CC BY
82
ОБЗОР
УДК: 616.619 О.Б. Жданова1, А.А. Хайдарова2
СТАНОВЛЕНИЕ И НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИЙ ПРОФИЛАКТИКИ ТРИХИНЕЛЛЕЗА
'Кировская государственная медицинская академия
2Всероссийский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина
O.B Zhdanovai, A.A Haydarova2
FORMATION AND SCIENTIFICAL METHODOLOGICAL BASES OF PERFECTION OF TECHNOLOGIES OF PREVENTIVE MEASURES OF TRICHINELLOSIS
'Kirov state medical academy 2K.I. Skryabin S National helminthology institute
Трихинеллез является одним из самых опасных гельминтозоонозов. Анализ различных методов диагностики в гельминтологии указывает на возрастающее внимание к борьбе c данным зоонозом в Европе и России. Животные как источник инвазии играют ведущую роль в заболевании человека. Задача данной работы заключалась в оценке основных технологий диагностики у домашних и диких животных с использованием компрессорной трихинеллоско-пии и пептолиза, иммунологических, кристаллографических методов и полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Методы компрессорной трихинеллоскопии и пептолиза ткани мышц животных в искусственном желудочном соке, используемые для постморталь-ной диагностики трихинеллеза, достаточно надежны, позволяют обнаружить источники инфекции и предотвратить развитие гельминтозооноза у человека. Однако экспертиза должна быть комплексной: использование методов компрессорной трихинелло-скопии и пептолиза с применением искусственного желудочного сока, иммунологических методов и молекулярно-биологических методов диагностики (ПЦР), так как они позволяют дифференцировать вариететы личинок трихинелл. Практическое применение методов иммунологической диагностики и экспертиза мяса и мясных продуктов от животных позволяют надежно предотвращать заражение человека данным зоонозом.
Ключевые слова: trichinella spiralis, компрессорная трихинеллоскопия, пептолиз, иммунологические и кристаллогафические методы, полимеразно-цепная реакция.
Trichinellosis is one of the most dangerous helminthozoonoses. And the analyze of different methods of diagnostics in helmintology indicates an increased role of attention of such zoonotic diseases as trichinellosis in Europe and Russia. Animals as a source
of infection play the leading role in human infection. The task of present work is diagnosis of larvae at helminthozoonosis in domestic and wild animals using method of compressor trichinelloscopy and peptolysis, immunological and crystallografical methods and method of polymerase chain reaction (PCR). Methods of compressor trichinelloscopy and peptolysis of muscle tissue of animals by applying artificial gastric juice can be used for postmortal diagnostics of trichinellosis and are aimed at detection of sources of infection and prevention of helminthozoonosis in human. Moreover this expertise should be conducted using complex methods: compressor trichinelloscopy and peptolysis using artificial gastric juice, immunological methods and PCR, because this methods contain the description and differentiation of larvae (dangerous to human). Practical application of immunological diagnostics and expertise of animals, meat and meat products allows to prevent infection of human with dangerous zoonosis.
Key words: trichinella spiralis, compressor trichinelloscopy, peptolysis, immunological and crystallografical methods, method of polymerase chain reaction.
Трихинеллез, один из опаснейших зоонозов, известных с шестидесятых годов прошлого столетия (Zenker, 1860), а возбудитель болезни Trichinella spiralis (spiralis) открыт и описан почти 200 лет тому назад (Owen, 1835) - Nematoda Rudolphi, 1808; подкласс Aphasmidia Chitwood et Chitwood, 1933; отряд Trichocephalida Skijabin et Schulz, 1928; подотряд Trichocephalata Skrjabin et Schulz, 1928; надсемейство Trichinnellidae Ward, 1907; род Trichinella Railliet, 1895 u Bessonoviella Garkavi, 1994; вид Trichinella spiralis Owen, 1835 u Trichinella pseudospiralis Garkavi, 1972, Trichine^ nativa.[5,8]
Значительный вклад в изучение проблемы трихинеллеза внесли отечественные исследователи: Ка-люс (1952); А.В. Меркушев (1954); Н.П. Лукашенко (1956); В.П. Пашук (1957); Ю.А. Березанцев (1963, 1974, 1986); А.С. Бессонов (1972, 1975, 1977, 1979, 1985, 1992, 1996, 1999, 2000); Б.Л. Гаркави (1972, 1987, 1999, 2000, 2002); А.А. Богуш (1971); Н.Е. Кос-минков (1961); П.А. Владимирова (1965); С.Н. Боев (1978); В.А. Бритов (1982, 2000); Я.Л. Бекиш (1988, 1992); Н.Н. Озерецковская (1988, 1996, 2000); Э.В. Переверзева (1988); А.В. Успенский (1986, 1996, 1997, 2000, 2002); Ю.Г. Артеменко (1987); С.Н. Бело-зеров (1990, 1997); О.Г. Полетаева (1966); Б.В. Ромашов (1996, 2000, 2002); Н.А. Куликова (1993); А.М. Асатрян (1998); зарубежные ученые: Madsen (1976); Dick (1983); Mureil et al (1984, 1987); Stewart (1989); Ruitenberg (1978, 1987, 1988); C.E. Tanner and Gregory (1961); Bouree, Diallo (1988) и другие [3-6, 9, 10, 22, 29-33, 35]
