CC BY
3УДК 577.21:595.36
М.А. Сасинович1, А.М. Слуквин1, А.В. Алехнович2
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИЙ ДЛИННОПАЛОГО РАКА (ASTACUS LEPTODACTYLUS ESCH.) В ОЗЕРАХ БРЕСТСКОЙ ОБЛАСТИ
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: marina.sasinovich@yandex.ru; A.Slukvin@igc.by 2ГНПО «Научно-практический центр НАН Беларуси по биоресурсам» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: alekhnovichav@gmail.com
В статье рассматриваются результаты исследования видовой идентификации и генетического полиморфизма по двум митохондриальным генам в популяциях длиннопалого рака в озерах Соминское (Ивацевичский район, Брестской области) и Олтуш (Малоритского района, Брестской области). При оценке видовой принадлежности раков по гену COI мтДНК было установлено, что в обоих озерах обитает вид десятиногих раков — длиннопалый рак (Astacus leptodactylus Esch.) с вероятностью 99%. Показано, что в целом ген COI характеризуется достаточно низкой внутривидовой генетической вариабельностью. Установлено, что у раков из озера Олтуш она была в 1,44 раза ниже, чем у раков из озера Соминское (1,42% и 2,03%, соответственно). Относительно генетической вариабельности гена 16s рРНК был установлен очень высокий уровень полиморфизма в популяциях раков для обоих озер (25,6% для озера Соминское и 60,1% для озера Олтуш), что характерно для генов митохондриального генома среди гидроби-онтов при отборе на адаптацию к экстремальным условиям среды обитания.
Ключевые слова: длиннопалый рак, генетический полиморфизм, ген COI, ген 16s рРНК.
Введение
Изучение генетического полиморфизма у десятиногих раков имеет важное теоретическое и практическое значение, как для оценки биологического разнообразия в популяциях десятиногих раков, определения видового состава, обнаружения гибридных особей, оценки устойчивости раков к болезням, так и для разработки мероприятий по сохранению вида и увеличению промысловых запасов длиннопалого рака в водоемах Беларуси [1].
Анализ литературы по генетическим исследованиям у длиннопалых раков показал, что при проведении работ, основанных на электрофорезе белков, были установлены низкие уровни вариаций в популяциях пресноводных раков [2, 3]. Ранее для проведения генетических исследований у десятиногих использовался RAPD-PCR-анализ, однако результаты такого анализа оказались малоинформативными при оценке генетической гетерогенности в популяциях раков [4-6]. В течение последнего десятилетия были разработаны новые молекулярные
методы, которые позволили обнаружить более высокую степень генетической изменчивости в популяциях пресноводных раков. В большинстве работ генетическая дифференциация популяций раков была оценена с использованием митохондриальной ДНК. Преимущества мтДНК как инструмента в генетических исследованиях популяций широко рассмотрены в литературе [8]. Так, было установлено, что в связи с материнским режимом наследования мтДНК, ее широко используют для исследования генетических различий и эволюционной истории между видами и внутри видов. Важным также является тот факт, что мтДНК способна сохранять историю прошлых изоляций, даже в случае современного привнесения чужеродных групп. Доказано, что мтДНК оказалась превосходным инструментом для изучения популяционной генетики животных, выше или ниже видового уровня [8]. Ряд исследователей считает, что в будущем мтДНК может помочь в определении таксономического своеобразия отдельных групп раков,
расставить приоритеты при реализации программ по сохранению видового разнообразия [9]. В последнее время мтДНК стали использовать как генетический маркер, способный идентифицировать видовую и популя-ционную принадлежность изучаемых гидро-бионтов [10-17]. Польскими учеными было установлено, что для изучения генетической структуры в популяциях десятиногих раков наиболее информативными являются фрагменты генов мтДНК COI (680 п. н.) и 16S рРНК (530 п. н.) [18, 19].
Таким образом, для изучения генетического полиморфизма в популяциях длиннопалого рака в водоемах Брестской области были выбраны последовательности митохондриальной ДНК, а именно, фрагменты гена мтДНК COI (680 п. н.) и 16S рРНК (530 п. н.), которые являются наиболее информативными при проведении таких исследований.
Цель работы — оценка возможности использования двух митохондриальных генов (COI и 16s рРНК) для проведения работ по видовой идентификации и изучению генетического полиморфизма в популяциях длиннопалого рака (Astacus leptodactylus Esch.), обитающих в водоемах Брестской области.
