CC BY
97
ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (146-147), 2011
SSR-АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ДНК ЦМС-ЛИНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА
А.В. Усатов1, Н.В. Маркин1, Ф.И. Горбачен-ко2, М.А. Федорова1, В.Е. Тихобаева1, О.Ф. Горбаченко2, К.В. Азарин1
'НИИ биологии Южного федерального университета, Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1, тел. (863) 243-33-94, e-mail: [email protected].
2ГНУ Донская опытная станция им. Л.А. Жданова ВНИИМК Россельхозакадемии, п. Опорный, Азовский район, Ростовская область
Ключевые слова: полиморфизм, SSR-маркеры, UPGMA-дендрограмма, ЦМС линии подсолнечника
УДК 575.12:633.854.78
Введение. Основной задачей гетерозисной селекции сельскохозяйственных культур является создание гибридов с высокой продуктивностью и комплексной устойчивостью к биоти-
ческим и абиотическим факторам среды. Успех селекции на гетерозис во многом зависит от того, насколько богат генетический потенциал родительских линий, используемых для получения гибридов.
При создании самоопыленных линий подсолнечника первостепенное внимание уделяют селекции автофертильных форм, которые завязывают большое количество семян даже без дополнительного искусственного опыления. На Донской опытной станции им. Л.А. Жданова ВНИИМК путем самоопыления и отбора были получены высокоурожайные линии, отличающиеся выравненностью по основным морфологическим признакам [1]. Лучшие по комбинационной способности были переведены на стерильную основу Н. petiolaris, которая легко передает мужскую стерильность создаваемым аналогам и обеспечивает высокую за-вязываемость семян не только под изоляторами, но и при свободном цветении. В настоящее время на станции получены и включены в селекционную программу экспериментальных гибридов несколько десятков ЦМС линий.
С введением ДНК-маркеров в практику биологических исследований, появились новые возможности изучения генетического разнообразия организмов [2; 3]. С целью интенсификации и снижения трудоемкости селекционного процесса для получения перспективных гибридных комбинаций в настоящее время проводят анализ полиморфизма ДНК инбредных линий различных культур. В частности, SSR, или микросателлитный анализ, эффективен для решения такого рода задач [4; 5; 6]. Микроса-теллитные локусы в основном представлены некодирующими участками ДНК и, следовательно, не попадают под прямое действие естественного отбора. В них накапливаются мутации, что и обусловливает высокий уровень полиморфизма. Чаще всего микросателлитные локусы обладают кодоминантным типом наследования. Идентификация сортов подсолнечника с помощью микросателлитов, впервые проведенная Брюнелем [7], показала, что мик-росателлитные локусы, представленные множественными аллелями и характеризуемые сравнительно высокой гетероген-ностью, являются удобным и перспективным инструментом для анализа полиморфизма геномной ДНК.
В связи с этим целью работы является исследование с помощью микросателлитного анализа полиморфизма геномной ДНК ЦМС-
линий подсолнечника ДОС ВНИИМК, а также составление их генетических паспортов.
Материалы и методы. Объектом исследования служил селекционный материал Донской опытной станции масличных культур им. Л.А. Жданова ВНИИМК, представленный ЦМС линиями подсолнечника (табл. 1).
Геномную ДНК выделяли из первой пары настоящих листьев проростков по методу Р. Бума [8] c нашими модификациями. В SSR-анализе использовали одиннадцать пар прай-меров, отобранных нами по данным литературы и в результате предварительных исследований (табл. 2) [9; 10].
Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgSO4, 0,1 мМ мер-каптоэтанола, 0,25 мМ каждого дНГФ (дАTФ, ДЦГФ, ДГГФ, ДГГФ), по 10 пМ праймеров; 2,5 ед. Taq-полимеразы, SO нг выделенной ДНК. Амплификацию проводили в термоцик-лере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия).
Tермальный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклео-тидного состава. Для большинства проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 96 С в течение 2 мин, затем SO циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 55-60 С в течение 4O сек, элонгация - 1 мин при 7O С, денатурация при 94 С - SO сек, финальная элонгация - 2 мин.
Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 2 % агарозном геле с бромистым этидием (1 мкг/мл), используя трис-боратный буфер. После окончания электрофореза гели переносили на трансиллюминатор и фотодокументировали с помощью видеосистемы (GelDoc 2000, BioRad, США). В качестве маркеров массы использовали набор маркеров GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) и pUC Mix Marker, 8 (Fermentas).
Индекс полиморфного информационного содержания (PIC) вычисляли по формуле:
PICi = 1 - j=iPji2,
где Р - частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов [11].
Анализ генетического сходства образцов подсолнечника производили с использованием коэффициента Жаккарда. Дендрограмму строили с помощью метода иерархического кластерного анализа (UPGMA).
Таблица 1 - Характеристика ЦМС - линий подсолнечника по селекционно ценным признакам Донской опытной станции ВНИИМК
ДОС ВНИИМК, 2000 - 2010 гг.
Название линии Годы испытания Вегетационный период, дни, от всходов до Урожайность семян, ц/га Маслич- ность, % Лузжис- тость, % Масса 1000 семян, г Высота растения, см Диаметр корзинки, см
цветения созревания
ВД 255 2000-2008 53 87 9,6 39,1 23,6 52,4 91 12,7
ВД 22 2001-2010 56 90 12,2 41,3 26,9 50,7 76 11,3
ВД 149 2000-2008 55 88 9,4 41,8 22,0 50,9 90 12,2
ВД 356 2000-2010 60 92 11,8 46,0 23,3 58,9 129 12,3
ВД 350 2000-2010 59 91 11,8 47,2 22,9 61,2 116 11,9
ВД 354 2000-2010 55 88 8,4 44,5 25,4 55,3 102 10,7
ЭД 869 2001-2010 56 91 11,5 44,5 23,5 59,2 92 12,0
ВД 151 2000-2010 57 90 10,3 46,7 20,9 62,3 103 10,9
ВД 344 2001-2010 61 87 12,0 49,9 21,6 54,7 132 15,0
ЭД 95 2001-2010 55 89 14,1 43,3 25,3 59,1 117 14,2
ЭД 77 2003-2010 59 94 11,6 40,8 22,7 44,9 115 12,3
ВД 1448 2000-2010 62 97 11,2 50,3 22,0 57,7 133 10,5
ЭД 73 2009-2010 53 88 13,4 43,5 24,7 57,4 115 12,8
Таблица 2 - Праймеры, использованные в SSR-анализе
Название локуса Повтор Последовательность фланкируюшдх праймеров 5D-3 □ Кол-во аллелей PIC* Размер амплифи-цированных фрагментов, п.н.
Ha 432 GT CTT TAT CCC CCA CCC CCT CC GGG TTT AGT GGC CAG TAG TTG TC 4 0,73 180-690
Ha 1442 ATT GCT TAT GTG CTT ACG TGT TCC TG CTA AAC AGT TCG GCG AGT GTA GG 5 0,67 170-240
Ha 1608 ATT GAT CTT AGG TCC GCC AC GAT GGC ATT TGG CTA GAC 3 0,52 220-250
IUB 4 AT GGC CAT GAT TTA TTC ACT CAG ACA GAT GAG AGG CGT TCT CAC 2 0,50 130-190
ORS 509 AT GT CAA CGA AAA GAC AGA ATC GAA A CCG GGA ATT TTA CAA GGT GA 3 0,43 190-210
Ha 514 GA GGT CAA CGG ATT TAG AGT C GTA TTG ATT CCA ACA TCC AG 3 0,63 180-200
IUB 6 GT TCG GTA TCG TTT GCT AAT GG GGT AAC TCT AAA GCT CTG TC 2 0,36 350-370
ORS 6 AGG GTG GAG AGA GGT GTA GAG AGC CAC CCC TCA CCC TGA CAC 2 0,21 250-260
Ha 1287 GA GAT ATG AGC CCA TCA CTC ATC GAA GAT ATG TCA GGT CAC ACC C 5 0,72 220-510
HNCA 2 GT TGA GAC AAG CAT AAG CAC TAG ACA AGA CAA GGG ACT 2 0,36 210-340
OSU 1 GGG ACA AGT CGG CTG GTG AGC ACA TGA AAC ACG AGC TAA ACC A 4 0,70 150-160
Среднее значение 3,2 0,53
*PIC - индекс полиморфного информационного содержания.
