CC BY
42
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Н. А. Пасатецкая1'2, А. В. Кипенко1'2, А. И. Лопатин4, Е. М. Полякова3, Е. В. Лопатина1'2 4
1 ФГБУ науки «Институт физиологии им. И. П. Павлова» Российской академии наук, Санкт-Петербург;
2 ФГБУ «Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А. Алмазова» Минздрава России, Санкт-Петербург;
3 ФГБУ «Российский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена» Минздрава России, Санкт-Петербург;
4 ФГБОУ Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Минздрава России
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ФОСФОМИЦИНА И ВАНКОМИЦИНА НА РОСТ ТКАНИ КОСТИ В УСЛОВИЯХ ОРГАНОТИПИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
УДК 612.753
Неуклонный рост числа ортопедических операций, таких как эндопротезирование суставов, реконструктивные операции на крупных костях и суставах, приводит к увеличению количества инфекционных осложнений. Антибиотики фософомицин и ванкомицин широко применяют в составе остеозамещающих материалов, используемых при ортопедических операциях. Несмотря на хорошо изученный механизм действия и широкое применение данных препаратов их влияние на рост и пролиферацию клеток ткани кости изучено слабо.
Ключевые слова: фосфомицин, ванкомицин, органотипическая культура ткани, эксплантаты костной ткани.
N. A. Pasatetckaia, A. V. Kipenko, A. I. Lopatin, E. M. Polyakova, E. V. Lopatina4
COMPARATIVE ANALYSIS OF FOSFOMYCIN AND VANCOMYCIN
ON THE GROWTH OF THE BONE TISSUE EXPLANTS IN ORGANOTYPIC CULTURE
Phosphomycin and vancomycin are often added to materials that support osteogenesis to eradicate orthopedic infections. Despite the well-studied mechanism of action and the widespread use of these drugs, their effects on the growth and proliferation of bone cells remains poorly studied.
Key words: phosphomycin, vancomycin, organotypic tissue culturing, bone tissue.
В настоящее время инфекция в области хирургического вмешательства остается одним из наиболее серьезных осложнений при ортопедических операциях. В ряде случаев происходит хронизация инфекционного процесса и повторные оперативные вмешательства приводят к развитию костных дефектов. В ходе лечения для замещения дефектов костной ткани после санации инфекционного очага, часто используют комбинации остеоза-мещающих материалов и антибактериальных препаратов. Широко распространено исполь-
зование костного цемента на основе полиме-тилметакрилата (ПММА) в сочетании с антибиотиками различных классов [5, 6]. Основной вклад в развитие гнойно-воспалительных инфекций после хирургического вмешательства в стационарах вносят бактерии вида Staphylococcus aureus, Staphylococcus epider-midis, Pseudomonas aeruginosa и представители семейства Enterobacteriaceae [9].
Фосфомицин открыт в 1969 г. Механизм его действия основан на ингибировании начальных этапах синтеза клеточной стенки как грамполо-
* Работа поддержана грантом РФФИ № 16-34- 00831.
жительных, так и грамотрицательных бактерий [10]. Благодаря широкому спектру действия, низкому связыванию с белками крови, гидрофильное™ и маленькой молекулярной массе фосфо-мицин легко проникает в ткани и используется в комбинации с другими классами антибиотиков для лечения инфекций кожи, мягких тканей, костей и суставов. Ранее было показано, что фос-фомицин является одним из антимикробных препаратов, высоко активных в отношении стафилококков, в том числе и метициллинорези-стентных (MR) [3].
Ванкомицин - природный антибиотик, группы трициклических гликопептидов. Применяется в медицинской практике с 1958 г. для лечения тяжелых инфекционных осложнений, вызванных грамположительными микроорганизмами: Staphylococci (включая MRSA, MRSE) и Enterococci, резистентными к другим антимикробным препаратам. Ванкомицин образует комплекс с ацил^-аланин^-аланином мукопептида клеточной стенки бактерий, инги-бирует ее формирование и повышает проницаемость, нарушает синтез РНК [12]. Несмотря на хорошо изученный механизм действия и широкое применение фосфомицина и ванко-мицина влияние препаратов на рост и пролиферацию клеток ткани кости изучено слабо.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Провести сравнительный анализ влияния фосфомицина и ванкомицина на рост ткани кости в условиях органотипического культивирования.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводили на эксплантатах ткани кости 10-12-дневных куриных эмбрионов,
культивируемых в чашках Петри на подложках из коллагена в питательной среде в СО2-ин-кубаторе («Sanyo», Япония) в течение 3 суток при 37 °С и 5 % СО2.
Препаровку осуществляли инструментами для микрохирургии глаза. Фрагменты бедренной кости, очищенные от надкостницы, аккуратно переносили на коллагеновую подложку чашек Петри. Каждая чашка содержала от 15 до 20 эксплантатов.
