CC BY
1211. Morfin F., Beguin A., Lira В., Thouvenot D. Detection of measles vaccine in the throat of a vaccinated child. Vaccine. 2002, 20 (11-12): 1541-1543.
12. Nagai Т., Nakayama T. Mumps vaccine virus genome is present in throat swabs obtained from uncomplicated healthy recipients. Vaccine. 2001,19:1353-1355.
13. Narita M., Matsuzono Y., Takekoshi Y. et al. Analysis of mumps vaccine failure by means of avidity testing for mumps virus-specific immunonoglobulin G. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998,5: 799-803.
14. Said M.A., Haile C., Palabindala V. et al. Transmission of vaccinia virus, possibly through sexual contact, to a woman at high risk for adverse complications. Mil. Med. 2013, Dec; 178 (12): el375-1378. doi: 10.7205/MILMED-D-13-00233.
15. Salzman M. В., Sharrar R. G., Steinberg S., LaRussa R Transmission of varicella-vaccine virus from a healthy 12-month-old child to his pregnant mother. J. Pediatr. 1997, 131: 151154.
16. Sawada H., Yano S., Oka Y., Togashi T. Transmission of Urabe mumps vaccine between siblings. Lancet. 1993,342 (8867): 371.
17.Tesovic G., Poljak M., Kocjan B.J. et al. Horizontal transmission of the Leningrad-Zagreb mumps vaccine strain: a report of three cases. Vaccine. 2008, 26 (16): 1922-1925.
18.Vukic B.T., Pavic I., Milotic I., Slavuljica I. Aseptic meningitis after transmission of the Leningrad-Zagreb mumps vaccine from vaccinee to susceptible contact. \&ccine. 2008, 26 (38): 4879.
Поступила 25.11.16
Контактная информация: Отрашевская Елена Викторовна,
127473, Москва, 2 Волконский пер., 10
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
Ф.С.Флуер1, А.В.Кудрявцева2, С.И.Титарев1, И.Б.Быкова3
СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОДУКЦИИ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ И УДАЛЕНИЯ ИХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ
'Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова, 3 Федеральный исследовательский центр питания и биотехнологии, Москва
Цель. Расширение арсенала средств, способных ингибировать продукцию стафилококковых энтеротоксинов (СЭ) и обладающих способностью удалять их из биологических субстратов, а также снижающих рост стафилококков. Материалы и методы. В качестве продуцента СЭ типа А (СЭА) использовали референс-штамм Staphylococcus aureus FRI 722, в качестве продуцента СЭ типа В (СЭВ) — S. aureus S6 715Н. Использовали полиме-тилсилоксана полигидрат (ПМС ПГ) в концентрациях 1,82; 9,09 и 18,2%. Результаты. С помощью метода двойной диффузии в геле и ИФАмы установили, что 18,2% раствор ПМС ПГ (энтеросгель; при содержании полиметилсилоксана полигидрата—70 г, воды очищенной — 30 г на 100 г продукта) является оптимальной концентрацией, приводящей к ин-гибированию продукции стафилококкового энтеротоксина типа А в 100 и более раз, а продукции стафилококкового энтеротоксина типа В — более чем в 300 раз. Заключение. Полиметилсилоксана полигидрат обладает способностью удалять стафилококковые эн-теротоксины типов А и В из биологических субстратов более чем на 50% и существенно уменьшать рост стафилококков.
