CC BY
91
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ РАПСА К ПОВЫШЕННЫМ КОНЦЕНТРАЦИЯМ МЕДИ И ЦИНКА
Н.В. Радионов, К.С. Волков, В.П. Холодова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН Ботаническая ул., 35, 127276, Москва, Россия
Изучение устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, таким как тяжелые металлы, является современной задачей биологии. Анализируется устойчивость растений рапса к высоким концентрациям меди и цинка. Показано влияние тяжелых металлов на некоторые физиологические параметры - прорастание семян, ингибирование роста корня, изменение массы целого растения и отдельных органов (листьев и корня), отдельно приводятся данные по накоплению металлов в надземных органах. На основании полученных данных сделано заключение о большем токсическом эффекте меди на растения по сравнению с цинком.
Постоянно усиливающееся антропогенное воздействие на экосистемы делает весьма актуальным изучение механизмов устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов, среди которых сильным токсическим действием обладают тяжелые металлы. Медь (Си) и цинк (7п), входящие в группу тяжелых металлов, являются в то же время эссенциальными элементами, жизненно необходимыми для нормального роста и развития растений, поскольку входят в состав ряда ферментов и структурных белков. Так, цинк является кофактором более чем 300 ферментов, тогда как белки со структурой типа «7п-пальцы» участвуют в сигналинге и регуляции транскрипции [1]. Си как металл с переходной валентностью является составным компонентом электрон-транспортных белков фотосинтеза (пластоцианина) и дыхания (цитохром-С-оксидазы) [1]. Однако высокие концентрации как эссенциальных, так и неэссенциальных тяжелых металлов в почве вызывают токсические синдромы и приводят к гибели большинства растений. Причиной является ряд изменений, вызываемых действием тяжелых металлов на молекулярном и клеточном уровне. Тяжелые металлы связываются с сульфгидрильными группами белков, что приводит к нарушению структуры белков и ингибированию активности ферментов, а также вытесняют некоторые элементы из активных центров ферментов [2]. К тому же избыток тяжелых металлов может приводить к образованию свободных радикалов и активных форм кислорода, инициирующих окислительный стресс [3].
Различия в содержании тяжелых металлов в почвах природных экосистем составляют несколько порядков величин; антропогенный фактор еще более усугубляет эти различия [4, 5]. Многоуровневые конститутивные механизмы лежат в основе жизнедеятельности представителей природной флоры, освоивших зоны, где концентрация тяжелых металлов резко повышена [6]. В этих условиях жизнедеятельность культурных растений детерминируется возможностями их адаптационных систем.
К настоящему времени опубликовано несколько работ по действию на растения рапса тяжелых металлов [7, 8], однако систематических исследований в этом направлении до сих пор не проведено. Между тем установлено, что цинк и медь
сильно различаются между собой по степени токсичности, что коррелирует с большими различиями в их содержании не только в почве, но и в тканях растений [4, 9, 10]. Изучение механизмов адаптации рапса к избыточному уровню тяжелых металлов начато нами с анализа ответных реакций растений разного возраста на воздействие солей цинка и меди в широком диапазоне концентраций.
Объект и методы исследования. Работа проведена на растениях рапса (Brassica napus L.) сорта Вестар канадской селекции. Семена рапса поверхностно дезинфицировали в течение 5 минут 80% этанолом, промывали небольшим количеством дистиллированной_воды и после этого помещали на 20 минут в 10-20% гипохлорит натрия. Затем семена интенсивно (многократно) промывали дистиллированной водой.
В опытах, проведенных на проростках, дезинфицированные семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, на дистиллированной воде (контроль) или растворах CuS04 в концентрации 50, 100, 150 мкМ или ZnS04 в концентрации 300, 500, 800, 1000 мкМ. Проращивание проводили в темноте в течение 4 дней при +25°С. Экспериментальные параметры - всхожесть (%) и длину корня проростка (мм) - оценивали на 3-й и 4-й день проращивания (согласно ГОСТу 10583-76).
В опытах на растениях предварительно дезинфицированные семена проращивали в кюветах с перлитом в течение 7 дней, проростки пересаживали в стаканчики объемом 200 мл, покрытые фольгой. Дальнейшее выращивание осуществляли на модифицированной среде Хогланда-Снайдерс при освещенности 350 мкмоль^м'^сек'1 фотопериоде 12/12 и 23-25/18-20°С. Для опытов использовали 3-недельные растения, добавляя в питательный раствор опытных вариантов CuS04 в концентрации 50, 100 и 150 мкМ или ZnS04 - 500, 1000 и 1500 мкМ. Действие тяжелых металлов оценивали на 5-й и 10-й день воздействия по биомассе растений и отдельных органов.
