Среды и условия культивирования Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) для получения биомассы с максимальной активностью фермента салицилатгидроксилазы Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Известия Тульского государственного университета Серия Естественные науки 2008. Выпуск 1. С. 197-203

ХИМИЯ ----

УДК 543.9

Е.П. Власова, К.В. Петриков, И.Ф. Пунтус,

О.Н. Понаморева, В.А. Алферов

Тульский государственный университет,

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино

СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ PSEUDOMONAS SP. 142NF(PNF142) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ С МАКСИМАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ФЕРМЕНТА САЛИЦИЛАТГИДРОКСИЛАЗЫ

Аннотация. Определена удельная активность салицилатгидроксилазы в бесклеточных экстрактах при различных условиях культивирования штамма Pseudomonas sp. 142NF (pNF142). Подобрана среда и предложен оптимальный режим для наработки биомассы с максимальным выходом белка и высокой активностью салицилатгидроксилазы - культивирование штамма в ферментере с богатой средой с добавлением салицилата в качестве индуктора синтеза ферментов.

Введение. Способность микроорганизмов окислять ароматические соединения была отмечена уже очень давно. Однако проблема микробиологического окисления этих соединений до сих пор находится в центре внимания исследователей. Это объясняется, с одной стороны, теоретическим интересом, связанным с пониманием механизмов микробного разложения стабильных в химическом отношении ароматических структур, а с другой - вопросами практического характера, касающимися защиты окружающей среды.

Микроорганизмы играют ведущую роль в природном углеродном цикле, так как микробная деградация ароматических соединений приводит к высвобождению углерода из кольцевых структур и, таким образом, к вовлечению его в биологический круговорот. В настоящее время в природный

© Власова Е.П., Петриков К.В., Пунтус П.Ф., Понаморева О.Н., Алферов В.А., 2008

круговорот углерода кроме кольцевых структур биологического происхождения вовлекается значительное количество ароматических соединений, попадающих в биосферу в виде отходов промышленности и в качестве химических средств защиты растений. Многие из этих соединений, включая и полициклические углеводороды, являются физиологически активными и, следовательно, возможная аккумуляция их в биосфере представляет серьезную опасность для живых организмов, а микробный катаболизм абиогенных ароматических соединений приводит к их детоксикации. Для успешного использования микроорганизмов с целью очистки окружающей среды требуется детальное изучение их катаболических путей, а также ключевых ферментов, катализирующих деструкцию полициклических ароматических углеволородов (ПАУ).

Одной из ключевых реакций в деградации ароматических соединений является превращение исходных соединений в соответствующие дигидрокси-лированные ароматические соединения, за которым следуют реакции, приводящие к разрыву ароматического кольца, т.е. образованию алифатических соединений. Последние в свою очередь легко катаболизируются с образованием обычных нетоксичных клеточных метаболитов, таких как ацетил СоА, пируват, сукцинил СоА. Реакции, приводящие к формированию ароматических диолов, в большинстве случаев требуют активности ферментов, относящихся к подклассу флавинсодержащих монооксигеназ, которые также носят название гидроксилаз.

Расщепление нафталина происходит через образование салициловой кислоты, которая окисляется далее через катехол. Катехол расщепляется по двум альтернативным путям: 1) мета-пути с образованием ацетальдегида и пирувата или 2) орто-пути с образованием сукцината и ацетата [1]. Окисление салициловой кислоты через гентизат происходит гораздо реже [2].

Салицилатгидроксилаза катализирует декарбоксилирование и одновременное гидроксилирование салицилата в присутствии НАДН, приводящее к образованию катехола. Фермент является флавопротеином.

Исследование салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas putida BS202 показало, что она обладает широкой субстратной специфичностью [3], поэтому изучение ферментов биодеградации нафталина штамма Pseudomonas

sp. 142NF (p.XFl 12). и, в частности, салицилатгидроксилазы, необходимо для установления причин различных свойств микроорганизмов с структурно аналогичными плазмидами.

