CC BY
53
сравнительный анализ секреторного профиля
МЕЗЕНхИМАЛьНых СТРОМАЛьных КЛЕТОК ДЕСНы ЧЕЛОВЕКА,
дифференцированных в миогенном направлении
Д.П. Самчук1, А.А. Пулин 1, И.И. Еремин 1, И.Р. Гильмутдинова 1, И.Н. Корсаков 1, ВЛ. Зорин 12, А.И. Зорина 2, О.С. Гринаковская1, Н.Л. Лазарева 1, П.С. Еремин1, А.П. Петрикина 1, А.Е. Гомзяков 1, Р.В. Деев 23, Д.А. Тимашков 1, НК. Витько 1, К.В. Котенко 4, П.Б. Копнин 5
1 Центральная клиническая больница с поликлиникой, Москва, Россия
2 Институт стволовых клеток человека, Москва, Россия
3 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
4 Гпавное медицинское управление Управления делами Президента Российской Федерации, Москва, Россия
5Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва, Россия
Comparative analysis of secretory profile of human mesenchymal stromal cells differentiated in myogenic direction
D.P. Samchuk 1, A.A. Pulin 1, I.I. Eremin 1, I.R. Gilmutdinova 1, I.N. Korsakov1, V.L. Zorin 1 2, A.I. Zorina 2,
O.S. Grinakovskaya 1, N.L. Lazareva 1, P.S. Eremin 1, A.P. Petrikina 1, A.E. Gomzyakov1, R.V. Deev 2,3, DA. Timashkov1,
N.K. Vit'ko 1, K.V. Kotenko 4, P.B. Kopnin 5
1 Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow, Russia
2 Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia
3 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
4 Central Medical Authority of the Business Administration for the President of the Russian Federation, Moscow, Russia
5 N.N. Blokhin Cancer Research Center, Moscow, Russia
В настоящее время продолжают накапливаться данные, раскрывающие механизмы поддержания гомеостаза различных тканей за счет действия цитокинов вне связи с воспалительной реакцией . Скелетная мускулатура вырабатывает широкий спектр биологически активных молекул как в норме, так и при повреждениях различной этиологии, причем данные свойства наследуются также культурами клеток, выделенных из нее В связи с этим особую актуальность приобретает изучение цитокинов, секретируемых клетками с миогенным потенциалом, так как это позволит выбирать оптимальные типы клеток и их источники для применения в клинике
Нашим исследовательским коллективом ранее продемонстрирована возможность получения миогенных клеток из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из слизистой оболочки полости рта (десны). Однако секреторный профиль данного типа клеток еще не изучен
Исследование проведено на культурах фибробластов кожи, ММСК прикрепленной и подвижной частей десны и ММСК десны, дифференцированных в миогенном направлении Культуры клеток выделяли из биоптатов кожи и десны 15 здоровых добровольцев . Методом иммунофер-ментного анализа в культуральной среде изучены уровни 48 про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов и факторов роста
Продемонстрирована тенденция повышения секреторной активности в отношении большинства белков в ряду «фибробласты кожи — ММСК прикрепленной десны — ММСК подвижной десны — дифференцированные миобла-сты», включая факторы, принимающие непосредственное участие в миогенезе, репарации и поддержании гомеостаза мышечной ткани
Таким образом, культура ММСК подвижной части десны до и после индукции миогенной дифференцировки потенциально обладает положительным эффектом в отношении регенерации скелетной мускулатуры Полученные результаты дают основания рассматривать выявленную нами субпопуляцию ММСК подвижной части десны в качестве перспективного кандидата для клинического применения у пациентов с заболеваниями мышечной ткани
Ключевые слова: десна, мультипотентные мезенхи-мальные стромальные клетки десны, миобласты, миогенная дифференцировка, цитокины, хемокины, факторы роста
e-mail: andreypulin@gmail . com