Журн. микробиол., 2017, № 3, С. 71-77
Ключевые слова: стафилококки, стафилококковые энтеротоксины, полиметилсилоксана полигидрат, ингибирование, адсорбент
F.S.FluerA.V.Kudryavtseva2, S.I.Titarev1,1.B.Bykova3
MEANS FOR INHIBITION OF PRODUCTION OF STAPHYLOCOCCUS ENTERO-TOXINS AND THEIR ELIMINATION FROM BIOLOGICAL SUBSTRATES
'Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, 2Sechenov First Moscow State Medical University, 3Federal Research Centre of Nutrition and Biotechnology, Moscow, Russia
Aim. Expansion of arsenal of means capable of inhibiting production of staphylococci entero-toxins (SE) and having an ability to eliminate them from biological substrates, as well as reducing the growth of staphylococci. Materials and methods. Reference strain of Staphylococcus aureus FRI 722 was used as SE producer type A (SEA), S. aureus S6 715H — as SE type В producer (SEB). Polymethylsiloxane polyhydrate (PMSPH) was used at concentrations of 1.82, 9.09 and 18.2%. Results. By using gel double diffusion method and ELISAwe have established that a 18.2% solution of PMSPH (enterosgel; PMSPH — 70 g, purified water - 30 g per 100 g of the product) is an optimal concentration for inhibition of production of staphylococcus enterotoxin type A by 100 and more times, and production of staphylococci enterotoxin type В — by more than 300 times. Conclusion. PMSPH is able to eliminate staphylococci enterotoxins type A and В from biological substrates for more than 50% and significantly reduce growth of staphylococci.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 3, P. 71-77
Key words: staphylococci, staphylococci enterotoxins, polymethylsiloxane polyhydrate, inhibition, adsorbent
ВВЕДЕНИЕ
Стафилококки продуцируют 23 иммунологически различных типов энте-ротоксинов, имеющих большое значение как факторы патогенности более 100 различных заболеваний, вызываемых стафилококками [9,17]. Энтеротоксины стафилококков (СЭ) обладают полифункциональными свойствами: рвотным действием, пирогенностью, способностью увеличивать токсичность эндотоксинов (липополисахаридов, продуктов грамотрицательных бактерий) в 100 000 раз [13,14,16].
Все СЭ являются суперантигенами и в концентрации от 1 пкг/мл до 1 мкг/ мл могут вызывать активацию до 50% Т-лимфоцитов и выработку ряда интер-лейкинов, которые вызывают интоксикацию и необратимое нарушение нормального функционирования разных систем организма вплоть до летального исхода [12]. СЭ в концентрации 100 нг могут вызывать пищевые отравления. Борьба с СЭ затруднена из-за невозможности создания анатоксинов и проведения вакцинопрофилактики. В связи с этим, основное внимание при борьбе с СЭ уделяется вопросам профилактики попадания энтеротоксигенных штаммов стафилококков и их энтеротоксинов в среду организма человека.
СЭ являются белками с молекулярной массой 25 000 — 30 000 дальтон, обладающими способностью выступать в качестве аллергенов и индуцировать продукцию специфических IgE. Такими свойствами обладают СЭ типов А (СЭА), В (СЭВ) и С (СЭС), эксфолиативный токсин и токсин синдрома токсического шока (ТСТШ-1) [12]. Доказано, что СЭ способны также приводить к выбросу макрофагами и клетками Лангенгарса IL-1, IL-12 и TNFa, являющихся провоспалительными цитокинами, которые способны поддерживать местное аллергическое воспаление при атопическом дерматите [ 15]. Из данных литературы известно об участии токсинов синдрома ТСТШ-1 и СЭВ в развитии тяжелым форм атопического дерматита [8,13].
Одним из важных аспектов борьбы с энтеротоксигенными штаммами стафилококков является поиск благоприятных физиологичных способов удаления стафилококков и подавления продукции ими СЭ.
Известно средство для подавления продукции энтеротоксинов у стафилококков — применение 2,0% раствора свекловичного пектина [11], однако данное средство не обладает способностью удалять СЭ из биологических субстратов.
Кроме того, установлено, что в качестве детоксикационного средства применяется полиметилсилоксана полигидрат (полиметилсилоксана ПГ), представляющий собой продукт нелинейной поликонденсации 1,1,3,3-тетра-гидрокси-1,3-диметилдисилоксана полигидрата в форме пасты для приема внутрь (Энтеросгель. Патент №2293744. Per. № PN003719/02. Свидетельства на товарные знаки №219832 №269595).
