CC BY
39
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.3
Стабилизация центральной части тропомиозина изменяет чувствительность актин-миозинового взаимодействия к ионам кальция
Д. В. Щепкин1, А. М. Матюшенко2, Г. В. Копылова1, Н. В. Артемова2, С. Ю. Бершицкий1,
А. К. Цатурян3, Д. И. Левицкий2,4*
1Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, 620049, Екатеринбург, ул. Первомайская,
106
2Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33 3Институт механики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Мичуринский просп., 1
4НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40 *Е-mail: levitsky@inbi.ras.ru Поступило в редакцию 23.04.2013
РЕФЕРАТ Показано, что мутации D137L и G126R, стабилизирующие центральную часть молекулы тропомиозина (ТМ), увеличивают максимальную скорость скольжения регулируемых актиновых филаментов в искусственной подвижной системе при высоких концентрациях Са2+ и повышают Са2+-чувствительность актин-миозинового взаимодействия, обеспечивающего такое скольжение. На основе анализа опубликованных данных о структуре комплекса актин-ТМ-миозин высказано предположение, что физиологические эффекты этих мутаций в ТМ могут быть обусловлены влиянием на взаимодействия между центральной частью ТМ и определенными участками головки миозина.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА актин, искусственная подвижная система, миозин, регуляция мышечного сокращения, тропомиозин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИПС - искусственная подвижная система; ТМ - тропомиозин.
ВВЕДЕНИЕ
Тропомиозин (ТМ) является одним из ключевых компонентов регуляторного аппарата тонких филаментов всех типов мышц. Согласно теории «стерическо-го блокирования», лежащей в основе современных представлений о механизме регуляции сокращения скелетной и сердечной мышц, ТМ способен перемещаться по поверхности актинового филамента, открывая или закрывая участки взаимодействия актина с головками молекул миозина [1]. Молекула ТМ представляет собой димер а-спиралей, образующих левозакрученную суперспираль (coiled-coil) [2]. В последнее время накапливаются данные о том, что структура молекулы ТМ далеко не так проста, как считалось ранее. Отмечаются такие необычные, характерные только для ТМ черты структуры, как наличие участков с повышенной конформацион-ной подвижностью. В центральной части молекулы ТМ обнаружены консервативные неканонические остатки, нарушающие coiled-coil-структуру в этой
области, - Asp137 [3] и Gly126 [4]. Замена этих остатков на канонические (мутации D137L, G126R и G126A) приводила к стабилизации центральной части молекулы ТМ, полностью предотвращая расщепление ТМ трипсином по близлежащему Arg133 [3, 4]. Более того, в обеих работах было показано, что стабилизирующие мутации D137L и G126R (но не G126A) вызывают значительное увеличение активности актин-активируемой АТР-азы головок миозина при высоких концентрациях кальция (pCa < 5) при их взаимодействии с актиновыми нитями, содержащими ТМ и тропонин, но при этом не оказывают влияния ни на Са2+-чувствительность АТР-азы, ни на сродство ТМ к актину [3, 4]. В настоящей работе мы более подробно исследовали влияние этих мутаций на регуляторные свойства ТМ, впервые используя для этой цели более чувствительный метод искусственной подвижной системы (ИПС, in vitro motility assay), позволяющий регистрировать скорость движения реконструированных тонких фила-
ментов по поверхности, на которой иммобилизован миозин.
