CC BY
86
УДК 547.992
СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ ФЕРУЛЫ ИЗМЕНЧИВОЙ
© Л.Д. Котенко, М.А. Маматханова , Р.М. Халилов, А. У. Маматханов, Г.Б. Сотимов
Институт химии растительных веществ им. акад. С.Ю. Юнусова АН РУз, ул. Мирзо-Улугбека, 77, Ташкент, 100170 (Узбекистан) E-mail: munir_05@mail.ru
Оценку качества травы ферулы изменчивой (Ferula varia) предложено проводить по содержанию флавоноида цина-розид. Разработана хроматоспектрофотометрическая методика количественного определения цинарозида. Изучены условия извлечения цинарозида из сырья 80% этанолом, размер частиц сырья - 2-6 мм, динамическое равновесие на кипящей водяной бане - 1 ч (гидромодуль 1 : 10). При этом содержание цинарозида в сырье составило около 1,0%. Определено содержание цинарозида в растении по фазам вегетации и показано, что заготовку сырья следует производить со второй половины апреля до второй половины мая. Относительная ошибка предложенной методики - 6,1%. По результатам проверки с помощью добавок РСО цинарозида на стадии экстракции подтверждено отсутствие систематических потерь цинарозида в процессе анализа.
Ключевые слова: цинарозид, флавоноиды, стандартизация, ферула изменчивая, экстракция, хроматоспектрофотометрическая методика.
Введение
Надземная часть ферулы изменчивой (Ferula varia (Schrenk) Trautv., сем. Apiaceae) используется в качестве растительного сырья для получения препарата цинарозид.
Ferula varia - многолетнее растение высотой 60-120 см, широко распространено по территории Средней Азии. Произрастает на закрепленных бугристых песках, лёссовых предгорьях, пестроцветах. Корни этого растения применяют при лихорадке, зубной боли, как антигельминтное средство, а также местно в качестве ранозаживляющего средства. Надземная часть обладает лактогенным действием [1].
Химический состав надземной части представлен главным образом флавоноидами, основными из которых являются лютеолин и цинарозид [2].
Фармакологическое свойство препарата цинарозид обусловлено гипоазотемическим действием флавоноида цинарозид [3]. На основании этого мы предлагаем вести стандартизацию сырья ферулы изменчивой по цинарозиду.
Цель данного исследования - разработка методов качественного и количественного анализа травы Ferula varia.
В настоящее время имеется большое количество работ, посвященных применению УФ-спектрофотометрии [4-8]. В основу предлагаемых методик положена регистрация электронных переходов в молекулах этих соединений в нейтральных растворителях и в растворах с добавлением различных реактивов.
Разработан хроматоспектрофотометрический метод определения цинарозида в сырье, основанный на наличии в УФ-спектре препарата максимума поглощения (Хшах 352нм, lg е = 4,44). Интенсивность данного экстремума позволяет использовать его в качестве аналитической полосы. Основные стадии метода: 1) получение суммы экстрактивных веществ из сырья; 2) хроматографирование экстракта с целью отделения цинарозида от сопутствующих веществ; 3) десорбция цинарозида с сорбента; 4) спектрофотометрирование элюатов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Изучение внешних признаков и числовых показателей ферулы изменчивой. Сырьем является надземная часть растения, состоящая из листьев и стеблей. Ферула изменчивая - многолетняя монополикарпическая трава с толстым высоким стеблем. Листья преимущественно прикорневые, собранные в розетку; пластинка их всегда многократно рассеченная; стеблевые с хорошо развитыми влагалищами. Зонтики обычно без обвертки. Различаются два типа расположения зонтиков. В большинстве случаев зонтики бывают двоякие: центральные с обоеполыми цветками и боковые с мужскими и смешанными цветками, расположенными около основания центральных зонтиков, в других случаях все зонтики одинаковые с прорастающими их осями. Зонтички чаще без обверточек. Цвет листьев - темно-зеленый, стеблей - от светло-зеленого до светло-коричневого. Запах специфический, вкус - горьковатый.
Потерю в массе при высушивании определяли по ГФ XI (вып. 1, с. 285), содержание золы общей - по ГФ XI (вып. 2, с. 24); золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, - по ГФ XI (вып. 2, с. 25), органической примеси (части других неядовитых растений) - по ГФ XI (вып. 1, с. 276), минеральной примеси (земля, песок, камешки) - по ГФ XI (вып. 1, с. 276).
Изучены такие показатели процесса экстракции, как степень измельченности сырья, динамическое равновесие между твердой и жидкой фазами, концентрация спирта этилового.