Для определения содержания тяжелых металлов проводили озоление растительного материала смесью концентрированных HNO3 и НСЮ4 (2:1) при 180°, поддерживаемой термостатом типа “dry-block” TDB-A-400 (фирма BioSan, Латвия). Концентрацию Zn и Си измеряли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра Hitachi-270 (фирма Hitachi, Япония).
Каждый опыт проводили не менее 3-4 раз. Анализы проводили в 3 биологических повторностях. В табл. 1-3 представлены средние величины. Бары на рисунках обозначают стандартные отклонения от среднего.
Результаты исследования. Первая задача настоящей работы заключалась в изучении влияния сернокислых солей меди и цинка на прорастание семян. Использованная в наших экспериментах партий семян рапса имела весьма удовлетворительное качество: максимальное значение всхожести - 90% - было достигнуто уже на 3-й день прорастания (рис. 1). Сернокислый цинк в концентрации 300 мкМ не изменил эти показатели, однако повышение концентрации до 500 мкМ достоверно задержало прорастание: на 3-й день эксперимента взошло только 65% семян, тогда как на 4-й день прорастание сравнялось с контрольным вариантом (90%). Высшая из использованных концентраций сульфата цинка - 1000 мкМ сильно снизила всхожесть семян рапса и замедлила прорастание: на 3-й день экспозиции взошло всего 5% семян, на 4-й день воздействия - 30% семян, значительно ниже значений для семян контрольного варианта (90% как для 3-го, так и для 4-го дня).
Помимо всхожести семян рапса оценивали также влияние ТМ на рост корня проростков. Корень проростков контрольного варианта между 3 и 4 сутками
прорастания увеличил длину практически в 2 раза - с 26 до 51 мм (рис. 2). Воздействие 300 мкМ сульфата цинка не изменило скорости роста корня (на 3-й день 30 мм, на 4-й - 51 мм). Заметно затормозил рост корня проростков цинк в концентрации 500 мкМ, а при действии 1000 мкМ 2п804 на 3-й день его рост практически остановился (рост с 14 мм до 19 мм, т.е. всего 20% от прироста корня проростка контрольного варианта за тот же период).
Рис. 1. Влияние сернокислого цинка на прорастание семян рапса:
1 - контроль, 2 - 7пБ04 500 мкМ, 3 - 2пБ04 1000 мкМ, 4 - гп804 1500 мкМ
3 суток 4 суток
время воздействия
Рис. 2. Влияние солей цинка на рост корня проростков рапса:
1 - контроль, 2 - Хп 300 мкМ, 3 - Хп 500 мкМ, 4 - Хп 800 мкМ, 5 - Хп 1000 мкМ
время воздейстия
Рис. 3. Влияние сернокислой меди на прорастание семян рапса:
1 - контроль, 2 - СиБ04 50 мкМ, 3 - СиБ04 100 мкМ, 4 - Си804 150 мкМ
50.00 -
2
2 40.00 -
Рис. 4, Влияние солей меди на рост корня проростков рапса:
1 - контроль, 2 - Си 50 мкМ, 3 - Си 100 мкМ, 4 - Си 150 мкМ
Сернокислая медь, использованная в этих опытах в концентрации 50, 100 и 150 мкМ, оказала лишь небольшое торможение на прорастание семян рапса. На 3-й день воздействия всхожесть понизилась на 5%, но на 4-й день достигла значений контрольного варианта (90%) (рис. 3). Значительно сильнее влияла Си$04 на рост корня проростка (рис. 4). При минимальной концентрации 50 мкМ на 3-й день воздействия рост снизился на четверть от контрольного варианта, но позже частично восстановился, на 4-й день ингибирование не превышало 15%. Напротив, торможение роста корня проростка даже усиливалось со временем при действии
100 мкМ сернокислой меди, а самая высокая концентрация - 150 мкМ - резко тормозила рост корня проростка, в результате на 4-й день прорастания его длина не достигла 1/3 от контроля.