Необходимо отметить, что в результате проведения всесторонних теоретических и практических исследований последних лет были открыты новые, неизвестные ранее биологические особенности трихинелл, паразитирующих у разных видов животных и птиц, в частности, наличие адаптируемых штаммов, вариететов, изолятов и биотипов, а также открытие трихинелл бескапсульного вида - T. pseudospiralis, способных, в отличие от трихинелл классического
капсулообразующего вида, совершать в организме птиц полный биологический цикл развития. Зарегистрированы случаи паразитирования псевдоспиральных трихинелл у синантропных и диких видов животных, по данным исследований В.А. Бритова (1971); В.А. Бритова, С.Н. Боева (1972-1976); Б.Л. Гаркави (1972), А.С. Бессонова (1985, 2000); И.В; Байеринене Д.В., Переверзева Э.В., Фалеева О.А., Веретенникова Н.Л.(1988); А.А. Мурого, А.Я. Сапунова (1982); А.Я. Сапунова (1982,1996-2000); Н.Н. Озерецковской (1967, 1969, 2000); и др. [5,10]
С 1835-го по 1972 год господствовало исторически сложившееся мнение о едином виде Trichinella spiralis, хотя еще в 1898 г. А.Г. Казаринов упоминал о возможности существования в природе разных «штаммов» трихинелл. В конце 50-х и начале 60-х годов идею о штаммовых различиях трихинелл развивал Э.Р.Геллер. В.П.Коряжнов и Roth (1960) обобщили спорадические случаи обнаружения личинок трихинелл у диких животных. Широкие исследования этих животных дали основания полагать, что они являются основным звеном в передаче трихинеллезной инвазии домашним свиньям, с одной стороны, а с другой стороны, стало все яснее вырисовываться представление об адаптации отдельных популяций трихинелл к диким животным либо свиньям. Первым на это обратил внимание А.В. Меркушев (1954). Ю.А. Березанцев (1956) выделил природный и синантропный трихинеллез, характеризующийся относительно самостоятельной циркуляцией возбудителя. Реальное существование в природе штаммов трихинелл, отличающихся от типичного вида T. spiralis, доказали Nelson, Rickman (1961), а также Z. Kozar, M. Kozar (1965). Опыты, проведенные В.А. Бритовым, показали наличие значительных различий трихинелл, выделенных от диких животных, и трихинелл от свиней [8-10]. Учитывая различия трихинелл по степени адаптации к определенным группам хозяев, их необходимо дифференцировать по физиологическим свойствам с целью выявления дискретных единиц или видов.
Результаты наблюдений, экспериментов и вычислений свидетельствовали о том, что исследуемые природные синантропные трихинеллы имеют глубокие различия. Поскольку трихинеллы, выделенные от свиньи из Белоруссии, не скрещиваются с трихинеллами от енотовидной собаки из Амурской области, их стали рассматривать как отдельные виды. Нескрещиваемость природных трихинелл с синантропными является главным критерием разности видов. В тех случаях, когда трихинеллы были гомологичные, в матке самок наблюдались все стадии эмбриогенеза -от зигот до личинок, а когда гетерологичные - в матке самок содержалась сперма, неоплодотворенные яйцеклетки или патологический эмбриогенез, как правило, не достигавший стадии личинки. Такие эмбрионы погибали и распадались. В качестве других отличительных особенностей заслуживают внимания низкая инвазионность природных и высокая инвазионность синантропных трихинелл для свиней; и несколько меньшая плодовитость природных трихинелл у мышей [20]. По рекомендации И.В. Орлова нескрещи-вающиеся изоляты трихинелл были названы вариете-тами с присвоением им наименований: T. spiralis var. domestica (свойствен домашним свиньям), T. spiralis var. nativа (распространенный среди диких животных Евразии и Северной Америки), T. spiralis var. Nelsoni (свойствен диким животным Африки) и T. spiralis var.
Pseudospiralis (впервые выделен от енота-полоскуна на Северном Кавказе и описан Б.Л. Гаркави (1972) и не формирующий капсулы вокруг личинки. Позднее эти вариететы по предложению С.Н. Боева были возведены в ранг самостоятельных видов. Новые виды трихинелл - T. nativa и T. nelsoni пока не признаны Всемирной организацией здравоохранения и Международным кодексом зоологической номенклатуры, их видовая валидность считается сомнительной. Поэтому T. spiralis, T. nativa и T. nelsoni даны следующие наименования T. spiralis (spiralis), T. spiralis (nat^), T. spiralis (nelsoni), валидность от T. psevdospiralis признана безоговорочно. При проверке личинок трихинелл разных вариететов на чувствительность к низкой температуре обнаружилось, что самым устойчивым вариететом трихинелл к низкой температуре оказался T. spiralis nat^ (Мирошниченко Л., 1976).