Результаты и обсуждение. В результате 88Я-анализа 16-и ЦМС линий подсолнечника были получены специфические и хорошо воспроизводимые фрагменты ДНК. Для каждой линии определены индивидуальные спектры, различающиеся числом ампликонов, их размерами и степенью выраженности на электрофореграммах (рис. 1).
В результате исследования по 11 микроса-теллитным локусам было выявлено 35 аллелей. Их число на локус варьировало от 2 до 5, а размеры амплифицированных фрагментов находились в пределах от 130 до 690 п.н.
Основным показателем информативности микросателлитных локусов является индекс полиморфного информационного содержания (PIC).
Ml 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 И 12 M 13 14 15 16 M
3«
Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов амплификации геномной ДНК ЦМС-линий подсолнечника с праймером На 1442. Цифрами обозначены пробы согласно таблице 3; М - маркер массы
Таблица 3 — Генетические формулы ЦМС-линий подсолнечника
№№ п/п Формы Формулы*
1 ВД 1448 A3B2C1C3C4D1E1E3F2G2H3I3J0K1L1L2
2 ЭД 169 A1A3B3C1C3C4D2E1E3F2G2H2I2J4K1L1L2
3 ВД 344 A3B1C1C3C4D2E2E3F2G2H2I0J 0K1L1L2
4 ВД 22 AJA2A3B3CAC4DJEJE3F2G2H2I3J0KJLJL2
5 ЭД 869 A1A2A3B3C1C2D1E1E3F2G2H3I1J4K1L1L2
6 ВД 151 A1A3B3C1C3C4D2E1E3F2G2H2I2J3K1L2
7 ЭД 236 A^ACA^E^H^^
8 ЭД 77 A1A2A3B3C1C3C4D1E2E3F2G2H2I1J4K1L1L2
9 ЭД 95 A2A3B2C1C3D1D2E1E3F2G2H1I1J0K1L1L2
10 ВД 354 A2A3B3C1C3D1E2E3F2G2H2I3J3K1L1L2
11 ВД 255 A1A3B2C1C3D1E2E3F2G2H3I3J1J2K1L2
12 ВД 350** A3B1C1C3C4D1E1E3F1G2H2I1J4K1L1L2
13 ВД 356** A3B1C1C3C4D1E1E3F1G2H2I1J4K1L1L2
14 ВД 149 A1A3B2C1C3C4D2E2E3F1G1H2I2J0K1L2
15 ЭД 73 A2A3B3C1C2C4D2E1E3F1G1H3I2J4K1L1L2
16 ЭД 931 A1A3B2C1C3C4D1E2E3F2G2H2I3J0K1L1L2
*Примечание: код праймера A-Ha 432; B-Ha 514; C-Ha 1442; D-Ha 1608; E-IUB 4; F-IUB 6; G-ORS 6; H-ORS 509;I-OSU 1; J-Ha 1287; K-HNCA 1; L-HNCA 2. **Генетические формулы оказались сходными.
Этот показатель характеризует дискриминационную силу локуса не только по количеству выявленных аллелей, но и по относительным частотам их встречаемости. Значение PIC приближается к единице, если локус имеет множество аллелей с приблизительно равной частотой встречаемости, и равен 0, если локус мономорфный [11].
Для отобранных нами локусов значения PIC варьировали от 0,21 для праймера ORS 6 до 0,73 для Ha 432 (табл. 2). Праймер HNCA 1 по результатам предварительных исследований оказался мономорфным (PIC равен 0) и был исключен из данной маркерной системы [9]. Значения PIC для локусов ORS 6, ORS 509, IUB 6 и HNCA 2 находятся в пределах 0,21-0,43, что достаточно для идентификации и паспортизации изучаемых форм. Остальные 7 локусов с показателями PIC более 0,5 наиболее эффективны для дифференциации изученной группы генотипов.
