CC BY
35
6. Технология производства поликристаллического кремния [Электронный ресурс] URL: http://masters.donntu.edu.ua/2006/ eltf/protsenko/index.htm (дата обращения 07.09.2013).
7. Фалькевич Э.С., Пульнер Э. О., Червонный И.Ф. Технология полупроводникового кремния. М.: Металлургия, 1992. 408 с.
УДК 573.6:579.6
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ ГУАНИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ ПРИ ВЕРМИКОМПОСТИРОВАНИИ
1 л 4
© Н.М. Хаптанова1, З.Ф. Дугаржапова2, В.Ж. Цыренов3
1,2ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора, 664047, Россия, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78. 3 Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, 670013, Россия, Республика Бурятия, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40а.
Впервые изучено содержание гуанина, гуанозина и ГМФ в курином помете и биогумусе, отобранных в процессе вермикомпостирования в научно-производственном цехе птицефабрики СХАО «Белореченское» Усольского района Иркутской области. Определен качественный и количественный состав компонентов нуклеиновых кислот методами высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной и тонкослойной хроматографии. В биогумусе отмечалось достоверное снижение содержания гуанина, гуанозина и ГМФ по сравнению с куриным пометом. Ил. 1. Табл. 1. Библиогр. 12 назв.
Ключевые слова: гуанин; гуанозин; куриный помет; биогумус; вермикомпостирование.
COMPARATIVE ANALYSIS OF GUANINE AND ITS DERIVATIVE CONTENTS UNDER VERMICOMPOSTING N.M. Khaptanova, Z.F. Dugarzhapova, V.Zh. Tsyrenov
Federal Government Health Care Institution Irkutsk Research Institute for Plague Control of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, 78 Trilisser St., Irkutsk, 664047, Russia. East - Siberian State University of Technology and Management, 40a Kluchevskaya St., Ulan- Ude, 670013, Buryat Republic, Russia.
The authors pioneered the study of the content of guanine, guanosine and guanosine monophosphate (GMP) in fowl manure and biohumus selected under vermicomposting in the scientific production unit of the poultry factory "Belo-rechenskoye" Agricultural JSC Usolje district of the Irkutsk region. Using the methods of high performance reverse phase liquid and thin-layer chromatography the qualitative and quantitative composition of nucleic acid components is determined. A significant decrease in the content of guanine, guanosine and GMP is registered in biohumus as compared with fowl manure.
1 figure. 1 table. 12 sources.
Key words: guanine; guanosine; fowl manure; biohumus; vermicomposting.
В настоящее время проблема переработки отходов сельского хозяйства в Российской Федерации остается актуальной. Сельскохозяйственное производство дает 250 млн тонн отходов в год, из них 150 млн тонн приходится на животноводство и птицеводство, 100 млн тонн - растениеводство. По данным Всемирной организации здравоохранения, навоз, помет и сточные воды животноводческих и птицеводческих предприятий являются фактором передачи более сотни возбудителей инфекционных и инвазионных болезней, в том числе зоонозов. К тому же, органические отходы служат благоприятной средой для сохранения и размножения патогенной микрофлоры, содержат повышенное количество тяжелых металлов, пестицидов, химических веществ, семян сорных рас-
тений и других загрязнений.
Особое внимание заслуживает проблема утилизации куриного помета птицефабрик. В настоящее время более 600 птицеферм по всей стране производят до 300 тонн помета в сутки. Отсутствие технологий по утилизации отходов птицефабрик оказывает негативное влияние на состояние окружающей среды. Происходит загрязнение прилегающих к птицефабрикам почв, водоемов, лесов и пастбищ. Большая часть органического сырья не перерабатывается, накапливается вблизи птицефабрик, образуя «пометные озера» без признаков жизни флоры и фауны. Птичий помет как удобрение теряет свои ценные питательные свойства и представляет экологическую угрозу. В итоге наносится серьезный экономический, экологический
1Хаптанова Наталья Маркеловна, лаборант-исследователь, тел.: 89021668344, е-mail: [email protected] Khaptanova Natalya, Research Assistant, tel.: 89021668344, e -mail: [email protected]
2Дугаржапова Зоригма Федоровна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник Отдела зоонозных инфекций, тел.: 89641150242, е-mail: [email protected]
Dugarzhapova Zorigma, Candidate of Medicine, Researcher of the Department of Zoonotic Infections, tel.: 89641150242, e-mail: [email protected].
3Цыренов Владимир Жигжитович, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биотехнологии, тел.: (3012) 431415. Tsyrenov Vladimir, Doctor of Biology, Professor, Head of the Department of Biotechnology, tel.: (3012) 431415 .
и социальный ущерб не только сельскохозяйственным землям, но и жителям близлежащих населенных пунктов.