В настоящее время ареалы трихинелл имеют нечеткие контуры, но в общих чертах они приобретают вполне определенные границы. Так, T. spiralis (nat^) распространен в Голарктической области выше 40-й параллели, личинки способны переносить в трупах животных низкую температуру [5, 8]. Ареал T. spiralis (nelsoni) включает главным образом южное полушарие, а в северном полушарии встречается только в местах с относительно теплой зимой, так как личинки вариетета весьма уязвимы к действию низкой температуры. Оба природных вариетета трихинелл паразитируют у диких млекопитающих. Домашним и диким свиньям данные трихинеллы обычно не свойственны, хотя T. spiralis (nelsoni) лучше адаптирован к ним, чем T. spiralis (nat^). Ареал T. pseudospiralis еще не установлен, однако с уверенностью можно сказать, что этот вид распространен повсеместно от Сибири до Австралии. Гельминт паразитирует у птиц и у многих видов млекопитающих. T. spiralis (spiralis) адаптирован к свиньям и белым крысам линии Wistar.
Видовые и штаммовые особенности являются одним из обстоятельств, ограничивающих внедрение вакцинации против трихинеллеза. Но попытки создания вакцины были предприняты как зарубежными, так и отечественными исследователями. Наиболее эффективной на настоящий момент является вакцина, разработанная в Амурской государственной медицинской академии (г. Благовещенск). После длительных лабораторных исследований действие живой вакцины было проверено в производственных условиях в зверосовхозе «Дубовский» Свободнен-ского района на песцах клеточного содержания. В качестве живой вакцины служили стерилизованные гельматаком (парбендазолом) личинки трихинелл, являющиеся антигенным раздражителем, подопытным песцам клеточного содержания массой 4 кг пятимесячного возраста вводили энтерально по 3 стерилизованных парабендазолом личинки трихинелл на 1 г живой массы. У вакцинированных животных не выявлено каких-либо изменений в их поведении. Спустя 20 дней четырем подопытным животным и четырем интактным, используемым в качестве контроля, ввели Trichinella spiralis (spiralis) в количестве 15 экземпляров на 1 г живой массы. Вакцинированные песцы после заражения сутки не дотрагивались до еды, затем аппетит нормализовался. Песцы контрольной группы были угнетены, малоподвижны, преимущественно лежали свернувшись, в течение недели наблюдался кровавый понос. В дальнейшем аппетит и двигательная активность нормализова-
лись. Спустя 25 дней после проверочного заражения провели исследование мышечной ткани компрессорным методом и методом пептического переваривания подопытных и контрольных животных. Результаты трихинеллоскопических исследований показали, что количество личинок в 1 г жевательных мышц по данным искусственного переваривания мышечной ткани у иммунизированных песцов выявлено в 20 раз меньше, чем у контрольных. Таким образом, иммунизация стерилизованными личинками трихинелл (живая вакцина) формирует противотрихинеллезный иммунитет и требует дальнейших исследований [11]. Исходя из вышесказанного можно заключить, что разработка профилактической вакцины против трихинеллеза возможна, но сопряжена с определенными трудностями.
Поэтому в настоящее время меры борьбы с трихинеллезом в первую очередь заключаются в интенсификации технологии диагностики данного гельминтоза. С этой целью применяют компрессорную трихинеллоскопию и трихинеллоскопию осадка после переваривания в ИЖС. Эти методы совершенствуются на протяжении последних десятилетий. Сравнительные исследования мышечной ткани А.В. Успенский, А.А. Гребенкин (2004) проводили с использованием автоматизированного метода трихинел-лоскопии на основе применения аппаратов АВТ-Л5М - четырехреакторный, АВТ-Л4 и АВТ-Л6 - двухре-акторные, а также устройства для полевой трихинел-лоскопии ТП-1 и ТП-2. Результаты их сравнительных испытаний с базовым устройством показали, что с помощью ТП-1 и ТП-2 можно проводить экспертизу, используя стандартные компрессориумы (24-28 срезов), что позволяет легко обеспечить их взаимозаменяемость в случае необходимости. Авторами также изучены в сравнительном аспекте конструктивные и технологические особенности аппаратов для переваривания мышечной ткани в искусственном желудочном соке (общей особенностью аппаратов АВТ-Л4, АВТ-Л6 и АВТ-Л5М является наличие реакторов и вставных фильтров (сит), однако в целом как по техническим, производственным, так и конструктивным показателям приборы имеют значительные отличия). Аппараты АВТ-Л4 и АВТ-Л6 выполнены в виде настольного прибора, состоящего из основных сборочных блоков: корпуса, емкости для воды, реакторов, электропривода, блока электронной автоматики. Корпус является несущей частью конструкции аппарата, на него крепятся все рабочие агрегаты. Аппарат АВТ-Л5М представляет собой сборный четырехре-акторный блок, смонтированный на единой несущей оси. Каждый реактор состоит из активатора-мешалки, вставного сита (фильтра), выпускной системы. Сравнительный анализ технических характеристик базового аппарата АВТ-Л4 и устройств нового поколения АВТ-Л6 и АВТ-Л5М показал их значительные конструктивные и производственные отличия (А.В. Успенский, 2004-2014). Не менее важным является дальнейшее совершенствование прижизненной диагностики трихинеллеза [25-34].