Материалы и методы
Для генетических исследований прижизненным способом отобраны пробы у длиннопа-лого рака из наиболее ракопродуктивных озер Брестской области: Олтуш (Малоритский рай-
он) — 16 проб; Соминское (Ивацевичский район) — 15 проб. Биологический материал отбирали у взрослых особей, помещали с помощью стерильного пинцета в небольшие по объему (1,5 мл) пробирки типа Эппендорф и заливали 96%-ным этанолом. Для выделения ДНК использовался стандартный фенол-хлороформный метод выделения ДНК у десятиногих раков [7, 19]. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли на спектрофотометре IMPLEN spectrophotometer Nanogram (Германия). Спек-трофотометрический анализ степени загрязнения полученных препаратов ДНК белками проводился на основе соотношения коэффициентов поглощения А260/А280 (норма в диапазоне 1,8-2,0). Качество выделенной ДНК проверяли электрофоретически в 2%-ном агарозном геле. Для этого полученный раствор ДНК в количестве 4 мкл наносили на агарозный гель, содержащий бромистый этидий (0,5 мкг/мл). ДНК образца считалась пригодной для дальнейшего анализа, если фракция фрагментов ДНК размером 10-20 kb и более составляла как минимум 20% от общего количества выделенной ДНК.
Все праймеры были синтезированы в ОДО «Праймтех» (Беларусь). ПЦР осуществляли с использованием амплификатора C1000TMThermalCycler (Bio-Rad, США). Для получения целевых фрагментов митохондри-ального гена цитохромоксидазы 1 субъединицы (COI) и гена 16S рРНК были использованы следующие пары праймеров и программы амплификации (табл. 1).
Таблица 1
Отобранные для анализа праймеры и протоколы ПЦР
Название праймера Нуклеотидная по следовательно сть Программа амплификации
LCO1490 forward GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 1. Иниц. денатурация 95° С 90 с 2. Денатурация 95° С 30 с 3. Отжиг 45° С 60 с 5 циклов ф 4. Элонгация 72° С 90 с 5. Денатурация 95° С 30 с 6. Отжиг 55° С 45 с 27 циклов ф 7. Элонгация 72° С 60 с 8. Финальная элонгация 72° С 7 мин
HCO2198 reverse TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
16S-F CCTGTTTANCAAAAACAT 1. Иниц. денатурация 95° С 3 мин 2. Денатурация 95° С 40 с с^ 3. Отжиг 53° С 50 с 30 циклов ф 4. Элонгация 72° С 60 с 5. Финальная элонгация 72° С 5 мин
16S-R AGATAGAAACCAACCTGG
Реакционная смесь для ПЦР составила 10 мкл: 5 мкл буфера DreamTaq PCR Master Mix (2X); 0,2 мкл каждого праймера; 3,6 мкл MiliQ и 1 мкл ДНК-матрицы.
Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле с добавлением флуоресцентного красителя этидиум бромида. Использовали метод горизонтального электрофореза в 1хТАЕ буфере с применением рабочей напряженности электрического поля 7 В/см. Длину амплифициро-ванных фрагментов определяли путем сравнения со стандартом молекулярного веса ДНК Low Range DNA Ladder от 50 bp до 1 kb. Длины, получаемых в ходе реакции ампликонов (ПЦР-фрагментов) составили 680 п. н. и 530 п. н. для COI и 16S рРНК, соответственно (рис. 1 и 2).
Продукты ПЦР сразу после амплификации очищали с помощью ферментов, добавляя в каждый образец по 0,3 мкл экзонуклеазы (Exo1) и по 0,9 мкл фосфатазы (FastAP) и инкубировали при 37° С в течение 30 мин. Для остановки реакции смесь нагревали до 80° С в течение 15 мин.
Для подготовки образцов к секвенированию проводилась терминальная ПЦР. Реакционная смесь для ПЦР составляла 8 мкл: 1,6 мкл буфера BrightDye Terminator (Nimagen, Нидерлан-
ды); 0,8 мкл терминатора BrightDye Terminator (Nimagen, Нидерланды); 3,6 мкл MiliQ; 0,5 мкл прямого праймера и 1,5 мкл продуктов предыдущей ПЦР. Амплификацию терминальной ПЦР проводили с использованием следующей программы: 1 цикл — иниц. денатурация (96° C, 1 мин); 40 циклов — денатурация (96° C, 10 с), отжиг (55° C, 5 с), элонгация (60° C, 4 мин).