Up to this day there are lots of data accumulated about the role of cytokines in regulation of different tissues homeostasis independently of inflammation framework . Skeletal muscles produce a wide range of biologically active molecules both in a normal condition and after injuries of different etiologies . Moreover, cultures of cells isolated from muscle tissue show same properties . In this regard identification of cytokines profile secreted by cells with myogenic potential is of particular importance as it will help to choose optimal cell types and their sources for clinical application
Our research group previously demonstrated the possibility of obtainment of myogenic cells from gingival mucosa derived multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) However, secretory profile of this myogenic cells is not thoroughly investigated to this day
The study was conducted on cultures of skin fibroblasts, MMSc derived from the attached and alveolar parts of the gingival mucosa and gingival mucosa MMSc, differentiated in a myogenic direction cells were isolated from skin and gingival mucosa biopsy specimens of 15 healthy volunteers . ELISA assay was performed for evaluation of 48 proinflammatory and anti-inflammatory cytokines, chemokines and growth factors
Our data demonstrates tendency of most investigated proteins secretion gradual increase in the following sequence: skin fibroblasts — attached gingival mucosa MMSC — alveolar gingival mucosa MMSC — differentiated myoblasts, including factors directly involved in myogenesis, skeletal muscle homeostasis and regeneration
Thus, alveolar gingival mucosa MMSC both before and after induction of myogenic differentiation potentially could facilitate skeletal muscle regeneration Our results indicate that subpopulation of MMSC derived from alveolar gingival mucosa are perspective candidates for clinical usage in patients with skeletal muscle disorders
Keywords: gingiva, gingiva-derived multipotent mesenchymal stromal cell, myoblasts, myogenic differentiation, cytokines, chemokines, growth factors .
Введение
Известно множество примеров участия одних и тех же цитокинов не только в воспалительных реакциях, но и в регенерации тканей . Обмен цитоки-новыми сигналами между клетками скелетной мускулатуры и иммунной системы является важной частью процессов регуляции роста и восстановления мышечной ткани после травмы любой этиологии [1]. Первые прямые доказательства синтеза клетками мышц сигнальных молекул, влияющих на воспалительный ответ, были получены в работе Robertson et al . на мышиной модели острого повреждения мышечной ткани [2]. В данном исследовании было показано, что мышечная ткань после повреждения вырабатывает in vitro хемоаттрактанты для ней-трофилов и макрофагов . В многочисленных исследованиях доказана важная роль гуморального и клеточного звеньев иммунной системы в развитии воспалительного процесса, а также в восстановлении мышц после повреждения в ответ на вырабатываемые локально цитокины В частности, в процессах репарации, ремоделирования и ангиогенеза при остром повреждении мышц участвуют макрофаги [3], при полимиозите наблюдаются реакции, опосредованные Т-клетками [4], при дерматомиозите — преимущественно гуморальный иммунный ответ [4], у пациентов с дистрофинопатиями отмечено участие цитотоксических Т-лимфоцитов [5].
Помимо ответа на воздействие повреждающих факторов клетки скелетной мускулатуры также синтезируют широкий спектр цитокинов как в пассивном состоянии, так и после нагрузки, регулируя процессы пролиферации и дифференцировки, энергетического обмена за счет аутокринного и паракринного механизмов, а также за счет дистантного воздействия (активной выработки цитокинов в сыворотку крови). Основываясь на этих фактах В . К . Pedersen et al . говорят в своей работе о скелетной мускулатуре как об эндокринном органе [6].
В классической теории восстановления мышечной ткани ведущая роль в поддержании гомеостаза отводится сателлитным клеткам [7]. Учитывая трудности, сопряженные с выделением и экспансией са-теллитных клеток, для лечения повреждений мышц различной этиологии предлагаются различные виды других стволовых/прогениторных клеток, в том числе немышечного происхождения [8].
