CC BY
138
УДК 615.015.11.07.322:582.918:577.127.4
СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИСТЬЕВ ПЕРВОЦВЕТА ВЕСЕННЕГО ПО ПОКАЗАТЕЛЮ «СОДЕРЖАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ»
Г.М. ЛАТЫПОВА1 В.Н. БУБЕНЧИКОВА2 З.Р. РОМАНОВА1 Д.Ф. ГАЛИМОВА1
1 Башкирский государственный медицинский университет
2 Курский государственный медицинский университет
e-mail: [email protected]
Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях первоцвета весеннего, основанная на цветной реакции аскорбиновой кислоты с фосфорно-молибденовым комплексом.
Проведена валидация методики по показателям правильности, сходимости, воспроизводимости, специфичности, линейно-
Ключевые слова: листья первоцвета весеннего, методика количественного определения аскорбиновой кислоты.
сти.
Листья первоцвета весеннего (лекарственного) (Primula veris L., или P. officinalis (L.) Hill.), семейства первоцветных (Primulaceae) разрешены к применению в качестве поливитаминного пищевого растительного сырья [4]. Существующая отечественная нормативная документация (НД) на листья первоцвета весеннего (ГОСТ 3166-76) оценивает качество сырья по содержанию аскорбиновой кислоты и числовых показателей: влажности, массовой доли общей золы, массовой доли других частей растения и посторонних примесей [2]. ГОСТ 3166-76 предусматривает количественное определение аскорбиновой кислоты титриметрическим методом с использованием 0,001 н раствора 2,6-дихлофенолиндофенолята натрия в кислой среде. Данная методика затрудняет определение аскорбиновой кислоты в связи со сложностью фиксирования точки перехода окраски титранта из-за собственного окрашивания водного извлечения из сырья. Поэтому для количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях первоцвета весеннего нами разработана спектрофотометрическая методика, основанная на цветной реакции аскорбиновой кислоты с фосфорно-молибденовым комплексом, который показал близкие результаты определения в сравнении с титриметрическим методом [3, 5, 6].
Экспериментальная часть. Для разработки методики использовали листья первоцвета весеннего, заготовленные в Курской, Белгородской областях России и в некоторых районах республики Башкорстостан.
Определение оптимальных условий экстракции кислоты аскорбиновой из листьев первоцвета проводили на одном образце сырья.
При разработке методики изучены и определены оптимальные условия экстракции аскорбиновой кислоты из листьев первоцвета: степень измельчения сырья —
1 мм, экстрагент — 40% спирт этиловый, нагревание на кипящей водяной бане — 30 мин., соотношение сырье-экстрагент — 1:100. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышала 4,48 %.
Методика количественного определения кислоты аскорбиновой. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 2,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 40% раствора спирта этилового, колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили при перемешивании на водяной бане в течение 30 мин. Экстракцию 40% спиртом этиловым повторяли еще два раза по 50 мл в течение 30 мин каждый раз. Полученные извлечения объединяли, фильтровали через бумажный фильтр (раствор А). В колбу вместимостью 50 мл помещали 20 мл
раствора А, прибавляли 20 мл 96% спирта этилового, перемешивали и через 10 мин фильтровали через бумажный фильтр (раствор Б). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 10 мл раствора Б и доводили объем раствора до метки, перемешивали (раствор В).
В три колбы вместимостью по 50 мл помещали: в первую 10 мл раствора В, во вторую 10 мл раствора рабочего стандартного образца (РСО) кислоты аскорбиновой и в третью 10 мл воды. В каждую колбу прибавляли по 10 мл раствора натрия фосфорно-молибдата, нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 10 мин и быстро охлаждали под струей холодной воды. Оптическую плотность испытуемого раствора (колба 1) и раствора РСО кислоты аскорбиновой (колба 2) измеряли на спектрофотометре при длине волны 730 нм в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор из третьей колбы.
Содержание кислоты аскорбиновой в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляли по формуле:
D • то • 150 • 40 • 100 ^5 • 10 • 100 • 100
Х= --------------------------------------------,—
Dо • т • 20 • 10 • 10 • 50 • 100 • (100 - Ш) где D — оптическая плотность испытуемого раствора; Dо — оптическая плотность раствора стандартного образца (РСО) кислоты аскорбиновой; т — масса сырья в граммах; то — масса РСО кислоты аскорбиновой в граммах; W — влажность сырья в процентах.
Приготовление раствора РСО кислоты аскорбиновой. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещали около 0,05 г (точная навеска) кислоты аскорбиновой (ФС 42-2668-95), высушенной до постоянной массы при температуре от 100° до 105° С, растворяли в 30 мл воды, доводили объем раствора водой до метки, перемешивали (раствор 1). Срок годности раствора 1—3 суток.