Следующая серия опытов была проведена на растениях рапса, которые росли на стандартной питательной среде в течение 3 недель, сформировав стебель высотой 6-9 см с 2-3 настоящими листьями. В течение 10 дней эксперимента растения контрольного варианта быстро росли, их биомасса (свежая) увеличилась в 6 раз. На этом фоне Си804 в концентрации 50-150 мкМ сильно тормозила накопление биомассы в среднем на 40-60% (рис. 5). Несмотря на то что концентрация 2п804 в этих опытах превосходила концентрацию Си804 в 10 раз, ингибирующий эффект цинка на накопление биомассы был значительно менее выражен. Не более чем на 1/3 снизилась биомасса растений рапса даже при максимальной концентрации цинка 1500 мкМ.
7.00
6.00
5.00
^ 4.00 го
О 3.00 -5
2.00 1
1.00 -| о.оо 4-
0 дней
5 дней время воздействия
1
2
3
4
5
6 7
10 дней
Рис. 5. Влияние солей тяжелых металлов на биомассу:
1 - контроль, 2 - 2п804 500 мкМ, 3 - 7п804 1000 мкМ, 4 - гпБ04 1500 мкМ, 5 - Си804 50 мкМ, 6 - Си804 100 мкМ, 7 - Си804 150 мкМ
В другом опыте был проведен учет действия сернокислых солей цинка и меди раздельно на рост листьев и на рост корней растений рапса. Исходная биомасса листьев перед началом воздействия была равна 0,25 г/растение, корней - 0,17 г/растение. За 10 дней опыта листовая масса растений контрольного варианта выросла до 3,49 г/растение, т.е. в 14 раз, за это же время при действии 2пБ04 накопление биомассы листьев составило 6-9 раз (табл. 1). Однако значительно сильнее был эффект Си804 - биомасса листьев увеличилась всего в 2-5 раз при концентрациях, в 10 раз меньших, чем 2п804. Особенно сильно различалось действие цинка и меди на рост корневой системы. При максимальной концентрации цинка 1500 мкМ биомасса корней за 10 дней опыта увеличилась в 3 раза в сравнении с 5-кратным увеличением у растений контрольного варианта (т.е. угнетение роста было менее 40%). При действии Си804 прирост корневой биомассы почти остановился, даже при минимальной концентрации 50 мкМ он не
достиг 15%, угнетение роста составило почти 80% по сравнению с растениями контрольного варианта того же возраста (табл. 1).
В этом же опыте было измерено содержание солей цинка и меди в листовой массе растений рапса сорта Вестар, росших на стандартной среде или с внесением 2п804 или Си804.
Таблица 1
Влияние тяжелых металлов на рост отдельных органов
Вариант 0 дней 5 дней 10 дней
масса листьев, г масса корней, г масса листьев, г масса корней, г масса листьев, г масса корней, г
Контроль 0,25±0,05 0,17±0,03 2,25±0,45 0,52±0,09 3,49±0,58 0,83±0,15
СиБ04 50мкМ - - 0,88±0,12 0Д5±0,03 1,29±0,32 0,23±0,1
СиБОд 100 мкМ - - 1,05±0,21 0,17±0,04 0,99±0,24 0,20±0,09
Си804 150 мкМ - - 1,05±0,13 0,17±0,04 1,31±0,35 0Д8±0,05
ZnS04 500 мкМ - - 2,06±0,39 0,46±0Д 1 2,81±0,51 0,71±0,24
2п804 1000 мкМ - - 1,15±0,27 0,32±0,09 2,11±0,42 0,56±0,15
2п804 1500 мкМ - - 1,59±0,31 0,40±0,14 2,34±0,41 0,51±0,1
Содержание цинка в листьях растений рапса сорта Вестар, выращенных в стандартных условиях, в среднем не превышало 90 мкг/г сухой массы листа. При внесении 7п804 в питательный раствор в концентрации 500 мкМ уже через 5 дней обнаружена заметная аккумуляция цинка, его уровень превосходил контрольный вариант на 68%, а через 10 дней - в 3,2 раза. За 5 дней роста на среде с 2п804 в концентрации 1000 мкМ или 1500 мкМ содержание цинка в листьях сильно увеличивалось - в 7,4- 8,5 раз. Максимальная, более чем 20-кратная аккумуляция цинка наблюдалась в листьях растений рапса после 10 дней роста на среде с 1500 мкМ 2п804 (табл. 2).
