Научная статья на тему 'Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита'

Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
215
78
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ВИРУС КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА / ГЛИКОПРОТЕИН Е / МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО / ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ / TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS / GLYCOPROTEIN E / MONOCLONAL ANTIBODY / IMMUNOGLOBULIN VARIABLE DOMAINS

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Байков Иван Константинович, Матвеев Леонид Эдуардович, Матвеев Андрей Леонидович, Тикунова Нина Викторовна

Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вариабельные домены мышиных моноклональных антител против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита потенциальных прототипов для конструирования терапевтических антител. Установлено, что вируснейтрализующие моноклональные антитела обладают значительным сходством вариабельных доменов легких и тяжелых цепей.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Байков Иван Константинович, Матвеев Леонид Эдуардович, Матвеев Андрей Леонидович, Тикунова Нина Викторовна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Comparati ve analysis of variable domains of monoclonal antibodies against tick-borne encephalitis virus

Nucleotide sequences of the genes encoding variable domains of mouse monoclonal antibodies against tickborne encephalitis virus glycoprotein E have been determined. These antibodies may potentially become prototypes for therapeutic antibodies construction. It was shown that virus neutralizing monoclonal antibodies have significant similarities in their variable domains.

Текст научной работы на тему «Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита»

логии, молекулярной эпидемиологии, нозологии, эволюции.

- Новосибирск: Наука, 2002. - 438 с.

3. Кульбак С. Теория информации и статистика. - М.: Наука, 1967. - 220 с.

4. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. Изучение филогенетических отношений хантавирусов с применением метода вычисления взаимной информации (на примере Хантаан-подобных вирусов) // Хантавирусы и хантавирусные инфекции. - Владивосток, 2003. - С.173-181.

5. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. Связанные замены в малом сегменте генома хантавирусов Старого света // Вопросы вирусологии. - 2008. - №3. - С.28-34.

6. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. К проблеме изменчивости генома вирусов клещевого энгцефалита // Национальные приоритеты России. Специальный выпуск. - 2011. - №2. -С.168-170.

7. Firth A.E., Atkins J.F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1’ may derive from ribosomal frameshifting // Virology Journal. - 2009. - Vol. 6. - P.1-6.

8. Grard G. Moureau G., Charrel R.N., et al. Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: New insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy // Virology.

- 2007. - Vol. 361. - P.80-92.

9. Mandl C.W., Kroschewski H., Allison S.L., et al. Adaptation of Tick-Borne Encephalitis Virus to BHK-21 Cells Results in the Formation of Multiple Heparan Sulfate Binding Sites in the Envelope Protein and Attenuation In Vivo // Journal of Virology.

- 2001. - Vol. 75. №12. - P.5627-5637.

10. Marin M.S., Zanotto P.M., Gritsun T.S., Gould E.A. Phylogeny of TYU, SRE, and CFA virus: different evolutionary rates in the genus Flavivirus // Virology. - 1995. - Vol. 206. №2.

- P.1133-1139.

11. Tuplin A., Evans D.J., Buckley A., et al. Replication enhancer elements within the open reading frame of tick-borne encephalitis virus and their evolution within the Flavivirus genus // Nucleic Acids Research. - 2011. - Vol. 39. №16. - P.7034-7048.

12. Thurner C., Witwer C., HofackerI.L., StadlerP.F. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes // Journal of General Virology. - 2004. - Vol. 85. - P.1113-1124.

Информация об авторах: Тюлько Жанна Сергеевна - доцент кафедры, к.б.н., 644043, ул. Ленина, 12, тел. (3812) 23-02-11,факс (3812) 23-46-32, e-mail tjs@omsk-osma.ru; Якименко Валерий Викторович - заведующий лабораторией, руководитель, д.б.н., ст.н.с., 644080, Омск, пр. Мира 7, тел. (3812) 650304, e-mail vyakimenko78@yandex.ru

© БАЙКОВ И.К., МАТВЕЕВ Л.Э., МАТВЕЕВ А.Л., ТИКУНОВА Н.В - 2012 УДК 578.833.2:612.017.1:575.2

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Иван Константинович Байков, Леонид Эдуардович Матвеев,

Андрей Леонидович Матвеев, Нина Викторовна Тикунова (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, директор - академик РАН В.В. Власов)

Резюме. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вариабельные домены мышиных моноклональных антител против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита - потенциальных прототипов для конструирования терапевтических антител. Установлено, что вируснейтрализующие моноклональные антитела обладают значительным сходством вариабельных доменов легких и тяжелых цепей.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, гликопротеин Е, моноклональное антитело, вариабельные домены иммуноглобулинов.