Практически все существующие иммунологические тесты пытались применить для диагностики трихинеллеза. Теоретические аспекты иммунодиагностики трихинеллеза достаточно перспективны (тесный контакт с организмом хозяина и длительное антигенное воздействие трихинелл). Одной из первых реакций, примененных для диагностики
трихинеллеза в России, была реакция кольцепреци-питации (М.И. Романович, 1912), но она оказалась неэффективной из-за слабой активности антигена. В дальнейшем многие исследователи изучали реакции, основанные на феномене преципитации: В.А. Калюс (1947, 1952), Н.П. Лукашенко (1956), В.П. Пашук (1956, 1957), В.П. Пашук, И.П. Бутенко, В.И. Корот-кевич и Д.И. Чекмарев (1965). Из аллергических реакций распространение получила внутрикожная реакция (ВАР), (Августин, Тейлор, 1932). Также была испытана реакция связывания комплемента (Штро-бель, 1911), которая обладала крайне низкой диагностической эффективностью. Более активными можно считать реакции агглютинации (РА), впервые разработанные Суссенгусом и Кляйн (1944), предложивших для адсорбции антигена частицы холестерола, в дальнейшем для РА стали применять бентонит, латекс, кармин, уголь и др. Наиболее чувствительным методом была реакция непрямой гемагглютинации, впервые примененная для диагностики трихинеллеза в 1956 г. Price, Werner в США. Реакция основана на феномене агрегации эритроцитов, обусловленном реакцией антиген-антитело, при которой титруемую сыворотку адсорбируют индикаторными эритроцитами для удаления присутствующих в большинстве сывороток гетерофильных антител. Данная реакция до сих пор применяется во многих странах, в том числе и в России, где была испытана Л.М. Коноваловой, Н.Н. Красовской, Е.С. Лейкиной (1976). Осаждение преципитиногена может вызываться не только им-мунологически активной сывороткой, но и плазмой крови зараженных животных. На этом феномене основан испытанный исследователями (А.С. Бессонов, А.В. Успенский, 1974) метод диагностики трихинеллеза у клеточных пушных зверей на основе реакции кольцепреципитации в капилляре (РКПК). Применение РКПК, как считают исследователи, сокращает время исследования песцов по сравнению с компрессорной трихинеллоскопией в 1,5-2 раза, а с реакцией кольцепреципитации в пробирке - в несколько раз. Примерно в 10 раз меньше расход антигена, чем при стандартной РКП. Диагностическая эффективность реакции кольцепреципитации в капилляре с антигеном БИЭМ оказалась более высокой по сравнению с той же реакцией в пробирке и методом компрессорной трихинеллоскопии мышц [24, 35]. При исследовании проб от 802 животных в неблагополучных по трихинеллезу зверохозяйствах чувствительность реакции в капилляре составила 85%, а специфичность 98,5%. Чувствительность посмертной диагностики методом искусственного переваривания 30 г икроножных мышц в этом же опыте равнялась 94%, а компрессорной трихинеллоскопии только 51,5%. Согласно данным комиссионной проверки метода, его чувствительность по сравнению с методом искусственного переваривания мышц была лишь 70%, реакции кольцепреципитации в пробирке 60%, а метода компрессорной трихинеллоскопии 50%. Авторы пришли к заключению, что РКПК имеет несомненные преимущества перед той же реакцией в пробирке и методом компрессорной трихинеллоскопии мышц и может быть рекомендована для массовой проверки пушных зверей на трихинеллез при формировании маточного стада, импорте племенных животных и организации плановых оздоровительных мероприятий в зверосовхозах (Успенский А.В., Жданова О.Б., 1987, 1997) [13, 14, 28].
Агглютинационные реакции кармина, латекса и бентонита для диагностики трихинеллеза изучены А.В. Успенским в сравнении с РА, РНГА, РКПК (1971-1974). Наиболее высокой диагностической эффективностью обладала реакция латексагглюти-нации (РЛА) при спонтанном трихинеллезе песцов. При этом были испытаны различные антигены: кис-лоторастворимая белковая фракция, полученная по методу L.R. Melcher (1943), обезжиренный экстракт личинок трихинелл по E.F. Chaffe et al. (1954) и полный экстракт личинок трихинелл по C.E. Tanner and Gregory (1961). Лучшая специфичность (до 97%) и абсолютная чувствительность была получена с антигеном кислоторастворимой белковой фракции, а также отмечена высокая специфичность реакции агглютинации латекса при трихинеллезе у людей и животных А.В. Успенский (1974), Bouree, Diallo (1988) [23]. Однако широкого применения данные методы в России не получили. Существенным недостатком большинства иммунологических методов диагностики трихинеллеза являлась субъективность учета результатов реакций и возможность их документирования. Поэтому на протяжении последующих 40 лет изучается возможность совершенствования диагностических тест-систем на основе иммуноферментной реакции [15, 23-25].