Куриный помет может быть использован в качестве основного компонента при производстве высокоэффективных органических удобрений. Несмотря на высокое содержание химических элементов, применение его в качестве органического удобрения ограничено по санитарно-гигиеническим нормам. В зависимости от условий хранения в 1 г пометной массы находится до миллиарда микробных клеток разнообразных групп микроорганизмов (грибы, актиномицеты, дрожжи, бактерии и др.), присутствуют бактериофаги, личинки гельминтов и насекомых [2]. В курином помете содержится мочевая кислота, мочевина, аммиак, креатин, орнитуровая кислота, а также гуанин, нерастворимый в воде [7]. Гуанин встречается в свободном виде и в составе нуклеиновых кислот клеток животных и растений. Значительные его количества содержатся в чешуе и коже рыб [4]. Он является составной частью экскрементов пауков и птиц. Это пуриновое основание (6-окси-2-аминопурин) впервые выделено Унгером в 1844 г. из «гуано», разложившегося в условиях сухого климата помёта морских птиц. Спустя полвека, Фишером определена структура гуанина и предложена схема превращения мочевой кислоты в гуанин [3, 10, 11]. Вместе с тем, аллергологи признали гуанин, содержащийся в экскрементах клещей, токсичным и сильнейшим аллергеном [12]. Приемлемой технологией, которая позволяет с минимальными материально-техническими и трудовыми затратами перерабатывать всю пометную массу, является вермикомпостирова-ние, которое основано на разведении калифорнийских червей и получении органического удобрения - биогумуса.
Утилизация гуанина куриного помета в процессе вермикомпостирования и переход его в гуанозин и гуанозинмонофосфат представляет научный и практический интерес.
Цель работы - изучение содержания гуанина и его производных в курином помете и биогумусе при вермикомпостировании.
Материалы и методы. Материалом для исследования послужили куриный помет и биогумус, полученный в процессе вермикомпостирования на базе научно-производственного цеха птицефабрики СХАО «Белореченское» Усольского района Иркутской области. Пробы были отобраны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.4.4.02-84 [1].
Определение содержания свободных гуанинсо-держащих нуклеотидов в исследуемых пробах, а также низкомолекулярных азотсодержащих соединений в животных тканях проводили по методике Северина. К 2 г пробы добавляли 5 мл 0,3 N раствора хлорной кислоты, охлаждали в течение 20 мин. Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин. К осадку приливали 2 мл холодной 0,2 N хлорной кислоты, перемешивали при охлаждении в течение 20 мин и вновь центрифугировали при тех же условиях. Экстракцию 0,2 N раствором хлорной кислоты проводили трижды. Экстракты объединяли, нейтрализовали
5 N раствором гидроксида калия по универсальному индикатору, охлаждали; выпавший осадок перхлората калия отделяли центрифугированием. Полученный экстракт исследовали методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6].
Наличие гуанина, гуанозина и ГМФ в экстрактах куриного помета и биогумуса проводили с помощью ТСХ на пластинах «Силуфол UV-254» в системе растворителей пропанол-1-аммиак-вода (20:12:3). При обнаружении искомых компонентов исследования продолжены определением их количественного содержания методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США) с ультрафиолетовым детектором переменной частоты 254 нм. При хроматографии исследуемых компонентов применяли колонку zorbax eclipse XDB-C8 4.6x150 mm 5-micron. В качестве подвижной фазы использовали 0,06 М фосфатный буфер рН 5,8. Скорость подачи элюента составляла 1,5 мл/мин при температуре колонки 20°С. Исследования полученных экстрактов проведены в трех повторностях.
Оценка результатов лабораторных исследований проведена методом внешнего стандарта с использованием контрольных «свидетелей» - растворов гуанина, гуанозина и ГМФ (Sigma, США). Растворы стандартов сравнения готовились в подвижной фазе в концентрации 1 мг/мл в объеме 20 мкл.
Результаты исследований. В исследуемых экстрактах куриного помета и биогумуса определено качественное содержание гуанина, гуанозина и ГМФ методом ТСХ. При исследовании экстрактов в системе растворителей пропанол-1-аммиак-вода (20:12:3) обнаружены «пятна», соответствующие растворам контрольных «свидетелей». Расположение компонентов нуклеиновых кислот на хроматограмме визуально просматривали с помощью ультрафиолетовых лучей на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция).
Во всех образцах экстрактов куриного помета отмечалось присутствие гуанина, гуанозина и ГМФ. В одном из образцов экстракта биогумуса гуанин не обнаружен, ввиду его возможного перехода в гуанозин или ГМФ с помощью микроорганизмов-биотрансформаторов кишечника калифорнийских червей. Ранее нами из кишечника калифорнийского червя была выделена культура Brevibacterium brevis, при изучении которой определена способность этой культуры синтезировать гуаниновые нуклеотиды из их предшественника - гуанина. Результаты исследования показали, что содержание гуанина в процессе ферментации по методу Misawa снизилось в 3,9 раза (с 3,1 до 0,8 мг/г). Изменение содержания гуанина и образование ГМФ может свидетельствовать об участии микроорганизма Br. brevis в биотрансформации нуклеиновых производных [9].