COMPARATIVE ANALYSIS OF VARIABLE DOMAINS OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS

I.K. Baykov, L.E. Matveev, A.L. Matveev, N.V. Tikunova (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SD RAS, Novosibirsk)

Summary. Nucleotide sequences of the genes encoding variable domains of mouse monoclonal antibodies against tick-borne encephalitis virus glycoprotein E have been determined. These antibodies may potentially become prototypes for therapeutic antibodies construction. It was shown that virus neutralizing monoclonal antibodies have significant similarities in their variable domains.

Key words: tick-borne encephalitis virus, glycoprotein E, monoclonal antibody, immunoglobulin variable domains.

На территории Российской Федерации одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать заболевание, приводящее к серьезным поражениям нервной системы. В настоящее время для этиотропной терапии КЭ применяют в основном сывороточный иммуноглобулин, получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания. Этот препарат обладает выраженным терапевтическим эффектом особенно при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания, причем введение препарата в 1-2 день после укуса обеспечивает значительно больший лечебный эффект, чем введение в последующие дни. Вместе с тем, препарат обладает определенными недостатками, в частности, он дефицитен и содержит относительно низкий уровень специфических вируснейтрализующих антител, что связанно с ограниченным источником исходного материала.

В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают рекомбинантные антитела, способные заместить сывороточные иммуноглобулины. Среди рекомбинантных антител на фармацевтическом рынке преобладают химерные антитела - полноразмерные иммуноглобулины, в которых к константным доменам иммуноглобулинов человека присоединены вариабельные домены мышиных моноклональных антител (МКА). При конструировании химерных антител против вируса КЭ ключевым этапом является выбор МКА, чьи вариабельные домены обладают высокой аффинностью и противовирусными свойствами.

Ранее были получены и охарактеризованы МКА против гликопротеина Е - основного иммуногенного белка вируса КЭ [5]. Установлено, что некоторые из них способны ингибировать инфекционность вируса на культуре эукариотических клеток [4,5]. Эти антитела пред-

Таблица 1

Характеристики МКА против гликопротеина Е вируса КЭ

МКА Ka*, М-1 NI,* lgPFU/0.1 мг Семейство VH-, D-, JH- фрагментов Семейство VL- и JL-фрагментов Размер / суммарный заряд HCDR3

MKA14D5 2,0х109 5,3 IGHV1-7 IGHD1-1 IGHJ2 IGKV10-96 IGKJ1 9 / -1

МКА1В1 1,7х109 4,5 IGHV1-7 IGHD1-1 IGHJ2 IGKV10-96 IGKJ1 9 / -1

MKA13D6 4,0х107 5,4 IGHV1-7 IGHD1-1 IGHJ2 IGKV10-96 IGKJ1 9 / -1

MKA14D2 nd - IGHV1-18 IGHD1-2 IGHJ3 IGKV10-96 IGKJ5 11 / 0

МКА10С2 <107 - IGHV1-18 IGHD1-2 IGHJ3 IGKV4-68 IGKJ1 11 / 0

E6B** nd - IGHV6-6 IGHD2-2 IGHJ1 IGKV3-10 IGKJ2 13 / 0

4.2*** nd 1,95 IGHV1-81 IGHD2-3 IGHJ4 IGKV12-41 IGKJ1 13 / -2

Примечание: * - по данным [5]; ** - согласно [4]; *** - согласно [3]; ид - не установлено; HCDR3 - третий гипервариабельный участок тяжёлой цепи, размер определяли согласно базе данных 1МОТ (http://www.imgt.org).

ставляют особый интерес в качестве прототипов при создании терапевтических рекомбинантных антител против вируса КЭ. Для некоторых МКА последовательности вариабельных доменов были установлены ранее [2-4]. Тем не менее, остаётся неясным, в какой степени свойства, проявляемые антителами против гликопротеина Е вируса КЭ, зависят от структурных особенностей вариабельных доменов этих антител. Цель данного исследования - определить последовательности вариабельных доменов наиболее аффинных МКА против гликопротеина Е вируса КЭ, полученных ранее [5], а также проанализировать взаимосвязь между аминокислотными последовательностями и свойствами антител.