Нашим исследовательским коллективом впервые получены миогенные клетки из мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из слизистой оболочки полости рта (десны) — источника, характеризующегося легкой доступностью и малой травматичностью процедуры забора [9]. Кроме доступности источника и простоты выделения, ММСК десны обладают повышенной способностью к мультипотентной дифференцировке [10-14]. Дальнейшие исследования показали, что только популяция ММСК подвижной части десны способна к миогенной дифференцировке с образованием миотубов in vitro . В то же время ММСК близкой анатомической локализации — прикрепленной части десны, данной способностью не обладают Выявленные отличия требуют дальнейшей детализации
Известно, что популяции ММСК, выделенные из различных источников (красный костный мозг, плацента, жировая ткань и т д ), отличаются по профи-
лю и уровню вырабатываемых цитокинов [15, 16]. Более того, секреторная активность ММСК человека, полученных из одного и того же типа ткани, варьирует в зависимости от анатомической локализации источника [17]. Это имеет важное значение, так как различные цитокиновые профили различных популяций могут привести к различным терапевтическим исходам . Так N . Naftali-Shani с соавт . (2013), сравнивая ММСК из 4 источников (предсердия, подкожной жировой клетчатки, жировой клетчатки пери- и эпикарда), установили, что ММСК предсердия и эпикарда вырабатывают наибольшее количество провоспалительных и трофических цитокинов in vitro, что сопровождалось нарушением регенерации сердца в экспериментах in vivo с увеличением площади фиброза [18]. J .Y. Hsieh с соавт. (2013) при сравнении популяций ММСК красного костного мозга и студенистого вещества пуповины выявили, что последние обладают большим нейропротективным, нейро- и ангиогенным действиями [19].
По сравнению с другими типами клеток с мио-генным потенциалом, которые способны интегрироваться в поврежденные скелетные мышцы даже при системном введении [20], доля дифференцированных в миогенном направлении ММСК после трансплантации невысока [21]. Одним из возможных объяснений терапевтического эффекта ММСК может служить их паракринное воздействие на окружающие ткани путем секреции ростовых факторов и цитокинов [7]
Таким образом, учитывая регуляторную роль ци-токинов, как в норме, так и при поражении мышечной ткани, важным фактором, определяющим эффективность препаратов на основе клеток, является их цитокиновый профиль [22—24], в дополнение к способности восстанавливать функциональное состояние за счет прямой миогенной дифференциров-ки данных клеток [25]
В связи с этим особую актуальность приобретает изучение цитокинов, секретируемых клетками с миогенным потенциалом, так как это позволит выбирать оптимальные типы клеток и их источники для применения в клинической практике Особый интерес представляют ММСК подвижной десны, дифференцированные в миогенном направлении, секреторный профиль которых не известен
Целью нашего исследования явился анализ цито-киновых профилей культур миобластов, полученных из ММСК десны, в сравнении с ММСК прикрепленной и подвижной частей десны, а также фибробла-стов кожи
Материал и методы Биопсия десны и кожи
После подписания здоровыми донорами (п = 15, 6 женщин и 9 мужчин, средний возраст 39±5 лет) добровольного информированного согласия, в условиях хирургического стоматологического кабинета с соблюдением правил асептики под местным обезболиванием раствором Ультракаина 40 мг/мл (1,7 мл) выполнялась биопсия подвижной десны в ретромолярной области, прикрепленной десны в области дистального моляра нижней челюсти, а также под местным обезболиванием 2% раствором лидокаина проводили биопсию кожи заушной области
Объем биоптата составлял 3—4 мм3 . Биоптаты помещали в стерильные пробирки (BD Falcon, США) с транспортировочной питательной средой: a-MEM (Sigma, США), 2% FBS (HyClone, США), 200 ед . /мл пенициллина, 200 мг/мл стрептомицина, 200 ед . /мл амфотерицина (Stem Cell Technologies, США) — маркировали и доставляли в течение 2 ч при температуре + 4°С в лабораторию .
Получение ММСК десны
Все манипуляции с биоматериалом были выполнены в соответствии со стандартами GTP (Good tissue practice) и GLP (Good laboratory practice), а также стандартными операционными процедурами, принятыми в Центре биомедицинских технологий ФГБУ «ЦКБ с поликлиникой» .