Иммунохимически усиленные тесты являются наиболее перспективными для диагностики трихинеллеза. Первый из таких методов был основан на реакции иммунофлуоресценции (РИФ), которая обладала хорошей чувствительностью и высокой специфичностью. РИФ для серологической диагностики трихинеллеза впервые испытали E.H. Sadun et al. (1962), E.H. Sadun (1963). В качестве антигена они применяли фиксированных формалином личинок трихинелл. R.K.Baratawidjaja et al. (1963) частично видоизменили антиген - декапсулированные личинки трихинелл фиксировали на предметном стекле флам-бированием. Позднее, используя РИФ для определения локализации антигенов в личинках трихинелл, E.Engelbrecht and E.H. Kampelmacher (1965) установили, что кутикула является в основном местом локализации антигена и соответственно местом связывания антител [16]. В иммунодиагностике трихинеллеза при помощи РИФ использовали различные антигены: гистосрезы мышц, инвазированных личинками трихинелл или живых декапсулированных и лиофилизированных личинок. Реакцию широко применяли для диагностики трихинеллеза человека и животных (Ruitenberg E.J.et al., 1967, 1972; Ruitenberg E.J.and Kampelmacher E.H. 1970, Brzosko W., Gancarz Z., 1965,1969; Chroust K.1969; Chroust K., Dubansky V. 1967,1970; Chroust K., Dubansky V., Piskac A.,1966; B.Baldelli et al., 1969, G. Lupasco et al., 1968, Kozar М. et al., 1966, Gancarz, 1968, Kozar M. and Kozar Z., 1968, 1969, 1970, P. Wehesa et al., 1971). Однако и у данной реакции имеется также существенный недостаток -субъективность при учете результатов реакции, кроме того, практически исключена возможность механизировать и документировать этот тест [16].
Высокой чувствительностью и специфичностью, и, что особенно важно, возможностью объективного учета обладает радиоиммунологический анализ (РРА) (Yalow, Berson, 1959). За разработку метода его авторы Yalow and Berson в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии. Существуют разные варианты радиоиммуноанализа. Так, например, Miles
and Hales в 1968 году использовали йодированные антитела в комбинации с антигеном на твердой фазе. В 1978 году Langone предложил метить йодом белок А, который способен специфично связываться с Fc фрагментами антител. В 1979 Weiler and Zenk был предложен авторадиографический РИА, в котором они использовали многоканальные планшеты. Кроме того, в 1981 Axelson с соавт. разработали липосом-ный иммуноанализ. В нашей стране впервые были отработаны параметры постановки и учета РРА для диагностики трихинеллеза С.Н. Белозеровым (1990).
Наряду с несомненными достоинствами РИА имеет и определённые недостатки, к которым можно отнести следующие:
1) ограниченный срок жизни радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов;
2) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности;
3) возможность радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, что вызывает необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала.
Именно эти трудности послужили исходным моментом для поиска методов, альтернативных РИА, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и экспрессность. Стремление найти замену радиоактивным меткам привело к использованию ряда неизотопных меток. Среди них можно назвать бактериофаги (Haimovich, Sela, 1969), свободные радикалы (Leute et al., 1972), флуоресцентные, хемилюминесцентные и биолюминесцентные вещества (Soini et al., 1979; Simpson et al., 1979; Kricka, Carter, 1982; Serio, Pazzagli, 1982), эритроциты, липо-сомы (Adler, Liu, 1971; Chan et al., 1978) и др. Наиболее перспективными и универсальными метками для иммуноанализа в настоящее время являются ферменты, которые ввели в употребление в 1971 г. Engval, Perlman в Швеции, независимо от них Van Weemen, Schuurs, в Нидерландах, и Rubenstein et al., в США. Engval, Perlman предложили сокращенно называть метод ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), что в переводе с английского означает фермент-зависимый иммуносорбционный анализ, нередко этот тест называют иммуноферментный анализ (ИФА), а саму реакцию - иммуноферментной (ИФР). С тех пор, как ферменты в 1971 г. впервые были предложены в качестве меток для иммуноанализа, появилось более 500000 публикаций, посвященных различным аспектам применения иммуноферментного метода. В 1972 г. К. Е. Rubenstein et al. разработали новый подход ,заключающийся в проведении всего анализа без использования твердой фазы, который получил название гомогенного ИФА. Метод иммуноанализа находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа, что приводит к упрощению схемы анализа. Идет постоянный поиск новых веществ, используемых в качестве маркеров. ИФР обладает высокой чувствительностью, позволяя определить минимальные количества вещества (нанограммы), для ее постановки не требуется специального оборудования, возможна автоматизация всех процессов постановки реакции, учет реакции можно проводить как визуально, так и с помощью автоматического спектрофото-
метра. Кроме гомогенного известно много вариантов ИФА. В противоположность данному методу при гетерогенном ИФА антиген или антитело фиксируется на твердой фазе (как правило, пластик), а не-прореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием. Кроме того, различают методы конкурентного и неконкурентного анализа. Для иммуноферментного определения антител часто используется непрямой, неконкурентный ИФА. Антиген фиксируют на твердой фазе, после отмывания проводят инкубацию с раствором антител. Если произошло специфическое связывание антител, их можно определить при помощи меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки, ферментативной реакции. Имеются многочисленные модификации иммуноферментного метода (амплифицированный фермент-зависимый иммуносорбционный анализ a-ELISA, ИФА с использованием эффекта пространственных затруднений (ИФАПЗ) и многие другие) [16, 21, 36-39].