В результате экспериментов выяснено, что при экстракции неизмельченного и крупно измельченного сырья процесс проходит медленно. Из измельченного сырья (размер частиц менее 2 мм) цинарозид извлекается быстрее, однако в полученном экстракте появляется большое количество механических примесей. Фильтрация такого экстракта затрудняется. Это приводит к лишним затратам растворителей и энергозатратам. Увеличение же размера частиц ведет к уменьшению выхода цинарозида. Наилучшие данные получены при размере частиц 2-6 мм (табл. 1). Проведенные эксперименты для определения наиболее полного извлечения цинарозида показали, что при экстракции 80% этиловым спиртом выход цинарозида наибольший (табл. 1).
Установлено, что при кипячении сырья на водяной бане динамическое равновесие между твердой и жидкой фазами наступает через 1 ч (гидромодуль 1 : 10) (табл. 1).
Полноту экстракции цинарозида проверяли по отрицательной качественной реакции на цинарозид (чувствительность обнаружения - 1 мкг).
Получение экстракта травы ферулы изменчивой. Около 4,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл и приливают 40 мл 80% этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания растворителя в колбе. Экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр по ОСТ 6-09-1706-72, отбрасывая первые 10 мл экстракта.
Качественные реащш. На хроматогра- Таблица 1. Влияние условий экстракции на содержание
фическую пластинку «Силуфол» УФ-254 цинарозида в надземной части ферулы изменчивой
(10х15) наносят в виде полосы длиной 3 см
0,05 мл полученного экстракта, рядом -полосу 0,05 мл (100 мкг) раствора РСО цинарозида. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 1 ч и хроматографируют восходящим способом в камере, предварительно насыщенной смесью растворителей хлороформ - метанол -уксусная кислота (4 : 2 : 2), в течение 30 мин.
Когда фронт растворителей пройдет 7 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе 10-15 мин и просматривают в УФ-свете (Х=254 нм). На уровне пятна свидетеля должно проявиться пятно цинарозида.
В УФ-свете извлечения должен наблюдаться максимум поглощения при длине волны 352±2 нм (ГФ XI, вып. 2, с. 33).
Условия экстракции Выход цинарозида к массе сырья, %
Степень измельченности сырья
0-2 1,25
2-6 1,22
6-10 1,12
1 0-1 4 1,01
Неизмельченные 0,95
Концентрация этилового спирта, %
95 0,29
90 0,62
80 1,22
70 1,13
60 0,92
Время экстракции, мин
15 1,02
30 1,43
60 1,65
90 1,65
Количественное определение. Хроматографическую пластинку «Силуфол» УФ-254 (10х15) делят на четыре полосы. На стартовую линию первой и второй полос наносят в виде полосы длиной 3 см по 0,05 мл полученного экстракта, на третью полосу - 0,05 мл (100 мкг) раствора РСО цинарозида, четвертую полосу оставляют свободной - контроль. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 1 ч и хроматографируют восходящим способом в камере, предварительно насыщенной смесью растворителей хлороформ - метанол - уксусная кислота (4 : 2 : 2), в течение 30 мин. Когда фронт растворителей пройдет 7 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе 10-15 мин и отмечают в УФ-свете (Х=254 нм) зоны, содержащие цинарозид, на уровне пятна свидетеля. Зоны сорбента, содержащие цинарозид, и зону контрольного опыта переносят в колбы с притертыми пробками вместимостью 50 мл, приливают по 10 мл 80% этилового спирта и нагревают на водяной бане (60 °С) в течение 30 мин при постоянном взбалтывании. Элюаты фильтруют через стеклянный фильтр (пор 16) при остаточном давлении 10-16 кПа, отбрасывая первые 10 мл фильтрата, и определяют оптическую плотность растворов на фоне контрольного опыта на спектрофотометре при длине волны 352 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Содержание цинарозида в пересчете на абсолютно сухое сырье и на РСО цинарозида рассчитывают по формуле
v Б-а0 • V-2-100100 Б-а0-1008
Х=------------------=-------------,
Б0 • а-100-25-(100№) Б0-а• (100№)
где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; Б0 - оптическая плотность раствора РСО цинарозида; а0 - масса РСО цинарозида в граммах; а - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах; V - объем извлечения в миллилитрах.
Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) цинарозида. Около 0,20 г (точная навеска) предварительно высушенного в течение 2 ч при температуре 100-105 °С цинарозида растворяют в 70 мл 80% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании и энергичном встряхивании и после охлаждения доводят объем раствора 80% этиловым спиртом до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Для разработки качественного и количественного методов анализа использовали цинарозид, полученный по следующей технологической схеме. В экстрактор загружают 1,0 кг измельченной травы ферулы изменчивой с размером частиц 2-6 мм и заливают 80% этиловым спиртом до образования зеркала. Экстракцию проводят при комнатной температуре пятикратно, настаивая по 6-8 ч. Объединенный спиртовый экстракт упаривают в вакуум-циркуляционном аппарате. Густой остаток разбавляют водой в соотношении 1 : 1. Полученный раствор обрабатывают хлороформом (5-6 раз) и оставляют на сутки. При этом выпадает осадок (технический цинарозид), который отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Технический цинарозид перекристаллизовывают и получают 8,96 г цинарозида с содержанием 96,6%.