Заключительным этапом при подготовке образцов для секвенирования являлась очистка терминатора после ПЦР по следующему протоколу:
1. По 30 мкл 96%-ного спирта в каждую пробирку;
2. По 2 мкл 5М уксусной кислоты, смесь перемешивали на вортексе;
3. 30 мин смесь выдерживали в морозильной камере;
4. Центрифугирование 10 мин, супернатант сливали;
5. По 130 мкл 70%-ного спирта;
6. Центрифугирование 10 мин, супернатант отбирали дозатором;
7. Открытые пробирки помещали в термостат на 45° С до полного высыхания осадка.
Результаты секвенирования анализировали с помощью программы MEGA7.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации гена COI
ä\
.. \
530 bp
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации гена 16s рРНК
Результаты и обсуждение
Сравнение популяций длиннопалого рака озер Олтуш и Соминское по гену COI
Первым этапом в анализе последовательностей было их сравнение с уже известной, имеющейся последовательностью гена COI, размещенной в GenBank. Все 31 экз. образцов были с 99%-ной вероятностью отнесены к исследуемому нами виду Astacus leptodactylus Esch.
Следующим этапом в анализе последовательностей было их выравнивание с помощью программы MEGA7 (рис. 3).
После выравнивания размер последовательности гена COI составил 639 нуклеоти-дов у популяции озера Соминское, а у озера Олтуш — 632 нуклеотида. После выравнивания последовательностей были рассчитаны парные генетические дистанции для каждой популяции.
При расчете внутривидовых генетических дистанций оказалось, что средние значения парных генетических дистанций в обеих популяциях, рассчитанные по белок-кодирующим областям гена COI, имеют невысокие значения и различаются несущественно (оз. Со-минское — 0,003, Олтуш — 0,002). Также не наблюдалось зависимости значения генетиче-
скои дистанции от числа анализируемых последовательностей.
Затем был проведен расчет процентного содержания вариабельных сайтов нуклеоти-дов, а также расчет процентного содержания синонимичных и несинонимичных замен ну-клеотидов. Все расчеты также производились в программе MEGA7. Как видно на рис. 4 в анализируемых последовательностях популяции озера Соминское было обнаружено 13 вариабельных сайтов нуктеотидов из 639.
Процентное содержание вариабельных сайтов рассчитывалось по формуле: I = V х 100% / Д где I — процент вариабельных сайтов; V — число вариабельных сайтов; D — общая длинна последовательности. Таким образом, процент вариабельных сайтов нуклеотидов у раков по озеру Соминское составил 2,03%.
Так как в качестве маркера используется белок-кодирующий ген, необходимо было также рассчитать отдельно число синонимичных и несинонимичных замен. Следует отметить, что в данном случае синонимичные замены нуклеотидов не влияют на получаемый белок. Несинонимичные же замены влияют на структуру получаемого в процессе трансляции белка, поэтому данные мутации
До выравнивания
i 4л
i м
3.94
I 9?
S ?! i эя
7 ЧЮ 5 Ш ВИН
10 103
II 10J 1Í IM
11 IM 1J 107 15 IOS
t. т cc т.т 1*1 S| „Ifi IIIIII
t.-Í.CTTTI.MÍ-í,
feiwR*!
#сс|с|11К*|ал|л*1|*||с|||Шл|сИ*||гс£Кс
_____________ JÜBCBBSfilRmil-AOCTSIFT^I^tAATT-.TTCGeeTT^OfiCI АЧ|ЙТСА«<:»
ncincccH|icRenn-.C.G. г,.: st ее йллссИсЦтЯИКИУХЦ^ИсЦЦЦлЁсВдИЦеЦсс!
№1НН||ч11|л|с|
llili
ins
<TA|äT
ААССЦС ||СС|С
Af8¿4HÍ TT' t Aí|MHíT1' t
---------- --------------------- _ ... --------и
fcíüE
' ггсЩмяВ
(СААСС |ГСАЛСС
дишнни"" у 1и1^димшми>(" i'
■ ■■■«■■■ИЙЙ^ИЧТТ^АЗсКёй^^ТАЙтеВЙАЛССЯСТТТЛАИАЛТЛЛТТДТТСМЙТТЙА^;:!