Таблица 2
Содержание цинка в листьях рапса, мкг металла/г сухой массы ткани листа'
Вариант 5 дней 10 дней
контроль 79,5±7,8 86,2±9,4
2п804 500 мкМ 133,1±12,8 278,9±11,1
ZnS04 1000 мкМ 584,2±34,2 907,2±80,4
гп804 1500 мкМ 678,7±55,4 1832,2±99,8
Таблица 3
Содержание меди в листьях рапса, мкг металла/г сухой массы ткани листа
Вариант 5 дней 10 дней
контроль 22,3±2,3 24,9±2,5
СиБ04 50 мкМ 25,1±2,8 54,8±4,1
Си804 100 мкМ 26,6±2,7 65,2±5,3
Си804 150 мкМ 30,7±3,5 57,0±4,7
В норме растения рапса сорта Вестар содержали 22-25 мкг меди на 1 г сухой массы листовой ткани (табл. 3). Через 5 дней после внесения в питательную среду Си804 в концентрации 50 мкМ или 100 мкМ содержание меди в листьях растений
рапса достоверно не изменилось, но и при 150 мкМ увеличение составило менее 40%. Даже и более продолжительный, 10-дневный рост привел к аккумуляции меди в листьях рапса опытных вариантов, лишь в 2,2-2,6 раза превышающей уровень растений контрольного варианта.
Обсуждение результатов. Как и следовало ожидать, исходя из опубликованных нами ранее результатов [10] и литературных данных [9, 11], сернокислая медь сильно превосходила по токсичности 2п804. Поэтому в предварительных опытах были подобраны сопоставимые по основным эффектам концентрации изучаемых стрессоров, которые были применены в настоящей работе. Их действие сказалось на всех изученных физиологических параметрах, хотя и проявилось в разной степени. При этом почти во всех экспериментах цинк использовался в концентрации на порядок более высокой, чем медь: Тх\$0^ - 500 (в одном опыте 300 мкМ) - 1500 мкМ, Си804 - 50 - 150 мкМ.
В результате проведенных опытов была установлена довольно высокая устойчивость рапса сорта Вестар на стадии прорастания семян как к меди, так и в несколько большей степени к цинку. Характерно, что ингибирующий эффект обоих тяжелых металлов проявлялся в большей мере в снижении энергии прорастания, слабо задевая (цинк) или совсем не влияя (медь) на всхожесть, но замедляя прорастание (рис. 1, 3). Однако негативный эффект и меди и особенно цинка сильно проявился на следующей стадии развития - в торможении роста корня проростка. Полное прекращение его роста было достигнуто на 4-й день прорастания при концентрации сернокислой меди 150 мкМ, цинка - 1000 мкМ, меньшие концентрации лишь частично тормозили рост (рис. 2, 4).
Вторая часть представленной работы была выполнена на растениях рапса сорта Вестар, предварительно в течение 3 недель выращенных в оптимальных условиях, после чего подвергнутых воздействию стрессоров. Значительно более высокая устойчивость растений к гп804 в сравнении с Си804 отчетливо видна на рис. 5. За 10 дней опыта торможение аккумуляции биомассы растений рапса максимальной концентрацией цинка составило около 30%, тогда как даже минимальная концентрация меди ингибировала рост более, чем на 55%. Особенно сильно подавляла медь рост корневой системы молодых растений рапса (табл. 1), при высоких концентрациях этого стрессора корни практически переставали расти на 5-й день воздействия, но и при 50 мкМ рост корней лишь слегка превысил 1/4 контрольного варианта. Напротив, цинк достоверно снижал рост корневой системы только при 1000-1500 мкМ, максимальное ингибирование не превосходило 38% от контроля.
У растений рапса были обнаружены резкие различия между изучаемыми стрессорами по такому очень важному показателю, как поступление тяжелых металлов в надземные органы (табл. 2, 3). Оказалось, что поступление меди в листья рапса происходило лишь после заметного лаг-периода, размер аккумуляции был невелик - максимально лишь в 2.6 раза в сравнении с контролем, при этом почти не проявлялся дозовый эффект действия стрессора (табл. 3). Сходные характеристики распределения меди по органам, и, прежде всего, слабое перемещение ее в надземные органы, ранее были отмечены для растений фасоли [9].
Напротив, цинк в растениях рапса быстро поступал в листья и интенсивно аккумулировался в них (табл. 2). Максимальная концентрация цинка в листовых тканях приблизилась к 2 мг в 1 г сухой массы, что в 20 раз превосходило его содержание в листьях растений контрольного варианта. Такая интенсивная аккумуляция цинка в листьях рапса вполне согласуется с тем фактом, что именно
среди растений семейства Brassicaceae, к которым принадлежит и рапс, более всего видов растений гипераккумуляторов цинка, в том числе самый яркий их представитель - Thlaspi caerulescens [12].