Биоптат десны инкубировали при 4°С в течение 2—3 ч . в среде DMEM/F12 (StemCell Technologies, США) с добавлением 10% FBS (Biological Industries, Израиль), после чего подвергали ферментативной обработке 0,15% раствором коллагеназы II типа (Sigma, США) при 37°С в течение 12 ч . По окончании активность фермента инактивировали добавлением эквивалентного объема (Biological Industries, Израиль) . Для получения первичной культуры ММСК десны суспензию клеток дважды отмывали средой DMEM/ F12 с добавлением 15% FBS и переносили в той же среде во флаконы в плотности 3х105 клеток/см2 . По достижении конфлюэнтности клетки снимали с поверхности пластика при помощи 0,05% раствора трипсина/ЭДТА (StemCell Technologies, США) . ММСК культивировали при 37°С и 5% СО2 до 3 пассажа с заменой среды каждые 3 сут Для подсчета и оценки жизнеспособности клеток использовали автоматический счетчик клеток «Countess» (Invitrogen, США)
Получение фибробластов кожи
Ткани биоптатов подвергали ферментативной обработке 0,05% коллагеназой II типа (Sigma, США) при температуре 37°С в течение 12 ч . Полученную суспензию клеток пипетировали с последующим центрифугированием при 200 g в течение 10 мин Клеточный осадок ресуспендировали и полученные суспензии одиночных фибробластов культивировали при 37°C, 5% CO2 в стандартной культуральной среде DMEM (Sigma, США) с добавлением 20% сыворотки FBS Defined (HyClone, США), 40 мкг/мл гентамицина (Sigma, США) в течение 14 сут . В дальнейшем клетки снимали с поверхности флаконов 0,05% раствором трипсина/ЭДТА (StemCell Technologies, США) и пассировали с плотностью 104 клеток/см2 в той же культуральной среде, но с уменьшенным до 10% содержанием сыворотки Клетки культивировали до 3 пассажа, пассировали при достижении культурой 80—90% монослоя . Замену среды осуществляли каждые 3 сут . В работе использовали культуральную посуду фирмы Corning-Costar (США).
Индукция миогенной дифференцировки
Для индукции миогенной дифференцировки клетки рассевали с высокой плотностью 5х105/см2, культивировали в среде DMEM/F12, 20% FBS (HyClone, США) до 90—100% конфлюэнтного монослоя, затем среду заменяли на DMEM с низким содержанием
глюкозы (HyClone, США) с добавлением 2% лошадиной сыворотки (BioInd, Израиль) и инкубировали при 37°С и 5% СО2 до появления миотубоподобных структур
Отбор проб для исследования
Культуры миобластов на 10 сут после начала индукции, а культуры ММСК и фибробластов на 3 пассаже по достижении высокой конфлюэнтности трехкратно отмывали от культуральной среды раствором фосфатно-солевого буфера (StemCell Technologies, США), после чего добавляли среду DMEM (StemCell Technologies, США) без сыворотки и инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение 3 сут . Затем осуществляли отбор проб культуральной среды в стерильные промаркированные пробирки, которые немедленно замораживались при -80°С
Иммуноферментный анализ
Исследование биологически активных молекул в культуральной среде проводили с использованием проточного мультиплексного лазерного анализатора Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США), в основе которого лежит технология xMap (основана на реакции взаимодействия антиген — антитело на поверхности окрашенных полистирольных микросфер диаметром 5 мкм). Нами были выбраны 2 панели: Bio-Plex Pro Human Cytokine 21-Plex Panel (Bio-Rad, США) и Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-Plex Panel (Bio-Rad, США), которые включали следующие про-и противовоспалительные цитокины, хемокины, факторы роста: IL-1 a, IL-2ra, IL-3, ^-12р40, IL-16, IL-18, CTACK, GRO-a, HGF, IFN-a2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, ß-NGF, SCF, SCGF-ß, SDFIa, TNF-ß, TRAIL, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, ^-12р70, IL-13, IL-15, IL-17, FGF basic, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, IP-10, MCP-I(MCAF), MIP-1a, MIP-1b, PDGF-bb, RANTES, TNF-a, VEGF .
Подготовку проб и измерения проводили строго в соответствии с протоколами производителя
До начала исследования образцы культуральных сред хранили при температуре -80°С Повторное замораживание и размораживание образцов не допускалось Оттаивание образцов осуществляли в условиях комнатной температуры (18—25°С).