Помимо решения теоретических вопросов исследование ферментов биодеградации нафталина представляет и практический интерес. Фермент сали-цилатгидроксилаза может быть использован в качестве рецепторного элемента в биосенсорных системах для детекции широкого спектра ароматических соединений в мониторинге объектов окружающей среды и биотехнологических процессах.

Методика эксперимента

В работе использовался штамм Pseudomonas sp 142NF (p.XFl 12) из коллекции лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.

Бактериальные клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе. Активности ферментов в полученном бесклеточном экстракте определяли спектрофотометрически [4]. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [5].

Результаты и их обсуждение.

Измерение активности салицилатгидорксилазы при различных способах культивирования микроорганизмов.

Культуру выращивали в колбах на минимальной среде с нафталином или салицилатом в качестве единственного источника углерода, а также на богатой среде в ферментере с добавлением салицилата или дизельного. В качестве минимальной среды использовали среду Эванса [6]. Выращивание проводилось в колбах при температуре 20 С. при перемешивании.

Выращивание микроорганизмов в ферментере АНКУМ-2М объёмом 10 л с коэффициентом заполнения 0,6-0,7 проводили в следующих условиях.

Среда : кислотный гидролиза !' казеина (КГК) - 10 г/л; дрожжевой автолизат (ДА) - 70 г/л; (ХН 1 )S() 1 - б г/л; К2НРО i - 12 г/л; глюкоза - 20 г/л; MgSO 1 - 0,3 г/л; MnSO 1 - 0,05 г/л; СОФЭКСИЛ - 0,8 мл/л; воды до б л. Стерилизовали при 0,8 атм, 116 ° С, 40 мин.

Режим культивирования: температура - 28 С; pH = 6,8±0,2; аэрация 3 л/мин от 0 до 4 часов роста; 6,0 л/мин до окончания культивирования (15 часов роста для ферментации с индукцией салицилатом и 25 часов роста для ферментации с индукцией дизельным топливом). В качестве добавок использовали в 1-ой ферментации - салицилат 0,2 г/л, во 2-ой ферментации - дизельное топливо 0,4 мл/л. Добавки вносили однократно в конце логарифмической фазы роста культуры.

Как видно из данных рис. 1, удельная активность салицилатгидроксилазы сравнима при выращивании на среде Эванса с нафталином (0.050±0.00 1 U/мг белка), салицилатом (0,033±0,003) и в ферментере с богатой средой, но

ха

I

ff

й

0,07

0,06

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01

0

1

|-Ь-|

—t—

E+nah E+sal Ферментация Ферментация

с sal с ДТ

Рис. 1. Сравнение активности салицилатгидроксилазы при различных режимах периодического культивирования. Е -минимальная среда Эванса, nah - нафталин, sal - салицилат, ДТ-дизельное топливо

с индукцией низкими концентрациями салицилата (0,064=Ь0,003). Известно, что салицилат является индуктором обоих оперонов деградации нафталина, поэтому закономерно, что активности салицилатгидроксилазы сопоставимы при этих условиях культивирования.

Дизельное топливо добавляют в конце логарифмической фазы роста для индукции синтеза биосурфактантов, однако, как видно из данных, приведенных на рис. 1, оно не индуцирует синтез ферментов биодеградации нафталина.

Удельная активность салицилатгидроксилазы и количества белка в 1 г биомассы при различных условиях культивирования.

При сравнении удельной активности салицилатгидроксилазы (рис. 2) и выхода белка (рис.З) в логарифмической фазе роста при культивировании штамма на минеральных средах и богатых в ферментере с индукцией сали-цилатом или дизельным топливом следует, что выращивание в ферментере на богатой среде с индукцией ферментов деградации нафталина салици-латом позволяет получить культуру с высоким выходом белка (140 мг/г клеток) и максимальной удельной активностью салицилатгидроксилазы порядка 200 и/л.