экспериментальная ЧАСТЬ
Рекомбинантный скелетно-мышечный а-ТМ с мутациями D137L и G126R получали, как описано ранее [4], используя в качестве белка дикого типа ТМ, в котором Cys190 заменен на Ala (мутация C190A) [3]. Эксперименты и измерения характеристик скольжения регулируемых тонких нитей в ИПС при разных концентрациях Са2+ проводили согласно описанной ранее методике [5]. Проточную камеру, покрытую изнутри нитроцеллюлозой, загружали раствором миозина из скелетных мышц кролика в концентрации 0.5 мкМ (0.2 мг/мл). Неприсоединившийся миозин отмывали и загружали регулируемые тонкие нити, состоящие из 10 нМ F-актина, меченного родамин-фаллоидином, 0.1 мкМ тропонина и 0.1 мкМ ТМ в буфере, содержащем 25 мМ KC1, 25 мМ имидазол, 2 мМ АТР, 4 мМ MgCl2, 1 мМ EGТА, 20 мМ ДТТ, 3.5 мг/мл глюкозы, 20 мкг/мл каталазы и 0.15 мг/мл глюкозооксидазы, pH 7.5. (Такие условия оптимальны для изучения скорости скольжения реконструированных тонких филаментов в ИПС [6].) Концентрации свободного кальция задавали соотношением EGТА/Са-EGТА, рассчитанным с помощью программы WebMaxC Standard (http://www.stanford.edu/~cpatton/ webmaxc/webmaxcS.htm). Эксперименты проводили при 30°С, скорость скольжения тонких нитей измеряли с помощью программы GMimPro [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕнИЕ
Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что мутации D137L и G126R, стабилизирующие центральную часть молекулы ТМ, не только увеличивают на 20-30% максимальную скорость скольжения регулируемых тонких нитей в ИПС при высоких концентрациях Са2+ (рис. 1А), но и повышают чувствительность скорости скольжения к Са2+, смещая кривую Са-зависимости в сторону более низких концентраций Са2+ (рис. 1Б). Величина pCa50 (т.е. отрицательный логарифм концентрации свободного Са2+, при которой скорость скольжения полумаксимальна) составляла 6.06 ± 0.04 (здесь и далее приведены средние значения ± ошибка среднего) для регулируемых тонких филаментов, содержащих контрольный ТМ с мутацией C190A, 6.36 ± 0.05 для филаментов, содержащих ТМ с мутациями D137L/d90A, и 6.42 ± 0.03 для филаментов с мутациями ТМ G126R/d90A. Таким образом, нам впервые удалось показать, что стабилизирующие мутации D137L и G126R в центральной части молекулы ТМ заметно повышают Са2+-чувствительность актин-миозинового взаимодействия, лежащего
Л
и
О
О.
0 X и
К
К
1 *
Ф
а
и
и
О
а
0 * и к ш
1 .0 ц
ф
н
X
и
0
1
pCa
Рис. 1. Зависимость средней скорости скольжения регулируемых тонких нитей по поверхности, покрытой миозином, от концентрации Са2+. А — Средние данные по 2-3 экспериментам с каждым из мутантов ТМ. Вертикальные линии - среднеквадратичные отклонения. В — Нормализованные зависимости для данных, представленных на части А
в основе молекулярного механизма мышечного сокращения и регулируемого изменениями концентрации Са2+ в мышечном волокне. Данные об увеличении скорости скольжения нитей в ИПС (рис. 1А) хорошо коррелируют с увеличением скорости АТР-азы миозина в присутствии регулируемых тонких нитей
Б
с мутациями D137L и G126R в центральной части ТМ при насыщающей концентрации Са2+ [3, 4].
Для интерпретации результатов мы избрали новый подход, основанный на анализе недавно опубликованных данных о структуре комплекса актин-ТМ-миозин, полученной с разрешением 8 А методом криоэлектронной микроскопии [8]. Важной особенностью этой структуры являются непосредственные контакты между молекулой ТМ, расположенной на поверхности актинового филамента, и определенными участками головки миозина. Поскольку эта структура была получена с использованием немышечного миозина-I, мы при построении нашей модели (рис. 2) заменили участки взаимодействия с ТМ в миозине-I на соответствующие участки головки миозина-II скелетных мышц, использованного в наших опытах. При построении модели мы искали те остатки в головке миозина, которые находятся достаточно близко от остатков в положениях 126 и 137 в центральной части ТМ и могли бы вступать с ними во взаимодействия. Результаты этого поиска представлены на рис. 2. Оказалось, что остаток Gly126 не способен к каким-либо взаимодействиям с миозином, однако вследствие мутации G126R остаток Arg126 в ТМ оказывается вблизи от остатка Lys399 в головке миозина, и между положительно заряженными атомами этих остатков возникнет электростатическое отталкивание (рис. 2А). В пользу такой интерпретации свидетельствует тот факт, что замена остатка Gly126 в ТМ не на заряженный Arg, а на маленький и гидрофобный Ala не влияла на АТР-азную активность миозина в комплексе с регулируемыми актиновыми филаментами [3]. С другой стороны, отрицательно заряженный остаток Asp137 находится близко от положительно заряженного остатка Arg371 в головке миозина и вступает с ним в электростатическое взаимодействие (рис. 2Б), которое нарушается при замене остатка Asp137 на остаток лейцина вследствие мутации D137L.