В иммунодиагностике трихинеллеза достигнуты значительные успехи благодаря последним достижениям в таких областях, как культивирование паразитов in vitro; внедрение новых методов получения и очистки иммунодиагностических реагентов; использование моноклональных антител и разработка чувствительных методов иммуноанализа позволяет применять иммуноферментный метод. В настоящее время иммунодиагностика паразитарных заболеваний развивается по трем главным направлениям:
- обнаружение циркулирующих антител,
- обнаружение циркулирующих или экскрети-руемых антигенов,
- обнаружение циркулирующих комплексов антиген - антитело.
Первый подход, связанный с обнаружением антител, является вполне традиционным. Однако, данные тесты недостаточно специфичны из-за отсутствия максимально очищенных препаратов соответствующих антигенов. В связи с этим серологические исследования при заболеваниях, вызываемых паразитами, недостаточно эффективны в области их диагностики. Более того, сам принцип обнаружения антител, даже при использовании качественных антигенов, характеризуется невысокими предсказательными возможностями. В начальной стадии заболевания гельминтозами или при его легкой форме уровень антител может быть ниже предела чувствительности обнаружения, что порождает ложные отрицательные ответы. И, наоборот, в некоторых случаях специфические антитела сохраняются в кровотоке в течение нескольких лет после выздоровления, из-за чего могут быть получены ложные положительные ответы. Другой подход, связанный с регистрацией специфических циркулирующих или экскретируе-мых антигенов в физиологических жидкостях больных трихинеллезом с помощью иммуноанализа, привлекает к себе все больше внимания. Однако следует учитывать, что при некоторых паразитарных заболеваниях, сопровождающихся процессом кап-сулообразования вокруг паразитов, в том числе и трихинеллеза, циркулирующие антигены могут быть обнаружены только на ранних стадиях развития болезни (до завершения процесса капсулообразования). Впервые ИФР стали применять с целью диагностики гельминтозов, а затем вести широкую разработку в направлении использования ее в диагностике трихи-
неллеза исследователи из Голландии E.J. Ruitenberg et al. (1975,1976а), E.J. Ruitenberg and van F.Knappen (1976). Этими же авторами разработаны макро- и микровариант ИФР (E.J. Ruitenberg, 1975, 1976, 1977). В нашей стране ИФР с целью диагностики трихинеллеза была применена группой Г.А. Ермолина с детальным описанием техники постановки реакции, различных ее вариантов, параметров конструирования диагностических тест-систем на основе ИФР (Г.А. Ермолин, А.Я. Лысенко, 1978; Е.Е. Ефремов, Г.А. Ермолин,1980; А.Я. Лысенко с соавт., 1978,1980; Е.Е. Ефремов, 1977; Л.В. Курманова с соавт.,1980) [7, 16, 20, 21, 36-41].
В 2008-2012 гг. во Всероссийском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина была разработана методика межвидовой и внутривидовой дифференциации гельминтов, идентификации генотипа Trichinella spiralis методом полимеразной цепной реакции. Методика выявляет характерные для генома T. spiralis локусы ДНК, и дает возможность устанавливать связь между природным и синантропным трихинеллезом в различных биоценозах. Метод основан на взаимодействии синтезированных олигону-клеотидных праймеров со специфичными для данного генотипа паразита локусами ДНК, происходит рост амплифицируемого фрагмента, характерного для данного генотипа. Электрофорез продуктов амплификации позволяет визуализировать фрагменты ДНК и определить их молекулярную массу. Разработан перечень оборудования и реактивов, утверждены методические положения по проведению процесса подготовки клинического материала, выделения геномной ДНК, подготовки реакционной смеси для полимеразной цепной реакции и режим проведения амплификации и электрофореза [22]. Однако данный метод требует специальной подготовки персонала для работы на современном оборудовании и наличия высокотехнологичных лабораторий. При массовых эпидемиологических и эпизоотических исследованиях, например, при диагностике трихинеллеза, обычно пользуются вариантом ИФР, направленным на поиск антител как наиболее практичным (Varela-Dias et al. ,1977; Cuesta et al.,1982; В.К.Бережко с соавт., 1987, 1996-2005; Л.А. Написанова 1994-2003, 2005; С.Н.Белозеров, 1990, 1997; Полетаева О.Г. 1996, 1997-2003).
Начиная с 2007 г. были предприняты попытки внедрения кристаллографических методов исследования биологических субстратов при трихинеллезе [39-41]. Различные тест-методики для идентификации патологических состояний организма человека и животных с использованием мочи и сыворотки крови, в том числе кристаллографические реакции и достаточно широко используются в клинической диагностической практике. Наибольшей чувствительностью и значительным спектром диагностируемых заболеваний обладают методы, рассматривающие сыворотку крови в качестве объекта изучения, однако они относятся к инвазивным (Алексеева О.П., Воробьев А.В. 2003, Мартусевич А.К., 2013). Кроме того, для их проведения требуется определенный промежуток времени и наличие хорошо оборудованной лаборатории с достаточным наборов реактивом поэтому была предпринята попытка разработки экспресс-методики, которую можно было бы применить в качестве первичного теста при диагностике различных заболеваний. Причем необходимыми требо-
ваниями при его выборе являются достаточная степень точности и возможность широкого применения без вложения значительных материальных средств. Таким методом стал кристаллографический анализ фаций мочи и слюны. Кристаллогенные и инициирующие свойства биосред организма здоровых людей и животных являются видо- и субстратоспецифичны-ми. При исследовании методами биокристалломики биожидкости формируют тезиокристаллоскопиче-ский «паттерн» [1, 2, 18]. Уровень кристаллогенной активности биосреды (кристаллостаз) является видо-специфичным параметром ее гомеостаза, детерминированным особенностями, функциями и компонентным составом биологической жидкости. Паразиты и микроорганизмы обладают как непосредственным, так и опосредованным влиянием на кристаллостаз биологических субстратов (феномен микроорганизм-паразит-ассоциированного кристаллогенеза).