Обсуждение результатов
Разработанная методика была апробирована на 5 образцах травы ферулы изменчивой. Стабильность сырья в процессе хранения в естественных условиях установлена на основании результатов анализа 5 проб сырья (табл. 2).
Как видно из данных таблицы 2, содержание цинарозида в цельном сырье колеблется от 1,35 до 1,81%. При этом сырье стабильно хранится в течение двух лет.
Для выяснения оптимальных сроков заготовки сырья нами проведено количественное определение ци-нарозида по фазам вегетации: бутонизация, цветение, плодоношение (табл. 3).
Таким образом, наибольшее содержание цинарозида в сырье наблюдается во время цветения, поэтому заготовку сырья следует производить со второй половины апреля до второй половины мая.
Таблица 2. Исследование стабильности цельной травы ферулы изменчивой
Дата анализа Содержание цинарозида в сырье, %
1 проба 2 проба 3 проба 4 проба 5 проба
Ноябрь 2004 г. 1,38 1,43 1,35 1,81 1,49
Май 2005 г. 1,38 1,43 1,35 1,81 1,49
Ноябрь 2005 г. 1,38 1,43 1,35 1,81 1,49
Май 2006 г. 1,38 1,43 1,35 1,81 1,49
Ноябрь 2006 г. 1,38 1,43 1,35 1,81 1,49
Май 2007 г. 1,38 1,43 1,35 1,81 1,49
Примечание. Время заготовки сырья - апрель 2004 г.
Таблица 3. Динамика накопления цинарозида в траве
ферулы изменчивой
Период вегетации Содержание цинарозида, %
Бутонизация (1-15 апреля) 0,109
Цветение (15 апреля - 15 мая) 0,163
Плодоношение (15 мая - 15 июля) 0,142
Метрологические характеристики показывают, что точность единичного определения равна ±6,1% (табл. 4). Результаты проверки с помощью добавок РСО цинарозида на стадии экстракции подтверждают отсутствие систематических потерь цинарозида в процессе анализа (табл. 5).
Таблица 4. Метрологическая характеристика метода анализа
f X S2 S P t(p,f) Ax E E3
5 1,65 0,0015 0,039 95 2,57 0,1 ±6,1 ±3,5
Таблица 5. Результаты опытов с добавками
№ п/п Содержание цинаро-зида в извлечении, мг Введено цинаро-зида, мг Вычислено, мг Найдено среднее из трех определений, мг Относительная ошибка, %
1 2,133 6,811 6,883 +1,05
2 4,678 1,613 6,291 6,397 +1,67
3 1,667 5,745 5,818 +2,14
Таким образом, разработанная методика количественного определения цинарозида может быть использована для оценки качества травы ферулы изменчивой по содержанию основной группы биологически активных соединений.
Выводы
1. Изучены условия извлечения и хромато-спектрофотометрического определения цинарозида из надземной части ферулы изменчивой.
2. Предложен качественный анализ, заключающийся в хроматографическом методе на пластинке «Силу-фол» в смеси растворителей хлороформ - метанол - уксусная кислота (4 : 2 : 2).
3. Содержание цинарозида в сырье составляет около 1,0%. Показано, что заготовку сырья следует производить со второй половины апреля до второй половины мая. Срок хранения сырья - 2 года.
4. Относительная ошибка предложенной методики составила 6,1%.
5. С помощью добавок РСО цинарозида на стадии экстракции подтверждено отсутствие систематических потерь цинарозида в процессе анализа.
Список литературы
1. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. 1988. Т. IV. С. 120-122.
2. Батиров Э.Х., Юлдашев М.П., Нежинская Г.А., Маликов В.М. Флавоноиды Ferula schair и F. samarkandica // Химия природных соединений. 1979. №5. С. 727-728.
3. Сыров В.Н., Хушбактова З.А., Ботиров Э.Х., Маматханов А.У., Грунина И.И. Влияние цинарозида на азотистый обмен и функциональное состояние почек при их экспериментальном поражении в опытах на лабораторных животных // Химико-фармацевтический журнал. 1993. №7. С. 60-63.
4. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids. Springer - Verlag. Berlin -Heidelberg - New-York, 1970. 21 p.
5. Сотимов Г.Б., Юлдашев М.П. и др. Получение формононетина-стандарта из Thermopsis altemiflora // Доклады АН РУз. 2003. №5. С. 55-58.
6. Дорофеенко Г.Н., Шинкаренко А. Л. и др. Синтез природных изофлавонов и их структурных аналогов // Химия природных соединений. 1974. №2. С. 160-162.
7. Сутиашвили М.Г., Алания М.Д. Флавоноиды Melilotus officinalis // Химия природных соединений. 1999. №5. С. 673-674.
8. Jurd L. The Chemistry of flavonoid compounds. N.-Y., 1962.
Поступило в редакцию 24 июня 2008 г.