Питательная среда содержала 45 % раствора Хенкса, 40 % среды Игла с добавлением инсулина (0,5 ед./мл), глюкозы (0,6 %), глюта-мина (2 мМ), гентамицина, 5 % куриного эмбрионального экстракта и 10 % фетальной сыворотки коровы [2]. Через 3 суток культивирования вокруг исходной зоны формируется зона роста (рис. 1, 2).
Контрольные эксплантаты культивировали в питательной среде стандартного состава. В культуральную среду экспериментальных чашек добавляли антибиотики фосфомицин в концентрациях от 10-2 М до 10-6 М и ванко-мицин в широком диапазоне концентраций (от 10-2 М до 10-6 М). Для визуализации объектов использовали микроскоп «Axiostar Plus» («Carl Zeiss», Германия) по методу, описанному ранее [1].
Полученные изображения анализировали при помощи программы ImageJ. Прижизненное окрашивание препаратов ткани кости осуществляли фаллоидином, конъюгированным с флуоресцентным красителем Texas Red (Texas Red®-X phalloidin, Life Technologies, USA) и исследовали с помощью лазерного сканирующего микроскопа «LSM 710» («Carl Zeiss», Германия).
Рис. 1. Микрофотография фрагмента центральной зоны эксплантата ткани кости 10-12-дневного куриного эмбриона. 3-и сутки культивирования (ув. х20). Контроль. Окраска фаллоидином, конъюгированным с Texas Red
Рис. 2. Фрагмент зоны роста эксплантата ткани кости 10-12-дневного куриного эмбриона.
3-и сутки культивирования (ув. х100). Контроль. Окраска фаллоидином, конъюгированным с Texas Red и DAPI
Фаллоидин высокоспецифично связывается с F-актином и позволяет оценивать акти-новый цитоскелет клеток зоны роста. В части исследований для улучшения визуализации исследуемые эксплантаты культивировали в чашках ^-Dish (1ВЮ1, Германия) дно которых выполнено с тонкой вставкой из оптически чистого пластика, имеющего коэффициент оптического преломления, соответствующий стеклу и иммерсионному маслу. Последнее позволяло использовать объектив х100 (рис. 2).
Для количественной оценки степени роста эксплантатов применяли морфометрический метод. Индекс площади (ИП) рассчитывали, как отношение общей площади эксплантата к площади центральной зоны. Контрольное значение ИП принимали за 100 %.
Часть исследований выполнена на оборудовании ЦКП «Конфокальная микроскопия» Института физиологии им. И. П. Павлова РАН.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 8.0 с использованием критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Фосфомицин исследовали в диапазоне концентраций от 10-2 М до 10-6 М. В концентрации 10-2 М антибиотик достоверно ингиби-ровал рост эксплантатов ткани кости на 46 % (р < 0,05) по сравнению с контролем (рис. 3). При введении в питательную среду фосфоми-цина в концентрациях 10-3 М и 10-4 М ИП экспериментальных эксплантатов был ниже контрольного значения на 12 и 18 % соответственно. Исследование фосфомицина в концентрации 10-6 М не выявило отличий между контрольными и экспериментальными эксплантатами. Стимулирующее действие фос-
фомицина на рост эксплантатов ткани кости в исследованном диапазоне концентраций не обнаружено.
В аналогичных экспериментальных условиях исследовали ванкомицин в диапазоне концентраций от 10-2 до 10-6 М. Установлено, что в условиях органотипического культивирования высокие концентрации (10"2-10"5М) ван-комицина практически полностью блокируют рост эксплантатов костной ткани. Снижение дозы препарата до 10-6 М также проводило к значимому угнетению (p < 0,05) роста экспериментальных эксплантатов на 57 % (рис. 4).
В настоящее время во всем мире для введения в состав костного цемента наиболее широко используют комбинации гентамицина и ванкомицина, для увеличения спектра активности спейсера. Однако ванкомицин характеризуется узким спектром действия, включающим только грамположительные возбудители, а обладающий широким спектром активности гентамицин в условиях возрастающей резистентности практически утратил свое значение. Фосфомицин характеризуется высокой антимикробной активностью в отношении таких полирезистентных возбудителей, как MR-штаммы Staphylococci и грамотрицательные бактерии, что обуславливает возможность его использования в составе костных цементов для повышения эффективности терапии хронического остеомиелита.
В ходе сравнительного анализа антимикробной активности фосфомицина и ванкомици-на в составе цемента на основе ПММА при лечении хронического остеомиелита in vivo установлено, что применение фосфомицина позволяет продлить антимикробную активность образцов до нескольких недель по сравнению с образцами, содержащими ванкомицин [4].
