CC BY
119
УДК 615:40
Т.В. корнопольцева, А.А. Гуржапова, Т.А. Асеева, А.Г. Мондодоев
СТАНДАРТИЗАЦИЯ НОВОГО СРЕДСТВА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ЕГО ДИУРЕТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (Улан-Удэ)
Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозидв полиэкстракте сухом «Флаворен», полученном, из корневищ и корней марены красильной (Rubia tinctorum L), красных листьев бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch) и травы, мари, остистой (Teloxys aristata (L.) Moq.) и. установлена его диуретическая, эффективность. Ключевые слова: «Профем», флавоноиды, спектрофотометрия, диурез
STANDARDIZATION OF THE NEW HERBAL REMEDY «FLAVOREN» AND ITS DIURESIS EFFICIENCY
T.V. Kornopoltseva, A.A. Gurzhapova, T.A. Aseyeva, A.G. Mondodoyev
Institute of the general and experimental biology SB RAS, Ulan-Ude
The method, of quantitative determination of the sum. of flavonoids in the novel herbal polyextract «3 red» for standartization was elaborated. This novel herbal remedy of the roots of Rubia tinctorum. L., red leaves Bergenia crassifolia (L.) Fritsch and herb of Teloxys aristata (L.) Moq. is composed. Diuresis efficiency was determine. Key words: Flavoren, flavonol glycoside, spectrophotometry, dieresis
Широкая распространенность и наблюдающийся рост патологии органов мочевыделительной системы определяет необходимость совершенствования фармакотерапии заболеваний указанного профиля. Основным требованием к нефропро-текторным средствам является отсутствие токсичности и нежелательных побочных явлений при их применении. Этой задаче в полной мере отвечают средства природного происхождения, поскольку они оказывают комплексное влияние на патологический процесс и обладают минимальным побочным действием.
Одним из перспективных направлений разработки новых лекарственных средств представляется перевод тибетских многокомпонентных сборов, имеющих многовековой опыт применения в лечебной практике, в экстракционные препараты. Они представляют собой сумму биологически активных веществ в концентрированном виде и сохраняют все преимущества многокомпонентных лекарственных средств: синергизм в действии ингредиентов, соответствие мультифакторности заболевания, воздействие на организм больного как корригирующей лекарственной системы, отсутствие токсичности и побочных нежелательных эффектов.
При анализе информации тибетских медицинских трактатов и изучении опыта бурятских лам выявлено 10 композиций, наиболее часто назначающихся для лечения органов мочеполовой системы, в частности, при заболеваниях почек. Одной из этих композиций является трехкомпонентный сбор под условным названием «3 красных», который входит в виде блока в состав многокомпонентных прописей, таких как «Прославленный красный», «Красный отвар-11», «Полный сбор граната» и других [3, 11]. В тибетской медицине бурятских
лам в состав этого сбора входят корневища и корни марены красильной, красные листья бадана толстолистного и трава мари остистой. Препараты и извлечения из этих растений в научной и народной медицине используются в качестве спазмолитических и мочегонных средств [6, 7, 10], что указывает на целесообразность применения данной композиции в качестве средства для профилактики и терапии заболеваний почек. В связи с этим, нами разработано новое нефропротекторное средство растительного происхождения в виде суммарного средства из сухих экстрактов; корней и корневищ марены красильной (Rubia tinctorium L.), надземной части мари остистой (Chenopodium aristatum L.) sin. (Teloxis aristata (L.) Mok.), красных листьев бадана (Bergenia crassifolia Fritsch.), в соотношении 1:1:1, условно названное «Флаворен».
Целью настоящей работы явилась разработка методики стандартизации нефропротекторного экстракта «Флаворен» и определение его диуретической активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал — корни марены красильной приобретены в аптечной сети (ПФК «Фитофарм», рег. № 70/729/23, серия 010799); красные листья бадана толстолистного и трава мари остистой собраны в конце вегетации в пригороде Улан-Удэ в 2009 г. Сухой полиэкстракт получали методом кратной мацерации с учетом оптимальных параметров экстракции. Наличие основных групп биологически активных веществ определяли общепринятыми методами [3]. Определение потери в массе при высушивании проводили на деривато-графе Netzsch STA 449C (Германия). Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре
АдПеМ-8453Е (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Метрологическую обработку результатов проводили согласно рекомендациям [8]. Эксперименты выполнены на белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180 — 220 г. С целью оценки функционального состояния почек животных диурез определяли по общепринятому методу без нагрузки и с 2,5 % водной нагрузкой [2]. Оценку интенсивности канальцевой реабсорбции проводили по А. Ванде [4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом кратной мацерации с учетом оптимальных параметров экстракции получен сухой полиэкстракт. Оптимизацию процесса экстракции проводили с учетом выхода суммы экстрактивных веществ [5] и суммы флавоноидов [1]. Полиэкстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом. Гигроскопичен, комкуется, хорошо растворим в воде, в 50% спирте этиловом. Потеря в массе при высушивании не превышает 5 %. На пяти опытных образцах потеря в массе при высушивании варьирует от 3,04 до 4,93 %. Установлено, что основное удаление влаги начинается при температуре 50 °С, а при 150 °С происходит разложение экстракта.
