклеточных липидных капель. Проведенные нами исследования показали, что в течение первых двух месяцев полного голодания все особи утратили зеленую окраску, следовательно, в числе первых были утилизированы все хлоропласт-содержащие клетки. Вслед за этим стали расходоваться вакуольсодержащие клетки, внутриклеточные и находящиеся в межклеточном веществе липидные капли. К пятому месяцу голодания это привело к 93-97%-й потере животными веса и размеров (рис. 2, б - г). Клетки эпителиальной ткани голодных особей утратили отчетливые очертания и мозаичное расположение, их мембраны стали более рыхлыми. Количество аутолизосом в них заметно увеличилось по сравнению с клетками откормленных особей, причем большинство аутолизосом были электроннепроницае-мыми (черными), то есть в активной стадии (рис. 3, а). В клетках оставались маленькие липидные капли, которые, по-видимому, являлись последним доступным пищевым/энергетическим ресурсом в условиях полного голодания (рис. 3, б). Несмотря на то, что клетки голодных особей содержали большое количество аутолизосом, их множественное присутствие само по себе не отражало начало апоптоза. При восстановлении режима кормления редуцированный моллюск начинал восстанавливать исходные размеры тела. Затем особи могли прожить еще несколько месяцев, а в самом уникальном случае до 2-3 лет.
Старение E. nigrocapitata
Наши наблюдения показывают, что особи этого вида моллюсков, как и E. atroviridis, являются синхронными гермафродитами и у них происходит перекрестное спаривание. Как и в описанном выше случае с E. atroviridis после откладки яиц все взрослые особи E. nigrocapitata никогда не погибали синхронно и продолжали жить в лаборатории несколько месяцев. У этого вида элизий максимальная продолжительность жизни в неволе составила три года (пять особей). В природе этот вид моллюсков является сезонным, и его взрослые особи погибают ежегодно [4]. Старение E. nigrocapitata не сопровождалось заметными дегенеративными изменениями тела, как у E. atroviridis. Оно выражалось в том, что особи прекращали потреблять водорослевый корм и за несколько месяцев редуцировались до 2-3 мм в длину, после чего умирали.
Однако у E. nigrocapitata было зафиксировано другое необычное явление (рис. 4). Оказалось, что у нее от всего тела тоже живой может оставаться только голова. Особь, у которой мы это наблюдали, была собрана в природе 7 октября 2010 г., и на тот момент она достигала 17 мм длины. В ходе лабораторного эксперимента по кормлению моллюсков она сначала перенесла 5-месячное голодание. За это время ее размер уменьшился с 3 см до 3 мм, а масса тела снизилась почти на 97% (рис. 2, б). За следующий месяц обильного кормления она восстановила исходные размер и массу тела и затем отложила четыре кладки яиц, последнюю из них в апреле 2011 г. Затем эта особь продолжила жить еще более двух лет, не откладывая яиц.
После 1 -го года жизни у нее резко снизился аппетит и уменьшилось потребление корма (диета на 50% состояла из Chaetomorpha moniligera и на 50% из Phyllodictyon orientale). Так, если в 1-й год жизни эта особь съедала одно длинное растение C. moniligera в сутки, то во 2-й год жизни такого растения ей хватало на 1-2 недели. К концу 2-го года жизни тело животного почти перестало двигаться. Когда моллюску надо было поесть, что случалось крайне редко, он переворачивался, вставал на ногу и подтягивал себя к корму. Его параподии более не реагировали на свет и не расправлялись, а тело не изгибалось дугой и ползло по прямой линии. В промежутках между поеданием корма животное лежало на боку неподвижно.
Через 2,5 года содержания моллюска в лаборатории на его шее образовался большой пузырь с воздухом (рис. 4, а). Он становился все больше, давление внутри него резко возрастало, и через несколько дней пузырь лопнул. На его месте образовался обширный раневой рубец. Подобный пузырь с воздухом формировался еще три раза, и каждый раз он взрывался, и раневой рубец становился все больше и глубже. После пятого, последнего разрыва пузыря голова животного отделилась от тела. Тело без головы не подавало никаких признаков жизни. Голова, напротив, была живой и подвижной (рис. 4, б - г). Она активно шевелила ртом, ринофоры реагировали на механические раздражители. После самоотделения от неподвижного тела голова E. nigrocapitata самостоятельно перевернулась, встала на остаток ноги и поползла по дну чашки Петри, хотя до этого моллюск более 1-го года оставался неподвижным. Не имея пищевода и желудка, она, безусловно, не могла есть. Тем не менее она подходила к водорослям, трогала их ринофорами, дви-
гала ртом и вела себя в целом как обычный моллюск. В последние две недели она резко уменьшилась в объеме, и к концу жизни потеряла 1/2 первоначального размера. На кончиках обоих ринофоров одновременно стали отмирать и отслаиваться клетки, из-за чего за два дня они превратились в едва заметные бугорки. В целом голова прожила 40 дней, при этом 27 из них она активно двигалась, что было зафиксировано нами серией видеоклипов, снятых под микроскопом в формате «настоящего времени» (рис. 4, д - н).