ю-2 кг3 1<г4 ю-«
■ Контроль □ Фосфомицин
Концентрация, М
Рис. 3. Влияние фосфомицина на рост эксплантатов ткани кости 10-12-дневных куриных эмбрионов: * - достоверные различия относительно контроля, р < 0,05
Рис. 4. Влияние ванкомицина на рост эксплантатов ткани кости 10-12-дневных куриных эмбрионов: * - достоверные различия относительно контроля, р < 0,05
Результаты морфометрии не продемонстрировали достоверных различий в реакции тканей, окружающих остеозамещающие препараты, однако было показано, что вокруг фосфомицин-импрегнированного спейсера площадь жирового костного мозга была больше, чем в группе с ванкомицин-импрегниро-ванным спейсером в 1,2 и 1,7 раз на 14-е и 21-е сутки после санирующей операции. При этом в его составе определялись признаки формирования кроветворного костного мозга. При установке биорезорбируемого материала, им-прегнированного фосфомицином на более длительный срок, увеличивалась площадь фиброзной ткани [4]. Известно, что фосфоми-цин легко проникает и накапливается в инфицированной костной ткани [6]. Это, по-видимому, объясняется структурным сходством молекулы антибиотика и гидроксиапатита [8]. В отличие от фосфомицина большая молекула
ванкомицина плохо проникает в костную ткань и биопленки [5].
Преимуществом органотипической культуры является возможность оценить влияние фармакологических и иных агентов на развитие клеточного сообщества, составляющего определенную ткань, в строго контролируемых условиях. Необходимо отметить, что в органотипической культуре сохраняется цитоархетек-тоника, присущая исследуемой ткани в условиях in vivo, и связи между клетками, формирующими определенную ткань [9]. Результаты данного исследования свидетельствуют о меньшей токсичности фосфомицина по сравнению с ванкомицином в аналогичных концентрациях в отношении клеточного сообщества, составляющего ткань кости.
Высокая антимикробная активность и низкая токсичность фосфомицина указывает на перспективность дальнейшего изучения его
применения для локальной антибактериальной терапии в составе остеозамещающих материалов при лечении инфекции костей и суставов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Использование метода реконструкции оптических срезов для оценки трофотропных эффектов адреналина и атенолола / Е. В. Лопатина, А. В. Кипенко, В. А. Пеннияйнен и др. // Рос. фи-зиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 2015. - Т. 101. -С. 1022-1031.
2. Лопатина Е. В., Пеннияйнен В. А., Зайка А. А. Исследование участия Na+, К+-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органотипической культуре / // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. - 2005. - Т. 140. - С. 150-153.
3. Ортопедическая имплантат-ассоциированная инфекция: ведущие возбудители, локальная резистентность и рекомендации по антибактериальной терапии / С. А. Божкова, Р. М. Тихилов, М. В. Краснова и др. // Травматология и ортопедия России. - 2013. -Т. 4. - С. 5-15.
4. Результаты применения фосфомицина для импрегнации остеозамещающих материалов при лечении хронического остеомиелита / В. А. Конев, С. А. Божкова, Г. И. Нетылько и др. // Травматология и ортопедия России. - 2016. - Т. 22, №. 2. - С. 44.
5. A simple infection model using pre-colonized implants to reproduce rat chronic Staphylococcus aureus osteomyelitis and study antibiotic treatment /
M. Monzon, F. Garcia-Älvare, A. Lacleriga, et al. // Journal of Orthopaedic Research. - 2001. - Vol. 19, № 5. - P. 820-826.
6. Efficacy of fosfomycin compared to vancomycin in treatment of implant-associated chronic methicil-lin-resistant Staphylococcus aureus osteomyelitis in rats / W. Poeppl, T. Lingscheid, D. Bernitzky, et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2014. -Vol. 58, № 9. - P. 5111-5116.
7. Heard G. S. PMMA bead versus parenteral treatment of S. aureus osteomyelitis // J American Medical Association. - 1997. - Vol. 87. - P.153-164.
8. High fosfomycin concentrations in bone and peripheral soft tissue in diabetic patients presenting with bacterial foot infection / M. V. Schintler, F. Traun-müller, J. Metzler, et al. // Journal of antimicrobial chemotherapy. - 2009. - Vol. 64, № 3. - P. 574-578.
9. Langlais F. Can we improve the results of revision arthroplasty for infected total hip replacement? // J. Bone Joint Surg Br. - 2003. - Vol. 85. - P. 637-640.
10. Michalopoulos A. S., Livaditis I. G., Gougou-tas V. The revival of fosfomycin / // International journal of infectious diseases. - 2011. - Vol. 15, № 11. - P. 732-739.
11. Monoolein-Water Liquid Crystalline Gels of Gentamicin as Bioresorbable Implants for the Local Treatment of Chronic Osteomyelitis: In Vitro Characterization / M. Ouedraogo, R. Semde, et al. // Drug Dev Ind Pharm. - 2008. - Vol. 34, № 7. - P. 753-760.
12. Rubinstein Keynan E., Y. Vancomycin revisit-ed-60 years later // Frontiers in public health. - 2014. -Vol. 2. - P. 217.