Контролем служила интактная культуральная среда DMEM (StemCell Technologies, США). Измерения образцов дублировались Для промывки 96-луноч-ных микропланшетов использовали автоматическую систему для промывки Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США)
Измерения проводили с низким и высоким разрешением . Результаты измерений были представлены с помощью программы Bio-Plex Manager 5 . 0 (BioRad, США) При статистической обработке значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимались за 0 пг/мл . Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю границу чувствительности, то его концентрацию принимали равной верхней границе
Статистический анализ
Статистический анализ выполнялся в программе STATISTICA 7 . 0 (Stat soft INC, . США) . Статистическая значимость различий между группами выявлялась
с помощью критерия Краскела — Уоллиса с последующим попарным сравнением с помощью критерия Вилкоксона . Данные приведены в виде: медиана, 25-й перцентиль, 75-й перцентиль . Различия признавали статистически значимыми при p<0,05 .
Результаты
При сравнении секреторной активности ММСК подвижной и прикрепленной десны, кожи и дифференцированных миобластов выявлены статистически значимо (p<0,05) большие уровни IL-1a, IL-2Ra, IL-3, IL-12p40, IL-16, IL-18, CTACK, GROa, HGF, IFN-a2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, SCF, SCGF-b, TNF-p, TRAIL, IL-1ra, IL-6, IL-15, IL-17, GM-CSF, IFN-g, MCP-I(MCAF), IL-1b в культуральной среде миобластов по сравнению с ММСК, выделенными из подвижной части десны . Концентрация IL-8, напротив, была значимо выше в культуральной среде ММСК подвижной десны. Не выявлено значимых различий в секреции дифференцированными миобла-стами и ММСК подвижной десны b-NGF, SDF-1a, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p70, IL-13, Eotaxin, PDGF-bb, IP-10, TNF-a, вместе с тем, их концентрация в куль-туральной среде миобластов была значимо выше, чем в культуральной среде фибробластов кожи . Концентрация VEGF была значимо ниже, чем в
культуральных средах ММСК прикрепленной десны и фибробластов кожи Концентрация G-cSF была значимо выше в культуральной среде миобластов по сравнению с культуральной средой ММСК, выделенных из прикрепленной части десны, не отличаясь значимо от таковой в культурах ММСК подвижной десны и фибробластов кожи Концентрация IL-4, FGF basic, RANTES в культуральной среде дифференцированных миобластов не отличались значимо от их концентрации в культуральных средах ММСК десны и фибробластов кожи
ММСК подвижной части десны, в свою очередь, отличались от ММСК, выделенных из прикрепленной десны, более активной секрецией IL-2Ra, IL-3, IL-12p40, IL-16, IL-18, CTACK, GROa, HGF, IFN-a2, LIF, MCP-3, MIF, M-CSF, MIG, SCF, SDF-1a, TNF-p, TRAIL, IL-17, Eotaxin, G-CSF, IP-10, MCP-I(MCAF) . Напротив, b-NGF, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12(p70,) IL-13, IFN-g и VEGF более активно секретировались ММСК, выделенными из прикрепленной десны
ММСК прикрепленной части десны более активно по сравнению с фибробластами кожи секрети-ровали HGF, IFN-a2, LIF, M-CSF, MIF, MIG, b-NGF, SCF, SDF-1a, TRAIL, IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-17, Eotaxin, GM-CSF, IFN-g, MCP-1(MCAF), RANTES, TNF-a и значимо меньше G-CSF (табл . , рис . 1—4).