На основании качественного фитохимического анализа в полученном полиэкстракте установлено наличие антраценпроизводных (ализарин), дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот (кофейная и хлорогеновая), флавоноидов (рутин, кверцетин, кемпферол, лютеолин, гиперозид, апигенин). Идентификацию проводили с использованием аутентичных образцов. При исследовании спектров поглощения спиртовых извлечений полиэкстракта
«Флаворен» было установлено, что максимумы спектров поглощения спиртовых растворов полиэкстракта близки к таковым ГСО цинарозида (лютеолин-7-глюкозид). При добавлении к раствору полиэкстракта раствора алюминия хлорида
I максимум спектра поглощения смещался к 408 нм и был близок к максимуму спектра поглощения стандартного образца цинарозида, снятого в аналогичных условиях (рис. 1).
Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в полиэкстракте «3 красных».
Около 0,3 г (точная навеска) сухого полиэкстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50 мл 70% спирта этилового и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 1 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом этиловым до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 405 нм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят 95% спиртом этиловым до метки. Параллельно определяют оптическую плотность раствора стандартного образца цинарозида.
Суммарное содержание флавоноидов (Х, %) вычисляют по формуле:
Б ■ тст ■ ку ■ 100 • 100 Вст-т-кУст-(100-1№)
где: D — оптическая плотность исследуемого раствора; DСТ — оптическая плотность стандартного раствора цинарозида; кг — коэффициент разбавле-
Рис. 1. Дифференциальные спектры поглощения ГСО цинарозида (1) и полиэкстракта сухого «Флаворен» (2) в 95% спирте этиловом.
ния исследуемого раствора (2500); кгСТ — коэффициент разбавления цинарозида (2500); т — масса навески сбора (полиэкстракта), г; тСТ — масса навески цинарозида, г; W — потеря в массе при высушивании сбора (полиэкстракта), %.
Расчет суммарного содержания флавоноидов можно проводить также с использованием величины удельного коэффициента поглощения цинарозида (Е1 % 145). Различия значений, рассчитанных
двумя способами, не превышают 3 %.
Оценку правильности разработанной методики проводили с использованием общепринятого метода добавок [8]. Относительная ошибка методики при этом не превышала 5 %. Средняя ошибка трех определений для трех образцов находится в пределах 0,92— 1,67 %, что свидетельствует об удовлетворительной воспроизводимости методики.
Метрологические характеристики методики представлены в таблице 1, относительная ошибка единичного определения не превышает 5 %.
Таблица 1
Метрологические характеристики определения суммы флавоноидов в полиэкстракте сухом «3 красных» в пересчете на цинарозид
f X S Р t Ах £, %
9 10,7 0,078 95 2,26 0,055 3,27
Суммарное содержание флавоноидов, определенное с использованием разработанной методики в 9 сериях полиэкстракта сухого, составило 9,8—10,9 %. Следовательно, суммарное содержание флавоноидов в пересчете на цинарозид в полиэкстракте «3 красных» должно нормироваться — не менее 8 %.
Острая токсичность сухого экстракта определялась на белых беспородных мышах-самцах с исходной массой 20,0 ± 1,0 г при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введениях растворенного в воде экстракта. Каждую дозу экстракта испытывали на 10 животных. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней. Регистрировали наблюдаемые признаки интоксикации, проводили вскрытие и осмотр погибших животных. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении больших доз сухого экстракта «Флаворен» белым мышам наблюдаются признаки интоксикации, выражающиеся в замедлении ориентировочной реакции, резких движениях, появлением тонических, а затем тонико-клонических судорог. Животные погибали при явлениях сердечно-сосудистой недостаточности преимущественно в течение суток от введения экстракта. LD50 по Керберу при внутрибрюшинном введении полиэкстракта «флаворен» 385,5 мг/кг. При внутрижелудочном введении данного средства в максимально возможной дозе, гибели животных не регистрировали, и не наблюдалось явных признаков интоксикации. Эти данные позволяют отнести испытуемый полиэкстракт к группе малотоксичных веществ по классификации Сидорова [9].