Материалы и методы

В работе использовали: бактериальный штамм Escherichia coli XL1-blue, ферменты производства Fermentas и СибЭнзим.

Выделение РНК и синтез к ДНК осуществляли с использованием набора “RNeasy kit” (“QIAgen”, США) и набора “One-step RT-PCR kit” (“QIAgen”, США) согласно инструкции производителя. В реакции использовали олигонуклеотиды MH1_dir: 5'CTTcCgGAATTCSARG TNMAGCTGSAGSAGTC, mouse_IgHG1_const_rev: 5'G

gcaagcttatagacagatgggggtgtcgttttggc,

mus_kappa_dir: 5'CCGAATTCGAYATTGTGMTSACMC ARWCTMCA, mus_kappa_const_rev: 5'GGGAAGCTTGA TACAGTTGGTGCAGCATCAGC, разработанные в [6] и модифицированные нами.

Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК проводили согласно стандартным методикам с использованием 6% полиакриламидного геля либо 1% агарозного геля [1].

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов. Реакцию Сэнгера проводили с использованием набора “BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit” (“Applied Biosystems”, США). Продукты реакции обессоливали на колонках с сорбентом Sephadex G50 (“GE healthcare”, США). Анализ проводили в ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН на секвенаторе ABI 3130xl.

Результаты и обсуждение

Для проведения данного исследования были выбраны M^14D5, МКА1В1, M^13D6 и M^14D2, обладающие достаточной аффинностью для того, чтобы быть использованными в качестве прототипа при конструировании терапевтических антител. M^14D5, M^13D6 и МКА1В1 способны нейтрализовать инфек-ционность вируса ЕЭ in vitro и связываются с эпитопом, расположенным между 375 и 471 аминокислотными остатками (а.к.о.) гликопротеина Е (табл. 1), в то время как M^14D2 не проявляет вируснейтрализующей активности [5]. На первом этапе из гибридомных клеток, продуцирующих соответствующие антитела, выделяли суммарную РНК, которую использовали для получения комплементарной ДНК со специфических праймеров. Поскольку ранее было установлено, что все антитела относятся к IgG1/каппа изотипу [5], использовали праймеры, соответствующие началу каркасных областей VH и Vkappa-последовательностей, а также обратные прай-

меры, комплементарные началу константных доменов ^б1-цепей и каппа-цепей антител мыши. Каждый из полученных ПЦР-фрагментов встраивали в плазмиду риС19 по сайтам эндонуклеаз рестрикции £соМ и НтдШ, после чего были определены нуклеотидные последовательности встроенных участков для нескольких клонов каждой из полученных плазмид (номера депонированных последовательностей в базе данных GenBank GU270653.1, GU270654.1, GU270655.1, GU270656.1, GU247963.1, GU247960.1).

На основании нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены антител, были выведены последовательности аминокислотных остатков (рис. 1). Анализ последовательностей проводили с использованием результатов секвенирования генов, кодирующих вариабельные домены следующих МКА мыши, направленных к гликопротеину Е вируса КЭ: 10С2 [4], Е6В [2] и 4.2 [3]. Результаты, представленные на рис. 1, хорошо согласуются со свойствами исследуемых антител. Так, способность антител МКА13D6, МКА14D5 и МКА1В1 связываться с одним и тем же эпитопом определяется высокой степенью гомологии вариабельных доменов этих антител. Сравнение нуклеотидных последовательностей доменов с последовательностями зародышевых У-генов мыши выявило, что вариабельные домены тяжёлых цепей антител МКА13D6, МКА14D5 и МКА1В1 кодируют последовательности, принадлежащие к семейству ЮНУ1 антител мыши, а соответствующие участки генов лёгких цепей относятся к семейству ЮКУ10, согласно классификации IMGT (http://www. imgt.org).

Хотя все три антитела являются вируснейтрали-зующими и взаимодействуют с одним и тем же эпитопом гликопротеина Е, сродство к антигену антител МКА14D5 и МКА1В1 составляет около 109 М-1, тогда как для антитела МКА13D6 это значение приблизительно равно 107 М-1. Согласно распространённому мнению, наибольший вклад во взаимодействие с антигеном вносит третий гипервариабельный участок тяжёлой цепи (HCDR3), однако в случае МКАl3D6 маловероятно, что замена Уа1100^А1а (нумерация согласно рис. 1) приводит к снижению сродства на два порядка. Можно предположить, что в данном случае существенный вклад во взаимодействие антител с антигеном вносят и другие гипервариабельные участки. К различиям, которые могут оказывать значительное влияние на сродство антитела, относятся замена полярного незаряженного остатка аспарагина или серина на отрицательно заряженный остаток аспартата Asn/Ser31^Asp в участке HCDR1, замена незаряженного остатка глицина на отрицательно заряженный остаток аспартата G1y58^Asp в участке HCDR2, замена отрицательно зараженного остатка глутаминовой кислоты на ароматический остаток тирозина