CT,
Sc А А
VRR11Í|IRRRÍR|í§0||RaRc||r a *т * ет 6 с
X1- с с г ай| a A.f алтт* т i ;p¡eer tcí i Цс t AöttT;. и ас г
■HliRC с | С11R A | IÍ « IRK RR С RR1111 А|С I к |с А lillFlIlrr^RRfl» crlHR.si« Kasengi|HaSKcc|c||t^m«R»Xll^RRcHHHI№Hc|SlBc RRC
После выравнивания
Gröup Нин
I.ÍJ
2
3.fli 1
5 «t i Íí
I tW
5 Щ
3 1Й2
II 103
II. 104 1Г 105 H.1M U 10Í lt. ios
ссст-т.ттс ccclfttrc cccllllc ссс|гтттс сссц||с eco 17 re cccRRRRc есеВИЙЙе
Íf'-TITTC
ecc||||c
СССГТТТС ■■■■
cccISBSc cccRRRRc
ceessasse
ItítT
nú
flltTT
IttT
r f I
RBBR
1ИВ1
SITT
«TT
iimi
IíTt
«Jtx
am 1Я
ATI A
W f .
' I
55
lflll<C||
Л1ЧС A TT * С
- * ' -lcRI
TUT.-I AtÍAtJ
№ CAlSlOlBSSAC СА|ТТ:ГТТТ||*С А|ВПСЦ|В|Ё caRM'THH^C CARRRCRISXAC
c*RIRtRRMiH гв11|с||Щс
cHTÍCTTTile СЦ5ТТ TTTTAC
trill :mi,c =¥RRRCRBBBac
C*|HCR||||AC.
"тилтт. |c||8Rt|R|l RCÍT 41tclT T T'
■ с;- T 1 * |c|l*:§c§RH*
RCRBARCRR.'
RcRlBRc||Sfl
IcHIcfili
«СТТ^ТТГА ВС1ЯАЙСТ!:. T :ТТ*1)С|ТТТА
■ rfSRc|TTi
SIcRIBRcRRRft «|т*Зсо г.
ccRRBlBíf'C 'SSTt:i:r CCRUIRRaRcáRISRCRAR ссцпиАИслейЯс!**:
RR1s г f- с--ФФГ|с t» T ^FRRHÍÜB Rc SRRBRC R Ш c^|||A|c*||||c|#| ec|»ti<¡n|K|c*i»c >!<:«*« cc||||№|c^||||c|№| с с HRIRIRS Re IRillc lili CC||1||R¿|C*||||C|1||
CC¡||U|i|c|flIt3clAt
«^HHBBSBÁRcÁRRSRcRiR
Рис. 3. Выравнивание последовательностей гена COI популяции Astacus leptodactylus озера Соминское
в эволюционном плане более значимы. Необходимо было проверить, какое количество нуклеотидов в кодоне приводит к изменению аминокислоты. В нашем случае к изменению 3 аминокислот привело изменение 3 нуклеотидов в 3 различных кодонах, соответственно, число несинонимичных замен нуклеотидов — 3 из 639.
Расчет процентного содержания несинонимичных замен осуществляется по аналогичной формуле: N = Vn х 100% / D, где N — процент несинонимичных замен нуклеотидов; Vn — число несинонимичных замен нуклеотидов; D — общая длина последовательности. Число синонимичных замен рассчитывается по формуле: £ = I - N, где £ — процент синонимичных замен нуклеотидов. Таким образом, процент несинонимичных замен составил 0,47%, а число синонимичных — 1,57%.
При анализе данных, полученных для раков из популяции озера Олтуш, было установлено, что число вариабельных сайтов нуклеотидов составило 9 из 632 нуклеотидов и 6 аминокислот из 210. Таким образом, процент вариабельных нуклеотидов составил 1,42%, из
которых несинонимичных замен — 0,95%, а синонимичных — 0,47%. На основании полученных результатов можно заключить, что ген COI у Astacus leptodactylus характеризуется низкой внутривидовой вариабельностью. Внутривидовые генетические дистанции по отдельным участкам гена COI существенно не различаются. Нуклеотидные последовательности отдельных участков гена обладают высоким, иногда 100%-ным сходством. В то же время, наличие внутривидовой вариабельности, обеспеченное нуклеотидными заменами, подтверждает применимость этого гена для диагностики не только видов, но и внутривидовых форм. Число вариабельных сайтов нуклеотидов в последовательностях гена COI популяции раков озера Соминское в 1,44 раза выше, чем озера Олтуш, однако процентное содержание несинонимичных замен было в 2 раза выше в популяции рака в озере Олтуш, чем в озере Соминское. При оценке видовой принадлежности раков по гену COI было установлено, что в обоих озерах, обитает вид десятиногих раков — длиннопалый рак (Astacus leptodactylus Esch.) (с вероятностью 99%).