Таблица. Концентрация цитокинов в культуральных средах миобластов, ММСК, выделенных из подвижной и прикрепленной частей десны, и фибробластов кожи
Цитокин Дифференцированные миобласты ММСк подвижной десны ММСк прикрепленной десны Фибробласты кожи
Hu IL-1a 29,93 (26,67-33,45)*х# 15,68( 14,92-17,31)"x# 6,57(6,01-7,43) "* 6,62(6,38-7,20) "*
Hu IL-2Ra 651,85 (621,56743,51) *х# 471,96(424,35-514,71) "x# 271,64(242,41-282,34) 196,39(153,69-235,67) "*x
Hu IL-3 958,56 (902,181031,45) *х# 721,62(693,25-766,42) "x# 400,03(358,99-438,51) 268,31(254,03-299,91) "*x
Hu IL-12p40 1436,82 (1306,111620,48) *х# 1000,56(937,68-1194,21) "x# 484,56(420,69-546,53) 308,08(272,40-390,20) "*x
Hu IL-16 743,66 (717,87804,62) *х# 489,61(463,18-517,92) "x# 306,12(273,59-332,15) 213,54(196,52-238,36) "*x
Hu IL-18 105,35 (96,58-119,88) *х# 43,25(41,15-55,44) "x# 19,29(18,43-20,11) "* 20,64(14,50-25,22) "*
Hu CTACK 371,75 (329,13401,00) *х# 226,05(209,96-267,00) "x# 162,83(153,05-174,10) 133,03(123,34-144,76) "*x
Hu GROa 2516,09 (2389,833001,91) *х# 2134,42(2059,67-2256,12) "x# 1648,82(1559,74-1832,91) "* 1568,75(1407,42-1785,36) "*
Hu HGF 10702,39 (9043,5311328,14) *х# 7723,92(6357,96-8818,18) "x# 3851,45(2678,99-4152,34) 353,10(276,28-581,50) "*x
Hu IFN-a2 107,16 (101,34110,71) *х# 80,16(78,27-82,33) "x# 54,95(52,8959,83) л*# 47,76(45,53-50,51) "*x
Hu LIF 174,95 (150,01194,43) *х# 100,56(92,05-106,39) "x# 56,76(45,50-58,39) 36,99(26,89-48,68) "*x
Hu MCP-3 268,23 (213,20297,71) *х# 197,54(178,61-203,17) "x# 130,91(111,70-141,75) "* 110,18(106,36-127,23) "*
Продолжение таблицы
Цитокин Дифференцированные миобласты ММСк подвижной десны ММСк прикрепленной десны Фибробласты кожи
Hu M-CSF 181,51 (163,22204,72) *х# 111,49(99,80-120,91) "x# 79,44(75,65-86,10) "*# 28,75(23,89-38,03) "*x
Hu MIF 997,64 (879,551167,69) *х# 660,81(611,65-785,49) "x# 531,97(439,02-657,44) "# 411,69(380,12-459,33) "*x
Hu MIG 400,74 (356,18423,04) *х# 223,03(210,89-243,52) "x# 126,28(120,96-132,42) "*# 98,67(90,27-105,19) "*x
Hu b-NGF 54,85 (49,69-56,94) # 44,20(41,00-56,32) x# 62,77(54,32-75,57) *# 34,99(33,98-37,74) "*x
Hu SCF 297,74 (257,87345,23) *х# 151,14(139,59-165,43) "x# 114,54(94,08-120,23) "*# 73,81(65,79-91,29) "*x
Hu SCGF-b 64589,29(55534,59-71211,64) *х# 35384,00(32360,40-40957,70) л 33292,67(25156,15-38466,85) л 28386,95(18786,85-34931,32) л
Hu SDF-1a 1099,87(950,19-1311,96) х# 1145,74(1103,44-1228,44) x# 864,52(785,80-993,44) "*# 514,10(482,82-648,70) "*x
Hu TNF-p 40,17(36,11-57,95) *х# 26,32(23,74-29,56) "x# 12,72(10,78-16,19) "* 11,47(10,57-12,25) "*
Hu TRAIL 308,95(274,69-342,18) *х# 199,88(175,55-215,16) "x# 93,59(76,24-104,58) "*# 52,48(48,58-57,83) "*x
Hu IL-1ra 77,81(67,90-81,56) *х# 58,30(52,07-70,36) "# 52,72(43,8759,43) "# 43,13(38,50-46,29) "*x