Указанный препарат применяется в качестве детоксикационного средства у взрослых и детей при таких заболеваниях, как острые и хронические интоксикации различного происхождения; отравления сильнодействующими и ядовитыми веществами, в т.ч. лекарственными препаратами, алкоголем, алкалоидами, солями тяжелых металлов, и другие острые кишечные инфекции любого генеза в составе комплексной терапии (токсикоинфекции, сальмонел-лез, дизентерия, диарейный синдром неинфекционного происхождения, дис-бактериоз); гнойно-септические заболевания, сопровождающиеся выраженной интоксикацией, в составе комплексной терапии; пищевая и лекарственная аллергия; желтуха (в т.ч. после вирусного гепатита), гипербилирубинемия; хроническая почечная недостаточность (гиперазотемия); профилактика хронических интоксикаций у работников вредных производств.
Полиметилсилоксана ПГ обладает способностью сорбировать вещества с определенной молекулярной массой, но не способен вызывать дисбиоти-ческие нарушения в микрофлоре кишечника, не связывается и не повреждает слизистую оболочку кишечника.
Известно, что полиметилсилоксана ПГ широко используется в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний, вызванных микроорганизмами. Сведений о влиянии полиметилсилоксана ПГ на продукцию СЭ не обнаружено.
Целью исследования является расширение арсенала средств, способных ингибировать продукцию стафилококковых энтеротоксинов и обладающих способностью удалять их из биологических субстратов, а также снижающих рост стафилококков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве продуцента СЭА использовали референс-штамм Staphylococcus aureus FRI722; в качестве продуцента СЭВ использовали референс-штамм S. aureus S6 715Н. Для изучения способности подавления энтеротоксинообра-зования у стафилококков нами исследовано влияние полиметилсилоксана ПГ на продукцию СЭ. Способность подавлять продукцию СЭ исследовали с помощью модельной микробиологической системы, состоящей из штаммов стафилококков, обладающих способностью продуцировать СЭ, питательной среды для культивирования стафилококков и полиметилсилоксана ПГ.
В работе использовали полиметилсилоксана ПГ различных концентраций. Концентрацию выражали, исходя из стандартного содержания: на 100 г продукта — 70 г сухого препарата полиметилсилоксана ПГ и 30 г воды очищенной. В исследовании мы использовали различные концентрации полиметилсилок-
сана ПГ для того, чтобы выявить среди них оптимальную концентрацию этого вещества, обладающую максимально выраженной способностью подавлять рост стафилококков, продукцию СЭ и выведения СЭ из культуральной жидкости — 1,82; 9,09 и 18,2%.
Таблица 1. Влияние различных концентраций ПМС ПГ
на рост S.aureus FRI722 и S.aureus S6 715Н и удаление СЭА и СЭВ из культуральной среды
Исследуемые образцы
Реакция ОП при
преципитации Едо им, в геле разведение 1:30
S.aureus FRI 722 (контроль)
+
0,3
Культивирование стафилококков, продуцирующих СЭ, проводили на специальной жидкой питательной среде с ферментативной казеиновой основой [Флуер Ф.С., 2007].
Контрольный фильтрат культуры S.aureus FRI 722 + 1,82% ПМС ПГ Культуральный фильтрат
+
0,3
S.aureus FRI 722 + 9,09% ПМС ПГ S.aureus FRI722 + 18,2% ПМС ПГ S.aureus S6 715Н (контроль)
S.aureus S6 715Н + 1,82% ПМС ПГ S.aureus S6 715Н + 9,09% ПМС ПГ
+
+
+
0,21 0,19 0,45 0,41 0,4 0,18
Содержание аминного азота s.aureusS67i5H+i8,2%nMcnr - 0,18
в среде — 200 мг/%. В среду добавляли 1,0% сердечно-мозговую вытяжку (Difco, США).