граница самоотделения цела от головы гудок
6
остаток центральной нервной системы
Н^Л глаз ринофора
рот
1
остаток ноги
остаток ноги
0 мин
щ
к
4>
À,
Рис. 4. Старая особь Elysia nigrocapitata и произошедшие
с ней изменения: а - через 2,5 года жизни на шее моллюска образовался большой пузырь с воздухом; б - г - к концу 3-го года жизни от моллюска осталась одна голова, самостоятельно отделившаяся от полностью атрофированного тела; д - н - подвижная голова E. nigrocapitata через 8 дней
после отделения от тела. Фотографии являются вырезками из видеоклипа длиной 6 мин, снятого в формате
«настоящего времени» под микроскопом Olympus ZX10. Красный квадрат имеет
одни и те же координаты и показывает самостоятельное перемещение (т. е. движение) головы за 6 мин
Fig. 4. Old animal of Elysia nigrocapitata and changes that happened: а - large air bubble formed on the neck of 2.5 years-old animal; б - г - by the end of 3rd year of the mollusk's life only its head remained, which somehow separated from the completely atrophied body; д - н - actively moving head of E. nigrocapitata at 8 days after separation from the atrophied body. Images were cropped
from the video clip (6 min long) recorded in the "real time " format under an Olympus ZX10 microscope. Red square has the same coordinates in all frames and marks movement trajectory of the head for 6 min
Поскольку подобное явление ранее никогда не описывалось, мы провели патогистологиче-ские исследования тела у этой особи и выявили ряд различных изменений в клетках и тканях (рис. 5-6). Для этого были изучены срезы тканей атрофированного тела, зафиксированного в растворе глутеральдегида сразу после его отделения от головы. В качестве контрольной группы использовались образцы, приготовленные из параподий молодых особей E. nigrocapitata 1-го года жизни.
Рис. 5. Микрофотографии цитологического строения отделившегося тела Elysia nigrocapitata, полученные с помощью ТЭМ: а - ресничный эпителий; б - множественные мелкие липидные капли, локализованные в клетках, располагающихся под слоем эпителиальной ткани (также показаны стрелками на рис. е); в - утратившая отчетливые очертания вакуольсодержащая клетка. Вакуоль наполнена множеством пузырьков (показаны стрелками); г - е - морфологические изменения ядер и гранулярной эндоплазматической сети, разорвавшейся на множество мелких фрагментов (г - е, показаны стрелками). лк - липидная капля, м - митохондрия, я - ядро
Fig. 5. Transmission electron micrographs of the cells in the body, which separated from the head of Elysia nigrocapitata: а - epithelium with cilia and microvilli; б - multiple small lipid droplets in the cells, which localized under a layer of epithelial tissue (also shown with arrows in fig. e); в - vacuole-containing cells lost turgor and shape, and the vacuole was filled with numerous vesicles (arrows); г - е - morphological changes of nuclei and granular endoplasmic reticulum, which broke down into numerous small fragments (г - е, arrowheads). лк - lipid droplet, м - mitochondrion, я - nucleus
Оказалось, что хлоропласты внутри клеток атрофированного тела 3-летнего моллюска отсутствовали, что явно указывало на то, что водорослевая протоплазма к тому времени переварилась. Клетки эпителиальной ткани утратили отчетливые очертания, их мембраны стали рыхлыми, но в целом эпителий был без видимых повреждений и не инфицирован патогенными организмами (рис. 5, а). В клетках под слоем эпителиальной ткани оставались множественные мелкие липидные капли, являющиеся, как мы уже говорили выше, запасным питательным материалом, способствующим выживанию E. nigrocapitata в условиях длительного голодания. Круп-