Характер данного эффекта определяется особенностями самого агента и микроокружением (in vivo - метаболическим статусом организма-хозяина) и данные изменения могут стать диагностическими критериями при исследовании биожидкости, однако отсутствие возможности его механизации и ограниченные возможности компьютеризации документации, а также трудоемкость в настоящее время позволяют его рекомендовать только для исследования животных и научных лабораториях (Антропова И. П., Габинский Я. Л., 1997, Мартусевич А.К., Жданова О.Б. 2013) [17-19].
Список литературы
1. Алексеева О.П., Воробьев А.В. Кристаллография слюны - новый неинвазивный метод диагностики H. Ру1оп//Нижегородский медицинский журнал, 2003. № 2. С. 73-78.
2. Антропова И. П., Габинский Я. Л. Кристаллизация биожидкости в закрытой ячейке на примере слюны//Клиническая лабораторная диагностика, 1997. № 8. С. 36-38.
3. Александрова Т.В., Десятник В.И. Профилактика заболеваний желудочно-кишечного тракта у пушных зверей// Материалы докл. к 1-й международной научной конф. «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии», Уфа. 2000. С. 6-7.
4. Белозеров С.Н. Диагностика трихинеллеза свиней методом радиоактивных антител (РРА)// Материалы докл. к 3-й Всесоюз. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Вильнюс, 1981. С. 144-146.
5. Бессонов А.С. Виды и вариететы в роде Trichinella railliet. 1985// Материалы докл. к 8-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 30-31 мая 2000 г. М., 2000. С. 1-6.
6. Бессонов А.С., Успенский А.В. Методика постановки и учета реакции кольцепреципитации в капилляре для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов// Бюл. ВИГИС, 1977. Вып. 19. С. 9.
7. Бережко В.К. Динамика развития гиперчувствительности немедленного типа и уровня сывороточных иммуноглобулинов при экспериментальном трихинеллезе: непрямая реакция дегрануляции тучных клеток, реакция пассивной кожной анафилак-сии//Материалы докл. к 7. научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 2-3 октября 1996 г. М., 1996. С. 39-42.
8. Бритов В.А. Возбудители трихинеллеза. М.: Наука, 1982. 272 с.
9. Бритов В.А. Интенсивность трихинеллезной инвазии у животных в зависимости от вида, возраста и иммунитета//Зоологический журнал, 1962. № 44, С. 287-288.
10. Гаркави Б.Л., Сапунов А.Я. Вклад Кубанских паразитологов в развитие паразитологической науки и практики/ Теоретические и прикладные проблемы гельминтологии. Материалы Всероссийского симпозиума «Роль российской школы гельминтологов в развитии паразитологии». М., 1998. С. 68-70.
11. Губа Л.А. Влияние иммунизирующей дозы стерилизованных личинок трихинелл на интенсивность инвазии песцов (VULPES LAGOPUS). Материалы всер. конф. «Паразитарные болезни и борьба с ними». Москва, 2009. С. 156-158.
12. Жданова О.Б. Диагностическая эффективность ИФА при трихинеллезе песцов// Материалы докл. к 7-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 2-3 октября 1996 г. М., 1996. С. 27-29.
13. Жданова О.Б. Совершенствование прижизненной диагностики трихинеллеза песцов// Материалы докл. к межвуз. научной конф. «Актуальные проблемы науки в АПК», Кострома, 3-4 февраля 2000 г., Кострома, 2000. С. 98-99.
14. Жданова О.Б. Зависимость интенсивности инвазии и характера иммунных реакций от дозы личинок трихинелл при экспериментальном трихинеллезе песцов// Материалы докл. к межд. научной конф. по заболеваниям мелких животных. Троицк, 2000. С. 116-163.
15. Жданова О.Б. Совершенствование учета ИФА для диагностики трихинеллеза в зверохозяй-ствах// Материалы докл. к межд. научной конф., посв. 70-летию КГАВМ. Казань, 30-31 мая, 2000. 2 том. Казань-2000. С. 56-58.
16. Иммунологические методы/ Под ред. Г. Фриммеля, пер. с нем. А.П. Тарасова. М.: Медицина, 1987, 472 с.
17. Мартусевич А.К., Ашихмин С.П., Симонова Ж.Г., Жданова О.Б. Изучение феномена микроорга-низм-паразит-ассоциированного кристаллогенеза в модельных условиях // Здоровье населения и среда обитания, 2013. № 1. С. 42-44.
18. Мартусевич А.К., Жданова О.Б. Исследование зависимости кристаллогенной активности биосреды от интенсивности инвазии Trichinella spiralis // Российский паразитологический журнал, 2013. № 2. С. 64-71.