А)

Б)

HCRD1

HCDR2

VH14D5

VH1B1

VH10C2

VH14D2

VH4.2

VHE6B

VH13D6

VH14D5

VH1B1

VH10C2

VH14D2

VH4.2

VHE6B

EVKLEES ••Q•QQ• GAELАКР GAS VKMS С KAS GY Т FI I Л DYWIH Я. .М. 'JVKQRPGQGLEWIC YINP--TTDYT ....--S.G..

....QQ. 1 S . .М. М. . . . . —S . G. .

..Q.QQ. Q.Q.QQ. Q.E.L.. • Р. .VE L...S 1 .P. .V L . . . S 1 • Р. .V 1 • GG.VQ..E.M.L..V...F . . S ENT. . ENT. . . . V. G . A.MD SH.KS..Y.. SH.KS..Y.. Т . .L.S.EK VA G. . .--DNGG. G. . .--DNGG. Е,Y --GSGT. E.RSKSNNHA.

HCDR2

HCDR3

YYNQTF Е . . . R. KDK-ATLTADKS SSTAYMQLSSLTSEDSAVYY Г. П. . .N CAREG FALDYW . V. . . GQGTTLT

Е . . . R. Г . . - •N..N...N . V. . . . . . . F .

S...К. .G.-....V.. E.R ...WE--ITAT.A.. ....LV.

S...К. .G.GP...V.. F.. R ...WE--ITAT.A.. ....LV.

...ЕК. - N F ...GEDGYYI V.

S.AESV EGR-F.ISR.D K.SV.L.MNN.RA..TGI.. .Т.YYGYLYWYF.VI V.

VH13D6 VSS VH14D5 VH1B1 VH10C2 VH14D2 VH4 .2 VHE6B

[123]

[123]

[123]

[123]

[123]

[123]

[123]

LCDR1

LCDR2

VL13D6

VL14D5

VL1B1

VL10C2

VL14D2

VL4.2

V1E6B

VL13D6 GVPSRFSGSGSGTDYSLTIWNLEQEDLATYFC

VL14D5 .....................S.......I......

VL1B1 ..........Т...........R.......I......

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

VL10C2 ...А...........S.....SSM.A. .А. . . Y.

VL14D2 ....................................

VL4.2 ..............Q. . .K.NS.QP. .FGS.Y.

V1E6B . L . А.......R. .FT. . .DPV.AD.A. . . Y.

LCDR3 QH-GNTLPRT Е-.G.... E-.SA...

Q—WSS.L

..FWS.P.W .Q—. NDDP

FGGGTKLEVKR [113]

I.. [ИЗ]

.......I.. [113]

А......I.. [113]

.......... [113]

.......I.. [113]

S......I.. [113]

60]

60]

60]

60]

60]

60]

60]

[120]

[120]

[120]

[120]

[120]

[120]

[120]

DIVMTQSP SSLSASLGDRVTISC SASQDIS NYLN R .... л/YQQ КР DGTVKL LIF S Y YTSKLHS ...R.Q.

К .... SI . . . . Y ...T.Q. L..N.А.

. . EL ALM...Р.ЕК..МТ. S . . SSV S.MF RSSP.SW.Y

. . EL . . EL А V.ET. . .Т. Р..AV...Q.A . . . GN. Н , А ...KSLDSYGNSF.Н QGKSPQ..VY GQPP Y KAQT.AD LA.N.E.

[ 60] [ 60] [ 60] [ 60] [ 60] [ 60] [ 60]

Рис. 1. Аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжёлых (А) и лёгких (Б) цепей МКА против гликопротеина Е вируса КЭ. Жирным шрифтом и рамками выделены гипервариабельные участки. Серым фоном отмечены участки, кодируемые последовательностями олигонуклеотидных праймеров. В квадратных скобках указаны номера аминокислотных остатков.