Таким образом, представленные в настоящем исследовании данные приводят к заключению, что хотя на уровне проростков не выявлено существенных различий в токсическом действии цинка и меди, однако очевидно, что молодые, вполне сформированные растения рапса сорта Вестар более успешно адаптируются к повышенным концентрациям сернокислого цинка в сравнении с медью. Возможно, это обусловлено различием механизмов адаптации на разных стадиях онтогенеза. В этой связи следует отметить, что одним из существенных условий лучшей адаптации к избытку цинка в среде в сравнении с медью может являться обнаруженная в настоящей работе способность растений рапса перемещать большие количества цинка в надземные органы и аккумулировать в листьях, не снижая при этом в существенной степени (пропорционально) рост листьев. Безусловно, ведущую роль в этом процессе должен играть мембранный транспорт и компартментация цинка вне зон активного метаболизма клеток листа [И, 13], к изучению которых мы приступили.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hall J.L, Williams L.E. Transition metal transporters in plants // Journal of Experimental Botany. - 2003. - V. 54. - P. 2601 - 2613.
2. Van Assche F., Clijsters H. Effects of metals on enzyme activity in plants // Plant Cell Environment. - 1990. - V.13. - P. 195 - 206.
3. Dietz Baier М., Kraemer U. Free radicals and reactive oxygen species as
mediators of heavy metal toxicity in plants // Prasad MNV, Hagemeyer J, eds. Heavy metal stress in plants: from molecules to ecosystems. - Berlin: Springer-Verlag, 1999. -P. 73 -97.
4. Ильин В.Б. Тяжелые металлы в системе почва - растение. - Новосибирск: Наука, 1991.
5. Baker Brooks R.R. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metal
elements - a review of their distribution, ecology and phytochemistry // Biorecovery. - 1989.-V. 1.-P. 81-126.
6. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. - М.: Высшая школа, 2006.
7. BarylaA., Carrier P., Frank F., Coulomb C., Sahut C., Havaux M. Leaf chlorosis in oilseed rape plants (Brassica napus) grown on cadmium-polluted soil: causes and consequences for photosynthesis and growth // Planta. - 2001. - P. 696-709.
8. Herrero E.M., Lopez-Gonzalvez A., Ruiz M.A., Lucas-Garcia J.A., Barbas C. Uptake and distribution of zinc, cadmium, lead and copper in Brassica napus var. oleifera and Helianthus annus grown in contaminated soils //' International J. Phytoremediation. -2003.- 5 (2).-P. 153-167.
9. Cuypers A., Vangronsveld J., Clijsters H. Peroxidases in roots and primary leaves of Phaseolus vulgaris. Copper and zinc phytotoxicity: a comparison // J. Plant Physiol. -2002.-V. 159.-P.869-876.
10. Холодова В.П., Волков КС., Кузнецов Вл.В. Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка растений хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации // Физиология растений. - 2005. - Т. 52. - С. 848 - 858.
11. Grotz N., Guerinot M.L. Molecular aspects of Cu, Fe and Zn homeostasis in plants // Biochimica et Biophysica Acta. - 2006. - V. 1763. - P. 595-608.
12. Pence N.S., Larsen P.B., Ebbs S.D., Letham D.L.D., Lasat M.M., Garvin D.F., Eide D., Kohian L.V. The molecular physiology of heavy metal transport in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // PNAS. - 2000. -V. 97. - P. 4956 - 4960.
13. Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants // Biochimie. - 2006. - V. 88. - P. 1707- 1719.
COMPARATIVE ANALYSIS OF OILSEED RAPE PLANT TOLERANCE TO EXCESSIVE COPPER AND
ZINC CONCENTRATIONS
N.V. Radionov, K.S. Volkov V.P. Kholodova
Timiriazev Institute of Plant Physiology RAS Botanicheskaya st., 35, 127276, Moscow, Russia
Exploration of plant tolerance to unfavorable environmental conditions such as heavy metals is the important task of the modern biology. The analysis of oilseed rape tolerance to high copper and zinc concentrations presented. The influence of heavy metals on different physiological parameters, among which seed germination, inhibition of root growth, alteration of whole plant biomass and individually leaves and roots was shown. Also authors give attention to data of metal accumulation in overground plant organs. Copper was concluded to show the major toxic effect rather than zinc.