Таким образом, в обоих случаях мутации в центральной части ТМ должны приводить к уменьшению энергии взаимодействия ТМ с головкой миозина, прочно присоединенной к актину. Величина такого уменьшения энергии мала по сравнению с энергией прочного связывания миозина с актином [8], но сопоставима с энергией, нужной для перемещения ТМ по поверхности актинового филамента. Согласно теории «стерического блокирования» [1, 9], в отсутствие Ca2+ тропонин удерживает ТМ в положении, в котором он закрывает участки связывания на актине от миозина. При повышении концентрации Ca2+ тропонин отсоединяется от актина и ТМ смещается, приоткрывая эти участки. Головки миозина вначале присоединяются к актину «слабо» и непрочно, а за-
Л
Рис. 2. Структурная модель области контакта мио-зиновой головки с ТМ на поверхности актинового филамента при прочном связывании миозина с актином. Показаны только участки миозиновой головки, прилегающие к аминокислотным остаткам 126 (Л) и 137 (Б) в центральной части ТМ (актин и остальные части миозина и ТМ не показаны). Модель получена из структуры комплекса актин-ТМ-миозин ([8], код pdb 4A7H) встраиванием верхнего 50-кДа домена головки миозина-II быстрых скелетных мышц цыпленка (код pdb 2MYS) вместо головки миозина-I. Сегменты двойной а-спирали ТМ показаны голубыми лентами, участки головки миозина-I, использованного в работе [8], - красным, а участки головки скелетномышечного миозина-II - зеленым. В атомном представлении показаны остатки R126 в ТМ с мутацией G126R (Л) и «неканонический» остаток D137 в молекуле ТМ (Б), замененный на Leu в мутантном белке D137L/C190A, а также заряженные остатки миозиновой головки К399 (Л) и R371 (Б), расположенные в непосредственной близости от этих остатков ТМ. Расстояния между заряженными атомами остатков K399 в миозине и R126 в ТМ (Л) составили в модели 8.8 А, а между R371 миозина и D137 в ТМ (Б) - 4.7 А. Модель и рисунок приготовлены с помощью программы ICM-Browser (MolSoft, Калифорния, США)
Б
тем переходят в состояние «сильного» связывания и еще дальше смещают тяжи ТМ, освобождая все больше мест связывания миозина на соседних мономерах актина. Судя по нашим данным, исследованные мутации в центральной части ТМ усиливают его смещение по поверхности актиновой нити в результате прочного связывания миозиновой головки и соответственно дают возможность большему количеству соседних миозиновых головок присоединиться к актину и совершать работу. Именно этим можно, по-видимому, объяснить заметное влияние
таких мутаций в молекуле ТМ на скорость и Са2+-чувствительность скольжения регулируемых акти-новых филаментов в ИПС. •
Работа поддержана РФФИ (гранты № 12-04-00411-а, 11-04-00750-а, 11-04-00908-а и 12-04-31328-мол-а, 13-04-40099,13-04-40100, 13-04-40101) и Программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. McKillop D.F.A., Geeves M.A. // Biophys. J. 1993. V. 65.
P. 693-701.
2. Невзоров И.А., Левицкий Д.И. // Успехи биол. химии. 2011. Т. 51. С. 283-334.
3. Sumida J.P., Wu E., Lehrer S.S. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 6728-6734.
4. Nevzorov I.A., Nikolaeva O.P., Kainov Y.A., Redwood C.S., Levitsky D.I. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 15766-15772.
5. Shchepkin D.V., Kopylova G.V., Nikitina L.V., Katsnelson L.B.,
Bershitsky S.Y. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010.
V. 401. № 1. P. 159-163.
6. Homsher E., Kim B., Bobkova A., Tobacman L.S. // Biophys. J. 1996. V. 70. № 4. P. 1881-1892.
7. Mashanov G.I., Molloy J.E. // Biophys. J. 2007. V. 92. № 6.
P. 2199-2211.
8. Behrmann E., Muller M., Penczek P.A., Mannherz H.G., Man-stein D.J., Raunser S. // Cell. 2012. V. 150. № 2. P. 327-338.
9. Lehman W., Craig R. // Adv. Exp. Med. Biol. 2008. V. 644.
P. 95-109.