Исследование полученных экстрактов, содержащих свободные нуклеотиды, продолжено методом ВЭЖХ. При разделении экстрактов куриного помета и биогумуса идентифицировали хроматографические пики гуанина, гуанозина и ГМФ, демонстрирующие выход компонентов нуклеиновых кислот куриного помета (ГМФ - 2,8 мин, гуанин - 4,2 мин и гуанозин -
б)
Хроматограммы компонентов нуклеиновых кислот
16,3 мин) и биогумуса (ГМФ - 2,8 мин, гуанин - 4,0 мин и гуанозин - 12,2 мин).
По результатам ВЭЖХ время удерживания ГМФ куриного помета и биогумуса совпало и составило 2,8 мин. Разность времени удерживания гуанина куриного помета и гуанина биогумуса незначительна и составляет 4,0±0,2 мин. Сроки выхода гуанозина экстракта куриного помета (16,3) и биогумуса (12,2) отличаются на 4,1 мин. Сравнение их хроматограмм не показало существенных различий в идентичности происхождения компонентов нуклеиновых кислот (рисунок).
Содержание компонентов нуклеиновых кислот в курином помете и биогумусе, изученное методом ВЭЖХ, указывает на снижение гуанина в биогумусе по сравнению с куриным пометом в 3,3 раза, гуанозина в 8,5 раза и ГМФ в 3,7 раза (таблица).
Определение содержания компонентов нуклеиновых кислот в курином помете и биогумусе методом ВЭЖХ
Компоненты нуклеиновых кислот Содержание, мг/г абс. сухого вещества
Куриный помет Биогумус
Гуанин 2,9*10-3±0,6 0,89*10-3±0,2
Гуанозин 6,3 *10-3±1,3 0,74*10-3±0,1
ГМФ 10,6*10-3±2,6 2,9*10-3±0,6
Уменьшение количества гуанина, на наш взгляд, может быть обусловлено его биотрансформацией в
в экстрактах куриного помета (а) и биогумуса (б)
гуанинсодержащие нуклеотиды. Что подтверждает теорию «запасного» пути биосинтеза нуклеотидов из метаболических предшественников микроорганизмами.
В исследованиях Нара с соавторами осуществили биосинтез гуанозинмонофосфата (ГМФ) из гуанина с помощью Brevibacterium ammoniagenes штамм АТСС 6872 с использованием питательной среды, содержащей глюкозу, мочевину, дрожжевой экстракт, биотин [8].
Прогнозируемый рост содержания гуанозина и ГМФ в биогумусе не оправдался из-за возможного их использования микроорганизмами в процессе жизнедеятельности. Для отслеживания биотрансформации гуанина куриного помета при вермикомпостировании и достоверности определения количественных характеристик необходимо дальнейшее изучение с использованием радиоактивных меченых соединений.
Выводы. В экстрактах куриного помета и биогумуса методом ТСХ обнаружено наличие гуанина, гуа-нозина и ГМФ.
1. В исследуемых материалах методом ВЭЖХ отмечалось снижение содержания гуанина в биогумусе по сравнению с куриным пометом в 3,3 раза, гуано-зина в 8,5 раза и ГМФ в 3,7 раза.
2. Для подтверждения биотрансформации гуанина куриного помета в гуанозин и ГМФ при верми-компостировании, достоверного определения их количественных характеристик необходимо дальнейшее изучение с использованием радиоактивных изотопов.
Библиографический список
1. ГОСТ 17.4.4.02-84. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа.
2. Сидоренко О.Д., Черданцев Е.В. Биологические технологии утилизации отходов животноводства. М.: МСХА, 2001. 75 с.
3. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия: учеб. пособие. М.: Высшая школа, 2000. Т.3. 479 с.
4. Корпачев В.В. Целебная фауна. М.: Наука, 1989.189 с.
5. Куликов П.И. Производство муки, жира и белково-витаминных препаратов в рыбной промышленности. 3-е изд. М.: Пищевая промышленность, 1971. 264 с.
6. Практикум по биохимии: учеб. пособие / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. 2-е изд. М.: Изд-во МГУ, 1989.
509 с.
7. Селянский В.М. Анатомия и физиология сельскохозяйственной птицы. М.: Колос, 1972. 356 с.
8. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Исследование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: Наука, 1976. 336 с.
9. Изучение микроорганизмов, участвующих в процессе вермикомпостирования / Н.М. Хаптанова, З.Ф. Дугаржапова, Н.Г. Гефан [и др.] // Вестник ВСГУТУ / отв. ред. Б.Б. Танга-нов. Улан-Удэ, 2013. №1 (40). С.90-95.
10. http://vse-pro-geny.ru
11. Whitworth, Melissa (2008-10-16). "Geisha facial, the 'latest beauty secret' of Victoria Beckham, brought to the masses". Lifestyle. Telegraph. Retrieved 2008-11-20.
12. http://lviv.hyla.ua/functions/mattress.php
а