Из приведенных выше данных (рис,.1) видно, что дизельное топливо не влияет на активность салицилатгидроксилазы, поэтому разница между удельными активностями при культивировании в ферментере на богатой среде с салицилатом и в ферментере с дизельным топливом объясняется эффектом низких концентраций салицилата на регуляторный ген пакЛ.

Рис. 2. Удельная активность салицилатгидроксилазы в зависимости от условия культивирования микроорганизмов Е - минимальная среда Эванса, ДТ-дизельное топливо, nah -нафталин, sal - салицилат

Рис. 3. Количество белка в клетках в зависимости от условия культивирования микроорганизмов Е - минимальная среда Эванса, ДТ-дизельное топливо, nah - нафталин, sal - салицилат

Добавление в среду роста салицилата (или нафталина, который медленно метаболизируется в салицилат за счет низкого уровня конститутивной экспрессии генов na/il-оперона) приводит к активации транскрипции nah-оперонов, опосредованной предсинтезированным NahR-белком. Белок NahR

предположительно связывается с салицилатом и, согласно представлениям в рамках модели позитивной регуляции оперонов, переходит в активную форму активатора транскрипции па/г-оперонов.

Рис. 4. Схема организации и регуляции экспрессии nah-генов плазмиды NAH7. Ген nahR транскрибируется конститутивно. Продукт гена nahR - белок NahR, взаимодействуя с салицилатом, активирует оба nah-оперона. Стрелками указано направление транскрипции [7]

Таким образом, культивирование штамма 142NF (pNF142) в ферментере с богатой средой, но с индукцией салицилатом, является оптимальным для получения биомассы клеток с максимальной активностью салицилат-гидроксилазы для последующего выделения данного фермента.

Вывод. Подобрана среда и предложен оптимальный режим культивирования штамма Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) для наработки биомассы с максимальным выходом белка и высокой активностью салицилатгидрок-силазы - культивирование в ферментере с богатой средой следующего состава: кислотный гидролизат казеина 10 г/л, дрожжевой автолизат 70 г/л, (NH4)S04 6 г/л, К2НРО4 12 г/л, глюкоза 20 г/л, MgS04 0,3 г/л, MnS04 0,05 г/л с добавлением салицилата (0,2 г/л) в качестве индуктора синтеза ферментов в конце логарифмической фазы роста.

Библиографический список

1. Omston L.N. The conversion of catechol and protocatechuate to beta-ketoadipate by Pseudomonas putida. Enzymes of catechol pathway / L.N. Ornston. // J. Biol. Chem. -1966. -V. 166. -P. 9-14.

2. Скрябин Г. К, Старовойтов И. И. Альтернативный путь катаболизма нафталина Pseudomonas fluorescens / Г.К. Скрябин, И.И. Старовойтов. // Докл. АН СССР, -1975. -V. 221. -Р. 493.

3. Измалкова Т.Ю. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorescens /Т.Ю. Измалкова [и др.1. // Микробиология. -2005 -Т. 74. -№ 1. -С. 70-78.

4. Barnsley Е.А. Naphthalene metabolism by pseudomonas: The oxidation of 1,2-dihydroxynaphthalene to 2-hydroxychromene-2-carboxylic acid and formation of 2’-hydroxybenzalpyruvate / E.A. Barnsley. // Biocem. Biophys. Res. Commun. -1976. -V. 72. -P.1116-1121.

5. Bredford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantity of protein utilizing the principle of proteindye binding / M.M. Bredford. // Ann. Biochem. -1976. -V. 72. -P. 248-254.

6. Evans C.G.T. The continiuous cultivation of microorganisms / C.G.T. Evans, D. Herbert, D.B. Tempest. // Construction of a Chemostat. Methods in Microbiology. -1970. -V. 2. -P. 277-327.

7. Yen, K.M. and Serdar, C.M. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads / K.M. Yen, C.M. Serdar. // CRC Crit. Rev. Microbiol. -1988. -V. 15. - P. 247-268.

Поступило 08.02.2008