Устанавливали рН среды 7,2. Затем среду разливали по 4,5 мл и стерилизовали 15 мин при 1 атм., 120°С, после чего в пробирки с питательной средой вносили по 0,5 мл суточной культуры стафилококков, содержащей 107 КОЕ/ мл, и асептически вносили полиметилсилоксан ПГ в конечных концентрациях в среде от 10,0% до 20,0%. Выращивание проводили на шутгель-аппарате при непрерывном встряхивании 210 об/мин в течение 24 часов при 37°С. Сразу после посева из каждой пробирки проводили количественные высевы на чашки Петри с плотной питательной средой Baird—Parker с теллуритом калия [5]. Плотность микробных клеток контроля и опытных образцов определяли на спектрофотометре при длине волны Е560 нм.
После окончания культивирования через 24 часа высев повторяли. Затем микробные клетки удаляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 15 минут. Контролем служили те же штаммы стафилококков, культивируемые в тех же условиях, что и опытные образцы, но без добавления полиметилси-локсана ПГ.
СЭ в опытных и контрольных образцах определяли методом двойной диффузии в геле [4] с использованием моноспецифических антиэнтеротокси-ческих сывороток типа А и В [3,10] и иммуноферментным методом с использованием иммуноферментных тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В [1,2].
В частности, нами был проведен сравнительный анализ определения дифференцированного регуляторного воздействия полиметилсилоксана ПГ на способность подавления продукции СЭА и СЭВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Культуру S. aureus FRI 722 (референс, продуцирующий СЭА), S. aureus S6 715Н (продуцент СЭВ) и клинический изолят S. aureus выращивали в питательной среде, содержащей полиметилсилоксана ПГ в концентрации 1,82; 9,09 и 18,2% (табл. 1). После культивирования на чашках Петри выявляли рост стафилококков при различных разведениях препарата. Особый интерес представляло сравнение возможностей ингибирования продукции СЭ, а также способностей выведения СЭ у полиметилсилоксана ПГ. Результаты представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 2. Использование ИФА для исследования влияния различных концентраций ПМС ПГ на рост З.аигеш КШ-722 на продукцию СЭА, Б.аигеив 715Н на продукцию СЭВ и удаление СЭА и СЭВ из культуральной среды
Среда культивирования, штамм-продуцент и концентрация ПМС ПГ Оптическая плотность при Еканм (1/30) Средний положительный титр токсина в реакции ИФА
Контроль S.aureus FRI722 Контроль S.aureus клинический штамм 30 0,3 0,3 СЭА СЭА -1:200 -1:100
9,09% ПМС ПГ + S.aureus FRI 722 9,09% ПМС ПГ + S.aureus клин, штамм 30 0,21 0,22 СЭА СЭА — Без разведения — 1:10 — Без разведения — 1:10
18,2% ПМС ПГ + S.aureus FRI 722 18,2% ПМС ПГ + S.aureus клин, штамм 30 0,19 0,18 СЭА СЭА — Без разведения + — Без разведения +
Контроль S. aureus S6 715Н(Без ПМС ПГ) 0,45 СЭВ - 1:6400
1,82% ПМС ПГ+ S. aureus S6 715H 0,41 СЭВ -1:6400
9,09% ПМС ПГ + S.aureus S6 715H 0,4 СЭВ -1:3200
18,2% ПМС ПГ + S.aureusS6 715Н 0,18 СЭВ—1:10
Как видно из табл. 1, использование 1,82% полиметилсилоксана ПГ не обладает способностью подавлять рост стафилококков. При добавлении в питательную среду полиметилсилоксана ПГ происходило уменьшение количества микробных клеток, а СЭ в препарате не был обнаружен. При применении 18,2% полиметилсилоксана ПГ также наблюдалось уменьшение роста стафилококков и отсутствие СЭ в культуральной жидкости.
Нами также проводились исследования по ингибированию СЭ при использовании полиметилсилоксана ПГ различной концентрации методом ИФА (табл. 2).