ных липидных капель, которые мы всегда находили в межклеточном веществе здоровых откормленных особей [4], не было. Вакуольсодержащие клетки утратили отчетливые очертания, а сама вакуоль была наполнена множеством пузырьков (рис. 5, в). Ядра во всех клетках разбухли, стали в среднем в 1,5-2 раза больше в поперечнике, чем в клетках молодых особей (рис. 5, г, е), у них появились выпячивания ядерной оболочки (рис. 5, е), хроматин мог быть конденсированным (рис. 5, в, е) либо рассеянным (рис. 5, г). Обширная гранулярная эндоплазматическая сеть, в норме окружающая ядро, была разорвана на множество мелких фрагментов (рис. 5, г - д). В клетках всех типов находилось много митохондрий, и примерно у половины из них имелись признаки разрушения мембраны (рис. 5, а). В межклеточной жидкости было много завернутых или дисперсных волокнистых структур (рис. 6, а - в) и комбинированных газово-жидкостных вакуолей разного размера (рис. 6, г - д), которых мы никогда не видели у здоровых молодых особей. Возможно, газово-жидкостные вакуоли стали причиной образования газового пузыря на шее животного. Количество аутолизосом увеличилось не слишком заметно по сравнению с клетками откормленных особей, однако обнаруженные аутолизосомы были электроннепроницаемы-ми (черными), то есть в активной стадии (рис. 6, е). Мы не обнаружили вирусов и вирусных частиц в клетках и межклеточной жидкости молодых и старой особей E. nigrocapitata.
Рис. 6. Микрофотографии цитологического строения отделившегося тела Elysia nigrocapitata, полученные с помощью ТЭМ: а - б - в межклеточной жидкости находилось много завернутых (а) или дисперсных (б)
волокнистых структур (показаны стрелками); в - увеличенный фрагмент волокнистой структуры, отмеченной рамкой на рис. б, г - газово-жидкостная вакуоль в межклеточном веществе; д - увеличенный фрагмент газово-жидкостной вакуоли, показывающей ее строение; е - в клетках находилось очень много аутолизосом. г - газ, ж - жидкость, лз - аутолизосома
Fig. 6. Transmission electron micrographs of the cells in the body, which separated from the head of Elysia nigrocapitata: а - б - extracellular fluid contained numerous coiled (а) or disperse (б) fiber-like structures (arrows); в - enlarged fragment of the fiber-like structure marked with the frame in Fig. б; г - the gas-fluid vacuole, which was localized in the extracellular fluid; д - an enlarged fragment of the gas-liquid vacuole, showing its structure; e - the cells also contained numerous autolysosomes. г - gas, ж - fluid, лз - autolysosome
Заключение
Наши цитологические исследования не выявили наличия вирусов в клетках исследованных элизий, и сделанный группой С.К. Пирса частный вывод на основании наблюдений за E. chlorotica [6] не дает оснований для каких-либо обобщений и не должен распространяться на другие виды этого рода. Нам представляется странным утверждение, что у E. chlorotica спаривание и откладка яиц происходят на самом излете жизни (9-10 месяцев) [3], после чего все особи синхронно погибают [1-3, 6]. Как показывают наши наблюдения, к концу жизни у элизий начинается истощение тканей тела, появляются дегенеративные изменения, и они в принципе становятся не способными к размножению.
При исследовании тканей старых особей E. chlorotica с помощью светового и трансмиссионного электронного микроскопов была зарегистрирована дегенерация пищеварительного дивертикула, расширение эндоплазматической сети и аппарата Гольджи, фрагментация ДНК, формирование первичных лизосом и конденсация хроматина, что было названо признаками апоптоза [2]. Схожие изменения были обнаружены и нами у старых особей E. atroviridis и E. nigrocapitata, однако мы полагаем, что эти изменения были вызваны старением и последующим некрозом. Следует учитывать тот факт, что в случае с E. chlorotica так называемый апоптоз не был подтвержден экспериментально. Авторы могли наблюдать последовательные стадии альтерации клеток, вызванные общепатологическими процессами, наблюдаемыми во время старения.