J М7: Sequence Data Explorer Data Display Search Groups
Highlight Statistics
И riËLfl TS ;xL CSV UUC i" V
0Name G W G ETAАХТ Т Т Т А Т
01. 94 И 2. 95 03. 96 04.97
05. 9S 06. 99 07. 1.00 0S. 101
09. 102 010. 103 011. 104 012. 105 013. 106 014. 107 015. 10S . . . .С.........
J M7: Sequence Data Explo-rer Data Display Search Groups
Highlight Statistics
У
-»
CSV
TA
Pht
wuuc
✓ Name Й1. 34 02. 95 ИЗ. 96
04. 97
05. 98
06. 99
07. 100
т_ш_
09. 102 И 40. 103
И 1-ЫМ 012.105 013.1 об у; 14.107 15. 108
TGWTVYP Р LASS ГА
1/639
I Variable: 13/639 |
1/213
Рис. 4. Вариабельные сайты нуклеотидов (справа) и аминокислот (слева) в гене COI популяции озера Соминское
Сравнение популяций озер Олтуш и Сомин-ское по гену 16s рРНК
Так же, как и для гена COI, первым этапом в анализе последовательностей было их сравнение с уже известной имеющейся последовательностью гена 16s рРНК, размещенной в GenBank. Все 31 экз. образцов были с вероятностью 83-95% отнесены к исследуемому виду длиннопалый рак (Astacus
leptodactylus Esch.), однако имелось также и большое сходство с близкородственным видом Astacus astacus. Следующим этапом в анализе последовательностей было их выравнивание с помощью программы MEGA7. Следует отметить, что уже на этом этапе было заметно большое количество нуклеотидных замен и вставок в последовательностях обеих популяций раков (рис. 5).
Рис. 5. Выравнивание последовательностей гена 16s рРНК популяции Astacus leptodactylus озера Соминское
После выравнивания размер последовательности гена 16s рРНК составил 500 нуклеотидов у популяции озера Соминское, а у озера Олтуш — 487 нуклеотидов. После подготовки последовательностей были рассчитаны парные генетические дистанции для каждой популяции.
При расчете внутривидовых генетических дистанций оказалось, что средние значения парных генетических дистанций в обеих популяциях, рассчитанные по белок-кодирующим областям гена, имеют более высокие значения, чем рассчитанные для гена COI, и сильно раз-
личаются между двумя популяциями (оз. Со-минское — 0,052, Олтуш — 0,269).
Следующим этапом анализа был расчет процентного содержания вариабельных сайтов нуклеотидов, а также расчет процентного содержания синонимичных и несинонимичных замен нуклеотидов (рис. 6 и 7).
Процентное содержание вариабельных сайтов рассчитывалось по той же формуле, что и для гена COI. Процент вариабельных сайтов нуклеотидов ДНК раков оказался высоким для обоих озер (25,6% и 60,1% для озер
Рис. 6. Вариабельные сайты нуклеотидов (справа) и аминокислот (слева) в гене 16s рРНК популяции
озера Соминское
Рис. 7. Вариабельные сайты нуклеотидов (справа) и аминокислот (слева) в гене 16s рРНК популяции
озера Олтуш
Соминское и Олтуш, соответственно), что, согласно последним литературным данным, является характерным для генов митохондри-ального генома среди гидробионтов при отборе на адаптацию к экстремальным условиям среды обитания [20]. Дальнейшее вычисление синонимичных и несинонимичных замен ока-
залось уже невозможным, так как процент вариабельности нуклеотидных сайтов оказался слишком высок для этого гена. Наибольшую вариабельность по гену 16s рРНК показала популяция длиннопалого рака в озере Олтуш, что также согласуется с последними литературными данными.