С1и61^Туг, положительно заряженного остатка аргинина на незаряженный остаток треонина А^^’Йг в том же участке. Вариабельные домены легких цепей МКА13D6 также содержат несколько ключевых отличий: замена положительно заряженного остатка аргинина или лизина на остаток серина Аг§^у830^8ег в участке LCRD1, замена незаряженного остатка глутамина на положительно заряженный остаток гистидина 01п59^Н1з в участке LCDR2 и замена отрицательно заряженного остатка глутаминовой кислоты на положительно заряженный остаток гистидина С1и94^Ш8 в третьем гипервариабель-ном участке.

Аминокислотная последовательность МКА14D2 обладает сходством с последовательностью МКА10С2. Оба эти МКА связываются с эпитопом, расположенным между аминокислотными остатками 78 и 176 поверхностного гликопротеина Е [5]. Это обстоятельство хо-

рошо согласуется со значительными отличиями последовательности вариабельных доменов этих антител от доменов антител предыдущей группы. Сравнение нуклеотидных последовательностей доменов MKA14D2 с последовательностями зародышевых V-генов мыши выявило, что вариабельный домен тяжёлой цепи принадлежит к семейству IGHV1 антител мыши, а соответствующие участки генов лёгких цепей относятся к семейству IGKV4.

Сравнение аминокислотных последовательностей вариабельных доменов, определенных в работе [4] и в данном исследовании, с последовательностями антител E6B и 4.2, которые были получены в работах [2,3], не выявило значительной гомологии. По-видимому, эти антитела связываются с другими эпитопами на поверхности гликопротеина Е. Вместе с тем, следует отметить, что для всех МКА, способных нейтрализовать ин-фекционность вируса КЭ in vitro, включая МКА 4.2, характерно наличие отрицательного заряда у HCDR3 (табл. 1).

Таким образом, были клонированы гены, кодирующие вариабельные домены антител MKA14D2, MKA14D5, MKA13D6 и МКА1В1, и определены их нуклеотидные последовательности. Результаты сравнительного анализа указывают на то, что сходства и различия иммунобиологических свойств, проявляемых данными антителами, непосредственно связаны со степенью гомологии их вариабельных доменов.

Исследования частично финансировались из средств междисциплинарного интеграционного проекта № 141 фундаментальных исследований СО РАН, а также проекта № 01-11, поддержанного некоммерческой организацией Союз инновационно-технологических центров России.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 480 с.

2. Тикунова Н.В., Николенко Г.Н., Протопопова Е.В. и др. Получение одноцепочечных антител против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусологии. - 1999. - №1. - С.12-15.

3. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., et al. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses // Virology. - 1994. - Vol. 200. №1. - P.21-28.

4. Levanov L.N., Matveev L.E., Goncharova E.P., et al. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. - 2010.

- Vol. 28. - P.5265-5271.

5. Tsekhanovskaya N.A., Matveev L.E., Rubin S.G., et al. Epitope analysis of tick-borne encephalitis (TBE) complex viruses

using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype) // Virus Res. - 1993. - Vol. 30. №1.

- P.1-16.

6. Wang Z., Raifu M., Howard M., et al. Universal PCR amplification of mouse immunoglobulin gene variable regions: the design of degenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase 3’ to 5’ exonuclease activity // J. Immunol. Methods. - 2000. - Vol. 233. №1-2. - P.167-177.

Информация об авторах: 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8, тел. (383) 3635157, e-mail: ivan_baykov@mail.ru, tikunova@niboch.nsc.ru, Байков Иван Константинович - инженер; Матвеев Леонид Эдуардович - ведущий инженер; Матвеев Андрей Леонидович - инженер, аспирант; Тикунова Нина Викторовна - зав. лаб., д.б.н., доцент.

© БОНДАРЕНКО Е.И., ТИМОФЕЕВ Д.И., ФОМЕНКО Н.В., ЯКИМЕНКО В.В., ТАНЦЕВ А.К., РАР В.А. - 2012 УДК: 579.61:616-078

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ВЫЯВЛЕНИЮ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИЙ,