В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 5 мл раствора 1, доводили объем раствора водой до метки, перемешивали (раствор 2). Раствор использовали свежеприготовленным.
Приготовление раствора натрия фосфорномолибдата. В мерную колбу вместимостью 200 мл помещали 0,05 г натрия фосфата двузамещенного (ГОСТ 4172-76), растворяли в 100 мл воды, прибавляли 10 мл кислоты серной концентрированной, 50 мл воды и
0,8 г аммония молибдата. Объем раствора доводили водой до метки и тщательно перемешивали. Срок годности раствора — 3 месяца.
Таблица 1
Результаты анализа модельных смесей с РСО кислоты аскорбиновой
№ Реальное значение измеряемой величины в модельной смеси (кислота аскорбиновая), мг Экспериментально найденное значение (кислота аскорбиновая)
абсолютная величина, мг процент восстановления, %
1 9,00 9,08 100,89
2 9,00 9,16 101,78
3 9,00 8,94 99,33
4 12,00 11,8 98,33
5 12,00 11,89 99,08
6 12,00 11,91 99,25
7 15,00 14,86 99,07
8 15,00 15,07 100,47
9 15,00 14,81 98,73
Средний процент восстановления для 3 концентраций в трех повторностях 99,66
Валидацию методики проводили методом математической статистики по показателям: правильность, прецизионность, специфичность [1].
Правильность методики устанавливали на модельных смесях с РСО кислоты аскорбиновой. Модельные смеси готовили трех концентраций с содержанием кислоты аскорбиновой в % к исходной концентрации 75, 100, 125. Определение проводилось в трех повторностях для каждой концентрации (табл. 1).
Полученный средний процент восстановления для трех концентраций в трех повторностях составил 99,66, что соответствует критериям приемлемости (100±2%).
Таблица2
Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)
Содержание кислоты аскорбиновой в аликвоте, мкг Добавлено РСО кислоты аскорбиновой, мкг Ожидаемое содержание, мкг Полученное содержание, мкг Ошибка, %
абс., мкг отн., %
421,47 50 471,47 475,12 + 3,65 0,77
421,47 50 471,47 473,90 + 2,43 0,52
421,47 50 471,47 466,87 —4,60 0,98
421,47 100 521,47 518,67 +2,80 0,54
421,47 100 521,47 529,19 +7,72 1,48
421,47 100 521,47 530,56 +9,09 1,74
421,47 150 571,47 563,18 —8,29 1,45
421,47 150 571,47 582,19 +10,72 1,88
421,47 150 571,47 560,89 —10,58 1,85
Достоверность методики определения подтверждена опытами с добавками РСО кислоты аскорбиновой. Испытание проводилось на одном образце листьев первоцвета весеннего в 3 концентрациях с добавками РСО кислоты аскорбиновой в трех повторностях (табл. 2).
Таблица 3
Результаты количественного определения кислоты аскорбиновой в разные дни
Образец № Содержание кислоты аскорбиновой, % Стандартное отклонение S Относительное стандартное отклонение RSD, %
1-й день
1 2,54
2 2,58
3 2,47
4 2,49
5 2,55
6 2,59
среднее 2,54 0,04806 1,89
2-й день
1 2,57
2 2,63
3 2,61
4 2,55
5 2,52
6 2,65
среднее 2,59 0,04494 1,74
Относительная ошибка опытов с добавками находилась в пределах случайной ошибки предложенных методик, что свидетельствует об отсутствии ошибки систематической.
Испытания прецизионности (сходимости) проводились в разные дни одним и тем же специалистом на одном образце сырья листьев первоцвета весеннего в шести повторностях с использованием спектрофотометра «СФ-46» (табл. 3).
Относительное стандартное отклонение RSD не превысило 2 %.
Воспроизводимость методики количественного определения проводилась на одном образце листьев первоцвета весеннего в двух лабораториях на приборах «СФ-46» и «СФ-26» в шести повторностях (табл. 4).
Таблица 4
Результаты количественного определения кислоты аскорбиновой в разных лабораториях
Истинное значение определяемой величины
образец № содержание кислоты аскорбиновой, % стандартное отклонение S относительное стандартное отклонение RSD, %
Лаборатория № 1
1 2,61
2 2,65
3 2,58
4 2,59
5 2,64
6 2,71
среднее 2,63 0,04775 1,82
Лаборатория № 2
1 2,72
2 2,69
3 2,76
4 2,70
5 2,67
6 2,79
среднее 2,72 0,04538 1,67
Относительное стандартное отклонение RSD не превысило 3 %.