Установлено, что в питательной среде с добавлением 9,09% полиметилсилоксана ПГ при выращивании S. aureus происходило частичное подавление роста стафилококков и значительное подавление продукции СЭ. При использовании 18,2% концентрации полиметилсилоксана ПГ в питательной среде как в случае референс-штамма, так и в случае клинического штамма происходило ингибирование продукции СЭА и СЭВ и сорбция СЭА и СЭВ на полиметилсилоксана ПГ; в результате концентрация СЭА в культуральном фильтрате снижалась в 200 раз, а концентрация СЭВ в культуральном фильтрате снижалась в 640 раз (табл. 2).
Нами была предпринята попытка элюировать энтеротоксин из полиметилсилоксана ПГ с помощью 0,1 М глицин-НС1-буфера (рН 3,0), который часто используется в аффинной хроматографии для выделения антител, однако добиться элюции энтеротокси-на таким образом нам не удалось.
При исследовании возможности 18,2% концентрации полиметилсилоксана ПГ сорбировать и выводить СЭА и СЭВ из культуральной жидкости установлено, что полиметилси-локсан ПГ при концентрации в
Таблица 3. Исследование сорбции СЭ типа типа А и В из культуральных супернатантов с помощью ПМСПГ
Исследуемые образцы Энтеротоксигенная активность в ИФА в разведениях
Культуральный супернатант S.aureus FRI 722 1:200-1:400
Культуральный супернатант S.aureus FRI 722 + 18,2% ПМС ПГ (20 часов при 20'С± 2'С) 1:100-1:200
Культуральный супернатант S.aureus S6 715H 1:6400
Культуральный супернатант 1:3200
S.aureus S6 715Н + 18,2 % ПМС ПГ (20 часов при 20"С ± 2'С)
среде 18,2% обладает способностью выводить из культуральной жидкости до 50,0% СЭА и СЭВ. Результаты представлены в табл. 3.
Показано, что 18,2 % концентрация полиметилсилоксана ПГ подавляет продукцию энтеротоксина типа В у штамма S. aureus S6 715Н в 320 — 640 раз. Этот штамм при выращивании в питательной среде без добавления полиметилсилоксана ПГ образует энтеротоксин типа В, который выявляется иммуноферментным методом в разведении 1:3200 — 1:6400. В то же время, этот же штамм, выращиваемый в присутствии полиметилсилоксана ПГ, частично (по сравнению с контролем) продуцировал энтеротоксин, который выявляли иммуноферментным методом всего лишь в разведении 1:10.
Большой интерес отводится препаратам, которые обладают способностью ингибировать рост патогенной микрофлоры, продукцию энтеротоксинов и выведению их из биологических субстратов. Известно, что для ингибирования роста стафилококков и продукции СЭ можно использовать свекловичный пектин [11]. Однако свекловичный пектин не обладает способностью выводить СЭ из биотопов. Из литературы известно, что многие сорбенты (в том числе полиметилсилоксана ПГ), обладают широким спектром противобактери-ального действия. Их используют в медицине при различных заболеваниях [6,7].
Полученные результаты показали, что полиметилсилоксан ПГ в концентрации 18,2% способен ингибировать продукцию СЭА более чем в 100 раз, продукцию СЭВ — более чем в 300 раз. Кроме того, этот препарат, снижая рост стафилококков, выводит из биологических субстратов более 50,0% СЭА и СЭВ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В, Павлова И.П., Шаханина K.JI, Бобкова Е. В., Мельников Н.В. Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа А. ВФС 42-235, ВС 89,1989.
2. Акатов А.К., Флуер Ф.С., Михеева Г.В, Шаханина K.JI. Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа В. ВФС 42-236, ВС 89, 1989.
3. ЕзепчукЮ.В., ФлуерФ.С.,БугроваВ.И., БобковаЕ.В., МельниковН.В., НовиковВ.И. Сыворотка диагностическая к стафилококковому энтеротоксину типа А, сухая для РП в геле. ВФС 42-162, ВС 88,1988.
4. Зильбер А. Реакция двойной диффузии в геле. Иммунохимический анализ. М., Медицина, 1968.
5. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. Пер. с анг. Мир, 1967.
6. Николаева Л.Г. Микробиологические аспекты применения энтеросорбентов при острых кишечных инфекциях. Врачебное дело. 1993, 8: 81-82.