Удивительным свойством исследованного нами «фотосинтетического» моллюска E. nigrocapitata оказалась его способность наращивать и многократно сокращать в ходе голодания объем своего тела и оставаться живым при самой крайней степени его редукции (т. е. потеря 93-97% исходного веса). Присутствие в клетках большого количества аутолизосом не являлось признаком начала апоптоза. Во-первых, аутолизосомы всегда находятся в клетках молодых откормленных особей обоих видов, еще до начала голодания. Кроме того, в клетках особей, перенесших длительное голодание, находилось гораздо большее количество активных аутолизосом, однако при восстановлении режима кормления редуцированный моллюск восстанавливал исходные размеры тела и жил еще несколько месяцев или лет.
Старение особей выражается в медленной деградации и постепенном разрушении тела моллюсков, при этом от них может оставаться практически одна голова. Однако даже в этом, казалось бы, фатальном случае они длительное время остаются живыми. Это необычное для мира живой природы явление поможет глубже понять, что такое жизнь, каковы границы, определяющие возможность ее продолжения при потере многоклеточным организмом важнейших органов и систем органов. Что касается заднежаберных моллюсков, то описанные случаи свидетельствует об их чрезвычайной способности к сохранению жизнеспособности в самых экстремальных условиях.
Литература
1. Mondy W.L., Pierce S.K. Annual sea slug population's life cycle is the result of apoptosis // Microscopy and Microanalysis. - 2002. - Vol. S. - Suppl. 2. - P. 10S6CD-10S7CD.
2. Mondy W.L., Pierce S.K. Apoptotic-like morphology is associated with annual synchronized death in kleptoplastic sea slugs (Elysia chlorotica) // Invertebrate Biology. - 2003. - Vol. 122. -P. 126-137.
3. The making of a photosynthetic animal / Rumpho M.E., Pelletreau K.N., Moustafa A., Bhattacharya D. // The Journal of Experimental Biology. - 2011. - Vol. 214. - P. 303-311.
4. Morphology, molecular phylogeny and photosynthetic activity of the sacoglossan mollusk, Elysia nigrocapitata, from Korea / Klochkova T.A., Han J.W., Chah K.-H., Kim J.-H., Kim K.Y., Kim G.H. // Marine Biology. - 2013. - Vol. 160. - P. 155-16S.
5. Клочкова Т.А. Обзор явления клептопластии у морских заднежаберных моллюсков // Вестник КамчатГТУ. - 2016. - № 37. - C. 57-69.
6. Annual viral expression in a sea slug population: Life cycle control and symbiotic chloroplast maintenance // Pierce S.K., Maugel T., Rumpho M.E., Hanten J., Mondy W.L. // The Biological Bulletin. - 1999. - Vol. 197/6. - P. 1-6.
7. Green D. Means to an end: Apoptosis and other cell death mechanisms // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2011/ ISBN 978-0-87969-888-1.
8. Pop C., Salvesen G.S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation // The Journal of Biological Chemistry. - 2009. - Vol. 284. - P. 21777-21781.
9. Disruption of cellular homeostasis induces organelle stress and triggers apoptosis like cell-death pathways in malaria parasite / Rathore S., Datta G., Kaur I., Malhotra P., Mohmmed A. // Cell Death & Disease. - 2015. - Vol. 6. - P. e1803.
10. Feeding specificity and photosynthetic activity of Korean sacoglossan mollusks / Klochkova T.A., Han J. W., Kim J.H., Kim K. Y., Kim G.H. // Algae. - 2010. - Vol. 25. - P. 217-227.
Информация об авторах Information about authors
Клочкова Татьяна Андреевна - Камчатский государственный технический университет; 683003, Россия, Петропавловск-Камчатский; кандидат биологических наук, доктор философии биологии (Ph.D.); доцент кафедры экологии и природопользования; tatyana_algae@mail.ru
Klochkova Tatyana Andreevna - Kamchatka State Technical University; 683003, Russia, Petropavlovsk-Kamchatsky; Candidate of biological sciences, Doctor of Philosophy in Biology (Ph.D.), Associate Professor of Ecology and Nature Management Chair; tatyana_algae@mail.ru
Ким Гван Хун - Национальный университет Конджу, факультет биологических наук; Конджу 314-701, Республика Корея; доктор философии биологии (Ph.D.), профессор, декан колледжа естественных наук; ghkim@kongju.ac.kr
Kim Gwang Hoon - Kongju National University, Department of Biology; Kongju 314-701, Korea; Doctor of Phylosophy in Biology (Ph.D.), Professor, Dean of College of Natural Sciences; ghkim@kongju.ac.kr