19. Мартусевич А.К., Жданова О.Б., Написано-ва Л.А., Ашихмин С.П. Применение dot-ELISA и биокристаллоскопии для прижизненной диагностики трихинеллеза // Российский иммунологический журнал, 2013. Т. 7, № 2-3. С. 187.
20. Мирошниченко Л.С. Некоторые отличительные признаки трихинелл разных видов. // В кн.: Гель-минтозы Дальнего Востока. Хабаровск,1976. С. 52-56.
21. Написанова Л.А. Сравнительное изучение диагностической эффективности модифицированного экскреторно-секреторного антигена трихинелл. // Материалы докл. к 8-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 30-31 мая 2000 г. М., 2000. С. 128-130.
22. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Асеев В.В., Хилюта Н.В. Методика идентификации
Trichinella spiralis методом ПЦР. Российский парази-тологический журнал, 2014. № 3. С.147-150.
23. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигеном трихинелл// Мед. паразитология и паразитар. болезни, 1986. № 3. С. 51-56.
24. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Тхас Нгу-ен Суан, Брюханова Е.Н., Попкова Е.И. Усовершенствование метода оценки реакции иммунофермент-ного анализа при трихинеллезе человека// Материалы докл. к 5-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Новочеркасск, 14-16 сентября 1988 г. М., 1988. С. 174-175.
25. Успенский А.В. Изучение иммунного состояния животных при трихинеллезе. // Бюл. ВИГИС. М., 1971. Вып. 5. С. 131-135.
26. Успенский А.В. Изучение реакции латексаг-глютинации для прижизненной диагностики трихинеллеза животных. // Бюл. ВИГИС. М., 1971. Вып. 5. С. 127 -130.
27. Успенский А.В. Диагностическая эффективность агглютинационных реакций при спонтанном трихинеллезе песцов. // Бюл. ВИГИС. М., 1974. Вып. 12. С. 88-90.
28. Успенский А.В., Назарова Н.С., Нечиненный А.Д., и др. Реакция кольцепреципитации в капилляре (РКПК) для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов// Бюл. ВИГИС. М.,1975. Вып. 16. С. 80-81.
29. Успенский А.В., Пантюшенко Н.Т. Особенности эпизоотологии трихинеллеза в Мурманской области // Материалы докл. к 7-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 2-3 октября 1996 г. М., 1996. С.107-111.
30. Успенский А.В. Некоторые особенности распространения трихинеллеза в России. // Материалы докл. к 8-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 30-31 мая 2000 г. М., 2000. С. 68-72.
31. Успенский А.В., Бессонов А.С., Шеховцов Н.В. Автоматизация трихинеллоскопического контроля// Материалы докл. к 8-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 30-31 мая 2000 г. М., 2000. С. 153-156.
32. Успенский А.В., Успенский А.В., Шеховцов Н.В., Гребенкин А.А. Сравнительные испытания устройств для трихинеллоскопического контроля //
Материалы докл. научной конф. по «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», Москва, 2003 г. С. 463-465.
33. Успенский А.В., Шеховцов Н.В., Гребенкин А.А. Особенности ВСЭ на трихинеллез в полевых условиях// Материалы докл. научной конф. по «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», Москва, 2004 г. С. 414-415.
34. Успенский А.В., Скворцова Ф.А. Метод вете-ринарно-санитарной экспертизы мяса промысловых животных при паразитарных зоонозах. Российский паразитологический журнал, 2014. № 3. С.151-157.
35. Rodrigues-Perez J. Trichinellosis in the province of Granada (Spain) // VII intern. Conf. on Trichinellosis, Alicante, Spain, 1988. Р. 398-400 .
36. Ruitenberg E.J., van Knapen et al. Enzyme-linked immunosorbent Assay /ELIZA/ in T.spiralis infection in Pigs// VI intern. Conf. on Trichinellosis, Poznan, 1976. Р. 487-501.
37. Ruitenberg E.J. Die indirecte Fluoresiende Antikorpertechnik bel Serodiagnostic von mit T.spiralis infizierten schweinen // Fleischewirschaft 1971. 47 - 11. Р. 1220-1223.
38. Ruitenberg E.J. Reliabiliti of the fluorescent antibody test for serodiagnostic of swine trichinellosis in trichinella free and endemic areas. //II intern. Conf. on Trichinellosis, Wroclaw, 1969. Р. 172-173.
39. Ruitenberg E.J. Diagnosche Metoden sur Festellung der Invasion mit Trichinella spiralis larvae// Fleischewirschaft. 1970. 50. -1 Р. 42-44
40. Ruitenberg E.J. Studies on the reability of the fluorescent antibody test in the serodiagnosis of trichinellosis // Neth. J. Sci. 1974/ v 51. №1. Р. 108-109.
41. Ruitenberg E.J. Enzyme-linked immunosorbent Assay the serodiagnosis of parasitic infections // Biomedicine. 1977. 26. 5. Р. 311-314.
Сведения об авторах
Жданова Ольга Борисовна - д.б.н., зав. кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии Кировской государственной медицинской академии. E-mail: [email protected]
Хайдарова Амина Аслановна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунологии Всероссийского института гельминтологии им. К.И. Скрябина.