7. Осадчая О.И. Оптимизация оценки клинической эффективности применения деток-сикационной терапии у больных с алкогольным поражением печени. Актуальные проблемы транспортной медицины. 2011, 2 (24): 131-135.
8. Флуер Ф.С., Кудрявцева А.В., Прохоров В.Я., Котосова Л.К., Лазарева А.В., Вертиева Е.Ю. Влияние энтеротоксинов Staphylococcus aureus и epidermidis на течение атопи-ческого дерматита у детей. Педиатрия. Журнал им. Г.Н.Сперанского. 2009, 87 (2): 4348.
9. Флуер Ф.С. Стафилококковые энтеротоксины, их свойства и роль как факторов пато-генности. Журн. микробиол. 2012,2:99.
10. Флуер Ф.С., Бугрова В.И. Получение стафилококковой антиэнтеротоксической сы-
воротки типа В для серотипирования стафилококков. Вопросы питания. 1977, 1:6163.
11. Флуер Ф.С., Меньшиков Д.Д., Лазарева Е.Б., Прохоров В.Я. Влияние различных пектинов на продукцию стафилококковых энтеротоксинов типов А и В. Журн. микро-биол. 2007,6:11-16.
12. Anderson A.L., Sporici R., Lambris J. et al. Pathogenesis of B-cell superantigen — induced immune complex-mediatid inflammation. Infect. Immun. 2006; 74 (2): 1196-1203.
13. Argudin M.A., Mendoza M.C., Rodicio M.R. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins. 2010,2:1751-1773.
14. Bohach G.A., Fast D.J., Nelson R.D., Schlievert RM. Staphylococcal and streptococcal py-rogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit. Rev. Microbiol. 1990, 17:251-272.
15. Breuer К., Wittmann M., Bösche В. etal. Severe atopic dermatitis is associated with sensitization to staphylococcal enterotoxin В (SEB). Allergy. 2000,55: 551-555.
16. Kapsenberg M.L., Hilkens C.M.U., Jansen H.M. et al. Production and modulation of T-cell cytokines in atopic allergy. Inter.Archiv. All. Immun. 1996,110 (2): 107-113.
17. MarrackP., Kappler J. The staphylococcal enterotoxins and their relatives. Science. 1990,248: 705-711.
Поступила 07.10.16
Контактная информация: Флуер Ф.С.,
123098, Москва, ул. Гамалеи, 18
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
Е.Г.Симонова1'2, С.Р.Раичич1, С.А.Картавая], Н.Н.Филатов23 НАДЗОР ЗА БЕШЕНСТВОМ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ
'Центральный НИИ эпидемиологии, Москва; 2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова; 3НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Оценка действующей в Российской Федерации системы эпизоотолого-эпидемиологического надзора, которая демонстрировала свою высокую эффективность в конце прошлого века, а также определение направлений ее совершенствования в современных условиях. Материалы и методы. Данные официальной статистики, результаты эпидемиологической диагностики, данные зарубежных исследований. Для оценки ситуации по бешенству в Российской Федерации в 2000 — 2015 гг. применялись описательно-оценочные эпидемиологические методы, а также материалы проведенных ранее собственных исследований по изучению информированности населения. Результаты. Выявлен характер современной эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бешенству в Российской Федерации. Показано, что, несмотря на снижение числа регистрируемых случаев бешенства среди населения, риск инфицирования сохраняется. В связи с интенсивной миграцией населения, низкой его информированностью, широкомасштабной постэкспозиционной профилактикой меняются клинико-эпидемиологические особенности бешенства, снижающие эффективность надзора. Заключение. Действующая система эпидемиологического надзора за бешенством нуждается в совершенствовании путем изменения организационной структуры, а также оптимизации ее диагностического компонента.
Журн. микробиол., 2017, № 3, С. 77-83
Ключевые слова: бешенство, пре- и постэкспозиционная профилактика, эпидемиологический надзор, диагностика бешенства, факторы риска