Заключение
При оценке видовой принадлежности раков по гену COI мтДНК было установлено, что в обоих озерах обитает вид десятиногих раков — длиннопалый рак (Astacus leptodactylus Esch.) (с вероятностью 99%). Продемонстрировано также, что в целом ген COI характеризуется достаточно низкой внутривидовой генетической вариабельностью. Установлено, что у раков из озера Олтуш она была в 1,44 раза ниже, чем у раков из озера Соминское (1,42% и 2,03%, соответственно). Относительно генетической вариабельности гена 16s рРНК был установлен очень высокий уровень полиморфизма в популяциях раков для обоих озер (25,6% и 60,1% для озер Соминское и Олтуш, соответственно), что характерно для генов митохондриального генома гидробионтов при отборе на адаптацию к экстремальным условиям среды обитания. Высокие уровни полиморфизма по гену 16s рРНК у длиннопалых раков из озер Соминское (Ивацевичский район) и озера Олтуш (Малоритский район) (при дополнительном исследовании раков из этих озер на наличие возбудителя рачьей чумы, других возбудителей инфекционной и паразитарной природы), дают нам основание полагать, что маточные стада из этих озёр обладают высокой степенью генетического полиморфизма и могут быть пригодны для интродукцирования в другие озера Брестской области, соответствющие оптимальным условиям для обитания длиннопалых раков.
В ходе исследований была адаптирована методика прижизненного отбора биологического материала у длиннопалого рака (Astacus leptodactylus Esch.), а также усовершенствована методика выделения ДНК из мышечной ткани длиннопалого рака.
Впервые в стране был создан банк ДНК и биологических образцов длиннопалого рака (акты от 21.11.2016 г. о передаче биологического материала и ДНК в Республиканский банк ДНК человека, животных, растений и микроорганизмов).
Работа выполнена в рамках задания 2.11 «Изучение генетического разнообразия водных и околоводных беспозвоночных» государственной программы научных исследований «Биотехнологии» 2016-2020 гг., подпрограммы «Структурная и функциональная Геномика».
Список использованных источников
1. Алехнович, А.В. Речные раки Беларуси в современных условиях. Распространение, динамика численности, продукционно-промысловый потенциал / А.В. Алехнович. — Минск: Беларуская навука, 2016. — 302 с.
2. Agerberg, A. Genetic variation in three species of freshwater crayfish, Astacus astacus L, Astacus leptodactylus Esch and Pacifasta-cus leniusculus (Dana), revealed by isozyme electrophoresis / A. Agerberg // Hereditas. — 1990. — Vol. 113. — P. 101-108.
3. Fevolden, S.E. Allozymic variation among populations of noble crayfish, Astacus astacus L., in southern Norway: implications for management / S.E. Fevolden, T. Taugbol, J. Skurdal // Aquat. Fish. Manag. — 1994. — Vol. 25 — P. 927-935.
4. Азизов, А.П. Популяционно-генетическая характеристика длиннопалых раков Astacus leptodactylus (Eschscholtz,1823) Каспийского моря с применением RAPD техники / А.П. Азизов // Доклады НАН Азербайджана. — 2014. — № 1. — С. 1-7.
5. Assessment of genetic variation in wild populations of the redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus, von Martens 1868) by means of allozyme and RAPD-PCR markers / J.M. Ma-caranas [et al.] // Marin Freshwater Res. — 1995. — Vol. 46. — P. 1217-1228.
6. Population genetic structure of the endangered freshwater crayfish Austropotamobius pal-lipes, assessed using RAPD markers / N. Gouin [et al.] // Heredity. — 2001. — Vol. 87. — P. 8087.
7. Schulz, R. Status of the noble crayfish Astacus astacus (L.) in Germany: monitoring protocol and the use of RAPD markers to assess the genetic structure of populations / R. Schulz // Bull. Fr. Pêche Piscic. — 2000. — № 356. — P. 123-138.
8. Avise, J.C. Molecular Markers, Natural History, and Evolution / J.C. Avise. — New York: Chapman and Hall, 1994. — 511 p.
9. Moritz, C. Animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematic / C. Moritz, T.E. Dowling, W.M. Brown // Annu. Rev. Eco. System. — 1987. — Vol. 18. — P. 269-292.