ПЕРЕНОСИМЫХ КЛЕЩАМИ, С ПОМОЩЬЮ ПЦР-АНАЛИЗА С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Евгений Иванович Бондаренко1, Денис Игоревич Тимофеев1, Наталия Владимировна Фоменко1, Валерий Викторович Якименко2, Алексей Константинович Танцев2, Вера Александровна Рар3 ('ЗАО “Вектор-Вест” г. Новосибирск, генеральный директор - М.Д. Хусаинов, лаборатория ПЦР, зав. -к.б.н. М.К. Иванов; 2Омский НИИ природно-очаговых инфекций, директор - д.м.н., проф. Н.В. Рудаков, лаборатория арбовирусных инфекций, зав. - д.б.н. В.В. Якименко; 3Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, директор - акад. РАН В.В. Власов, лаборатория молекулярной микробиологии, зав. - д.б.н. Н.В. Тикунова)

Резюме. Проведен комплексный анализ клещей и образцов крови грызунов с целью выявления патогенов, передающихся клещами: возбудителей иксодового клещевого боррелиоза, гранулоцитарного анаплазмоза и моноци-тарного эрлихиоза человека, а также вируса клещевого энцефалита и Borrelia miyamotoi. Всего с помощью ПЦР-анализа в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием наборов серии “Реал-Вест” (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) исследовано 706 клещей Ixodes spp. из Новосибирской области и 111 образцов крови мышевидных грызунов из Омской области. Как в клещах, так и в образцах крови была обнаружена ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato, Borrelia miyamotoi, Anaplasmaphagocytophilum, Ehrlichia muris, а также РНК вируса клещевого энцефалита. Выло показано, что ДНК/РНК хотя бы одного из исследуемых патогенов выявляется в образцах от более 60% клещей и грызунов, при этом наблюдалось одновременное инфицирование клещей и животных двумя, тремя и даже четырьмя возбудителями.

Ключевые слова: инфекции, переносимые клещами; возбудители клещевого энцефалита, иксодовый клещевой боррелиоз, гранулоцитарный анаплазмоз человека, моноцитарный эрлихиоз человека.

A COMPREHENSIVE APPROACH TO REVEALING THE INFECTION CAUSATIVE AGENTS TRANSMITTED BY TICKS USING REALTIME PCR

E.I. Bondarenko1, D.I. Timofeev1, N.V. Fomenko1, V.V. Yakimenko2, A.K. Tancev2, V.A. Rar3 ('Joint-stock company “Vector-Best”, Novosibirsk; 2Omsk Research Institute of Natural Foci Infections, Omsk;

3Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Novosibirsk)

Summary. Ixodes ticks and the blood samples of small mammals were analyzed for the presence of tick-transmitted agents of following diseases - Lyme borreliosis, human granulocytic anaplasmosis and human monocytic ehrlichiosis as well as tick-borne encephalitis virus and Borrelia miyamotoi. Totally, 706 Ixodes spp. ticks from Novosibirsk region and 111 blood samples of small mammals from Omsk region were analyzed by real-time PCR using “Real-Best” kits (Joint-stock company “Vector-Best”, Novosibirsk). Both ticks and blood samples were shown to contain Borrelia burgdorferi sensu lato, Borrelia miyamotoi, Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia muris DNA as well as tick-borne encephalitis virus RNA. It was shown that more than 60% of ticks and blood samples analyzed contain DNA/RNA of at least one of the tested agents. A simultaneous infection of ticks and mammals by 2, 3 and even 4 agents was demonstrated.

Key words: tick-transmitted infections, agents of tick-borne encephalitis, Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, human monocytotropic ehrlichiosis.

Территория Российской Федерации входит в состав одного из наибольших в мире ареалов иксодовых клещей, простирающегося через всю Евразию. В России регистрируется порядка полумиллиона в год пострадавших от укусов клещей, однако реальное число пострадавших людей может значительно превышать имеющиеся статистические данные.

Иксодовые клещи являются переносчиками возбудителей целого ряда заболеваний человека, объединяемых термином “инфекции, переносимые клещами” (ИПК). В России систематически осуществляется лабораторная диагностика и эпидемиологический надзор лишь за клещевым энцефалитом (КЭ), иксодовым

клещевым боррелиозом (ИКБ) и риккетсиозом. В то же время лабораторный контроль других ИПК, таких как, гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ), моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ), лихорадка, вызванная Borrelia miyamotoi, и систематический эпидемиологический надзор над ними до сих пор не получили должного распространения. При этом в РФ этиология сезонных острых лихорадочных проявлений, возникающих после присасывания клещей, довольно часто (до 40% и более) остается невыясненной [1,10].

Заболевания ГАЧ и МЭЧ, объединенные в недавнем прошлом под термином “эрлихиозы человека”, - острые инфекционные трансмиссивные заболевания, перено-

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.