При исследовании влияния «Флаворена» на функциональное состояние почек крыс было установлено, что испытуемый фитоэкстракт обладает наиболее выраженной диуретической активностью при его использовании в дозе 20 мг/кг (табл. 2).
Таблица 2
Влияние «Флаворена» на диуретическую функцию почек крыс
Группы животных Доза, мг/кг Диурез, мкл / 100 г/ч Увеличение диуреза, %
Контрольная(Н2О) - 216,1 ± 12,43 -
Опытная 1 «Флаворен» 20,0 279,4 ± 14,42* 29,3
Опытная 2 (канефрон) 1,5 мл/кг 248,3 ± 21,15 14,9
примечание: * - здесь и далее, различие значимо по сравнению с данными контрольной группы при р < 0,05.
Как следует из данных, приведенных в таблице 2, на фоне введения фитосредства в дозе 20 мг/кг диурез повышался почти на 30 % по сравнению с данными у крыс контрольной группы. При этом диуретическая активность «Флаворена» в указанной дозе превосходила таковую у препарата сравнения — Канефрона. В дальнейшем эта доза была использована в качестве экспериментально-терапевтической.
Установлено, что увеличение диуреза под влиянием «Флаворена» обусловлено повышением скорости клубочковой фильтрации (СКФ) на 42,5 % и увеличением выведения ионов натрия с мочой в среднем на 28 % по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы, вместе с тем испытуемое средство не оказывает особого влияния на канальцевую реабсорбцию и калийурез (табл. 3).
Таблица 3
Влияние «Флаворен» на СКФ, натрийдиурез и интенсивность канальцевой реабсорбции у интактных крыс
Группы животных Доза, мг/кг СКФ, мкл/100 г/мин №+, мг/мл Интенсивность канальцевой реабсорбции, %
Контрольная (Н2О) - 92,3 ± 5,25 0,93 ± 0,04 96,1 ± 6,15
Опытная «Флаворен» 20 мг/кг 131,5 ± 8,81* 1,19 ± 0,05* 96,5 ± 7,38
Таким образом, разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на цинарозид в полиэкстракте сухом «Флаворен» и установлена его диуретическая эффективность.
литература
1. Беликов В.В., Точкова Т.В. Реакция комплек-сообразования в анализе флавоноидов // Матер.
2 Всесоюз. симп. по фенольным соединениям. — Алма-Ата, 1973. - С. 168-172.
2. Берхин Е.Б. Методы экспериментального исследования почек и водно-солевого обмена -Барнаул, 1972. — 156 с.
3. Большой Агинский чжор (рецептурник). Ксилограф на тибетском языке: Издание Агинского дацана. — XIX в. — 151 л.
4. Вандер А. Физиология почки. — СПб.,
2000. - 256 с.
5. Государственная фармакопея СССР: Вып.
1. Общие методы анализа /МЗ СССР. — 11-е изд., доп. — М., 1987. — 336 с.
6. Дикорастущие полезные растения России / отв. ред. А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская. — СПб.,
2001. — 663 с.
7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 1. — М., 1988. — 624 с.
8. Основы аналитической химии. Кн. 1 / под ред. Ю.А. Золотова. — М., 2002. — 494 с.
9. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах ведения // Токсикология новых промышленных химических веществ. — М., 1973. — Вып. 13. — С. 47 — 51.
10. Федосеева Л.М. Фармакотехнологические исследования листьев бадана толстолистного: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. — Пятигорск, 1988. — 20 с.
11. «Чжуд-ши»: Канон тибетской медицины / Перевод с тибетского, предисл., примеч., указатели Д.Б. Дашиева. — М., 2001. — 766 с.
сведения об авторах
Корнопольцева Татьяна Владимировна - кандидат фармацевтических наук, научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-47-43; e-mail: [email protected])
Гуржапова Анжелика Анатольевна - аспирант ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-47-43).
Асеева Тамара Анатольевна - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая лабораторией медико-биологических исследований ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН, профессор кафедры фармации медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6: тел.: (3012) 43-47-43)
Мондодоев Александр Гаврилович - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии ФГбУн «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670047, г Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-47-43)