В результате проведенного SSR-анализа для каждого генотипа подсолнечника на основании полученного набора аллелей микросателлит-ных локусов были составлены молекулярно-генетические паспорта (табл. 3), или генетические формулы их генотипов. Большими буква ми латинского алфавита обозначены прайме-
ВД149
Рисунок 2 - Дендрограмма генетического сходства 16-ти ЦМС линий подсолнечника, построенная по результатам SSR-анализа
ры, нижний индекс определяет аллельное состояние локуса, который он маркирует.
В данной маркерной системе ЦМС-линии ВД 350 и ВД 356 по набору аллелей оказались идентичными, поэтому для их идентификации необходим дополнительный поиск ДНК маркеров.
На основании полученных данных была построена ИРОМЛ-дендрограмма, отражающая генетическое сходство между изученными генотипами подсолнечника.
Заключение. В результате анализа полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома 16-и генотипов ЦМС-линий (селекционный материал ДОС им. Л.А. Жданова ВНИИМК) определены 35 аллельных вариантов. Для каждого генотипа построена аллельная формула, которая может быть использована в качестве его молекулярно-генетического паспорта.
Дискриминационный потенциал изученной маркерной системы для идентификации и паспортизации ЦМС-линий культурного подсолнечника оказался достаточно высоким. Однако из-за генетического сходства по изученным мик-росателлитным локусам двух ЦМС-линий необходим дополнительный подбор 88Я-маркеров.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Федеральной целевой программы Министерства образования и науки РФ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной Ро-сии» (2009-2013)» № 141-005-066.
Список литературы
1. Горбаченко,Ф.И. Селекция подсолнечника на Дону / Ф.И. Горбаченко, О.Ф. Горба-ченко // Фундаментальные исследования. -2005. - № 2. - С. 11-15.
2. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов // Генетика. -2005. - Т. 41. - № 4. - С. 480-492.
3. Dong, G.J. Studying genetic diversity in the core germplasm of confectionary sunflower (Helian-thus annuus L.) in China based on AFLP and morphological analysis / G.J. Dong, G.S. Liu, K.F. Li // Genetica. - 2007. - V. 43. № 6. - P. 627-635.
4. Solodenko, A. Genotyping of Helianthus based on microsatellite sequences / A. Solodenko, Yu. Sivolap // Helia. - 2005. - V. 28. - I. 42. - P. 19-26.
5. Goodfellow, P.N. Viewpoint: microsatellites and the genetic maps / P.N. Goodfellow // Current Biology. - 1993. - V. 3. - P. 149-151.
6. Гучетель, С.З. Микросателлитные локусы как маркеры для идентификации и сертификации линий и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК / С.З. Гучетель, ТА. Челюстникова, Т.С. Антонова, С.А. Рамазанова // Масличные культуры. - 2007. - № 2. - С. 27-32.
ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (146-147), 2011
7. Brunei, D. A microsatellite marker of He-lianthus annuus L. / D. Brunei // Plant Mol. Biol. -1994 - V. 24. - P. 397-400.
8. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C.J.A. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wer-theim-Van Dillen, Van Der Noordaa J // J. Clin. Microb. - 1990. - V. 28, № 3. - P. 495-503.
9. Тихобаева В.Е. SSR-анализ геномной ДНК культурного подсолнечника // Сб. материалов 6-й межд. конф. молодых ученых и специалистов «Инновационные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур», посвященной 125-летию со дня рождения В.С. Пустовойта» ВНИИМК, Краснодар, 24-25 февраля, 2011. - С. 303-306.
10. Маркин, Н.В. Полиморфизм геномной ДНК однолетних видов подсолнечника / Н.В. Маркин, В.Е. Тихобаева, М.А. Тихонова, В.А. Гаврилова, Т.Т. Трифонова, А.В. Усатов // Масличные культуры. - 2010. - Вып. 2 (144-145). - С. 3-7.
11. Рамзанова С.А. Технология генотипиро-вания сои на основе SSR-локусов ДНК / С.А. Рамзанова, С.З. Гучетель, Т.А. Челюстникова, Т.С. Антонова // Масличные культуры - 2009. - Вып. 2 (141). - С. 91-95.