Специфичность определялась визуально — отсутствие отклика при отсутствии анализируемого вещества. При прибавлении дистиллированной воды (вместо раствора кислоты аскорбиновой) к раствору натрия фосфорномолибдата и нагревании на кипящей водяной бане в течение 10 мин синего окрашивания не наблюдалось.
Линейность методики исследовали в диапазоне концентраций РСО кислоты аскорбиновой от 80 до 120% от теоретического содержания кислоты аскорбиновой в листьях первоцвета весеннего (табл. 5, рис.).
Установлено, что требования к параметрам линейной зависимости выполняются, т.е. линейность методики определяется в диапазоне концентраций от 80 до 120% от теоретического содержания кислоты аскорбиновой. Коэффициент корреляции составляет 0,99889.
Результаты определения линейности валидируемой методики
Оптическая плотность, D Концентрация кислоты аскорбиновой, мкг/мл Коэффициент корреляции у = Ь-х + а
Ь а
0,289 2,4 0,99889 0,107 0,0292
0,318 2,7
0,356 3,0
0,395 3,3
0,429 3,6
Б
Концентрация кислоты аскорбиновой, мкг/мл
Рис. Линейная зависимость оптической плотности раствора от концентрации кислоты аскорбиновой ( D — оптическая плотность)
С помощью данной методики было проанализировано 5 партий сырья по 5 образцов в каждой (табл. 6).
Таблица6
Метрологическая характеристика метода количественного определения кислоты аскорбиновой в листьях первоцвета весеннего
№ п/п п х ср. S2 S Р,% t (Р,0 Ах Е отн., %
1 5 2,12 0,00115 0,034 95 2,78 0,095 4,48
2 5 3,64 0,0005 0,022 95 2,78 0,061 1,67
3 5 2,54 0,00093 0,0305 95 2,78 0,084 3,36
4 5 2,03 0,00088 0,0296 95 2,78 0,082 4,04
5 5 2,09 0,00102 0,0319 95 2,78 0,089 4,26
Данные количественного определения показали, что в листьях первоцвета весеннего содержание аскорбиновой кислоты колеблется от 1,80 до 3,65%.
Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,48%.
В результате проведенных исследований стабильности листьев первоцвета весеннего при хранении (в течение 3 лет) рекомендуем установить норму содержания аскорбиновой кислоты в листьях первоцвета не менее 0,5% [5].
Полученные результаты включены в проект ФС «Первоцвета листья».
Выводы.
1. Разработана методика количественного определения кислоты аскорбиновой в листьях первоцвета весеннего.
2. Проведена валидация методики по показателям правильности, сходимости, воспроизводимости, специфичности, линейности.
Литература
1. Аладышева, Ж.И. Практические аспекты работ по валидации аналитических методик / Ж.И. Аладышева, В.В. Беляева, В.В. Береговых // Фармация. — 2008. — № 7. — С. 9-14.
2. ГОСТ 3166-76. Листья первоцвета весеннего. Технические требования на продукцию, поставляемую на экспорт. —Взамен ГОСТ 3166-46; Введ. 01.07.1977. — М., 1977. — С. 51-53.
3. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. — 11-е изд., доп. — М.: Медицина, 1989. — 400 с.
4. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paeoniaceae — Thimelaeaceae / отв. ред. П.Д. Соколов. — Л. : Наука, 1986. — С.175-176.
5. Романова, З.Р. Фармакогностическое исследование первоцвета весеннего и первоцвета крупночашечного : дис. ... канд. фарм. наук / З.Р. Романова. — Курск, 2010. —138 с.
6. ТУ 9161-037-46865780-03. БАД таблетки «Виратон», рег. уд.
77.99.02.916.Б.000641.0803.
STANDARTIZATION OF PRIMULA OFFICINALIS LEAVES ACCORDING TO THE INDICATOR «ASCORBIC ACID CONTENT»
G.M.LATYPOVA1 V.N. BUBENCHIKOVA2 Z.R. ROMANOVA1 D.F.GALIMOVA1
1 Bashkir State Medical University, Ufa
2 Kursk State Medical University e-mail: [email protected]
Spectrophotometric technique for quantitative determination of ascorbic acid in the leaves of Primula officinalis based on the co- lour reaction of ascorbic acid with phosphoro-molybdenum complex has been developed. Validation of the technique according to such indications as correctness, similarity, reproducibility linearity, speci- ficity has been performed.
Key words: leaves of Primula officinalis, the technique for quan- titative determination of ascorbic acid.