10. Слуквин, А.М. Генетическая идентификация стерляди (Acipenser ruthenus L.),
выращенной в ОАО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области по микросателлитным маркерам / А.М. Слуквин, О.Ю. Конева, М.И. Лесюк // Молекулярная и прикладная генетика. — 2009. — Т. 9. — С. 146-152.
11. Billington, N. Mitochondrial DNA diversity in fishes and its implications for introductions / N. Billington, D.N. Hebert // Can. J. Fish. Aquat. Sci. — 1991. — Vol. 48. — P. 80-94.
12. Assessment of natural and artificial propagation of the white-clawed crayfish (Austropota-mobius pallipes species complex) in the Alpine region with nuclear and mitochondrial markers / C.R. Largiader [et al.] // Mol. Eco. — 2000. — Vol. 9. — P. 25-37.
13. Liua, Z.J. DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics / Z.J. Liua, J.F. Cordes // Aquaculture. — 2004. — Vol. 238. — P. 1-37.
14. Microsatellite DNA analysis of starlet (Acipenser ruthenus Brandt) from the five European river drainage areas / D. Fopp-Bayat [et al.] // Aktualny stan i aktywna ochrona natural -nych populacji ryb jesiotrowatych zagrozonych wygini^ciem: Olsztyn. — 2008. — P. 223-234.
15. Барминцева, А.Е. Использование микро-сателлитных локусов для установления видовой принадлежности осетровых (Acipenseridae)
и выявления особей гибридного происхождения / А.Е. Барминцева, Н.С. Мюге // Генетика животных. — 2013. — Т. 49, № 9. — С. 10931105.
16. Полиморфизм контрольного региона митохондриальной ДНК восьми видов осетровых и разработка системы ДНК-идентификации видов / Н.С. Мюге [и др.] // Генетика. — 2008. — Т. 44, № 7. — С. 913-919.
17. Слуквин, А.М. Эффективный способ видовой идентификации и обнаружения гибридов у стерляди (Acipenser ruthenus L.) / А.М. Слуквин // Вопросы рыбного хозяйства Беларуси. — 2015. — № 1. — С. 168-177.
18. Soroka, M. Application of mitochondrial DNA in the identification of diverse crayfish species / M. Soroka // Polish J. Nat. Sci. — 2008. — Vol. 23, № 3. — P. 624-634.
19. Skuza, L. Molecular characterization of the noble crayfish (Astacus astacus L.) population from Pomeranian lakes (north-western Poland) based on mitochondrial DNA / L. Skuza // Knowledge & Management of Aquatic Ecosystems. — 2016. — № 13. — P. 417-422.
20. Consuegra, S. Patterns of natural selection acting on the mitochondrial genome of a locally adapted fish species / S. Consuegra, J. Elgan, E. Verspoor // Genetics Selection Evolution. — 2015. — P. 47-58.
M.A. Sasinovich1, A.M. Slukvin1, A.V. Alekhnovich2
COMPARATIVE GENETIC ANALYSIS OF POPULATIONS OF NARROW-CLAWED CRAYFISH (ASTACUS LEPTODACTYLUS ESCH.) IN THE LAKES OF BREST REGION
institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus 2The Scientific and Practical Center for Bioresources, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus
The article deals with the study results related to species identification and genetic polymorphism in populations of narrow-clawed crayfish in Lakes Sominskoye (Ivatsevichi District, Brest Region) and Oltush (Malorita District, Brest Region) by two mitochondrial genes. When assessing the species of crayfish using the mtDNA COI gene, it was found that in both lakes the species of decapod are presented by narrow-clawed crayfish (Astacus leptodactylus Esch.) with a probability of 99%. It was shown that in general the COI gene is characterized by fairly low intraspecific genetic variability. It was found that in the crayfish population from Lake Oltush it was 1.44 times lower than that of the crayfish population from Lake Sominskoye (1.44% and 2.03% respectively). Concerning the genetic variability of the 16s rRNA gene, a very high level of polymorphism in the populations of crayfish was established for both lakes (25.6% or Lake Sominskoye and 60.1% for Lake Oltush), which, according to the latest literature, is characteristic of the genes of the mitochondrial genome among hydrobionts in the selection for adaptation to extreme environmental conditions.
Key words: narrow-clawed crayfish, genetic polymorphism, COI gene, 16 rRNA gene.
Дата поступления статьи: 28 августа 2017 г.