Hu IL-4 1,05(0,54-1,17) 0,77(0,72-1,01) 0,69(0,62-0,92) 0,88(0,69-1,05)
Hu IL-5 0,19(0,08-0,29) # 0,40(0,00-0,57) 0,85(0,65-1,66) 0,00(0,00-0,00) л
Hu IL-6 11478,98(11013,21-13362,62) *х# 2330,63(1774,39-3079,38) "# 2115,11(1540,36-3757,49) "# 666,54(497,39-1029,63) "*x
Hu IL-7 2,98(2,23-3,69) х# 1,95(1,26-2,86) x 5,56(4,41-11,44) "*# 1,70(1,21-1,81) "x
Hu IL-8 782,63(586,75-905,94) *х 1188,10(1041,60-1635,62) "# 1341,96(1128,05-1585,68) "# 652,34(513,14-947,32) *x
Hu IL-9 2,15(1,12-2,99) * 0,91(0,50-1,48) "x 2,46(1,74-3,43) *# 1,60(1,50-1,72) x
Hu IL-10 8,58(8,13-9,73) х# 4,09(2,62-5,51) "x 14,06(7,00-16,02) "*# 3,61(3,30-4,20) "x
Hu IL-12p70 15,08(12,69-18,39) х# 23,87(17,76-29,79) x# 51,43(35,33-79,70) "* 60.95(58,40-65,06) "*
Hu IL-13 2,59(1,95-3,29) х# 1,37(1,05-2,02) x# 4,52(3,02-5,15) "* 3,49(3,29-3,86) "*
Hu IL-15 41,11(38,37-43,97) *х# 24,59(22,37-26,83) 16,71(14,47-27,37) "# 8,99(6,81-12,75) "*x
Hu IL-17 3,28(2,81-3,95) *х# 2,48(1,85-2,96) "x# 1,15(0,89-1,32) "*# 0,15(0,03-0,26) "*x
Hu Eotaxin 817,90(615,25-1558,27) х# 899,01(621,88-1115,17) x# 135,21(54,83-222,97) "* 34,09(24,35-72,53) "*
Hu FGF basic 10,72(9,62-14,99) 11,44(7,90-13,11) 11,34(10,92-12,28) 12,05(8,21-13,77)
Hu G-CSF 31,76(27,85-42,85) х 36,83(33,66-47,48) x 11,05(8,99-15,51) "*# 34,60(27,84-41,59) x
Hu GM-CSF 57,37(38,41-76,55) *х# 20,69(17,77-23,29) "# 19,11(11,32-24,67) "# 2,68(0,98-3,48) "*x
Hu IFN-g 59,91(55,88-67,33) *х# 37,29(32,62-41,77) "x 47,05(42,19-50,68) "*# 34,74(30,79-38,82) "x
Окончание таблицы
Цитокин Дифференцированные миобласты ММСк подвижной десны ММСк прикрепленной десны Фибробласты кожи
Hu IP-10 87,19(80,08-164,28) х# 69,91(60,13- 43,60(35,69- 43,25(40,86-
100,28) x# 48,50) "* 53,65) "*
Hu MCP- 3848,57(2982,07- 1972,14(1710,61- 1425,56(1244,39- 803,44(690,51-
1(MCAF) 6422,34) *х# 2263,21) "x# 1707,02) 1076,05) "*x
Hu MIP-1b 2,12(1,38-2,44) * 1,12(0,70-1,25) л 1,34(1,11-1,64) 1,30(1,06-1,61)
Hu PDGF-bb 3,85(3,31-4,52) # 2,93(2,34-4,21) # 2,59(1,86-3,87) 2,19(1,89-2,55) "*
Hu RANTES 35,81(18,25-45,23) 30,10(25,39-46,74) # 29,25(23,06-38,50) # 21,21(15,77-23,68) *x
Hu TNF-a 65,70(59,55-77,27) х# 55,19(51,58-64,60) # 50,70(42,13-61,56) л# 30,97(25,35-44,23) "*x
HuVEGF 192,54(134,34-274,17) х# 288,83(227,60- 645,72(505,06- 589,82(536,20-
381,48) x# 820,06) "* 649,76) "*
Hu IL-1b 1,08(1,00-1,14) *x# 0,64(0,57-0,82) 0,70(0,54-0,76) л 0,51(0,49-0,59) "*x
различия статистически значимы (р<0,05, критерий Вилкоксона) по сравнению с группой 1; * — различия статистически значимы (р<0,05, критерий Вилкоксона) по сравнению с группой 2; х — различия статистически значимы (р<0,05, критерий Вилкоксона) по сравнению с группой 3; #— различия статистически значимы (р<0,05, критерий Вилкоксона) по сравнению с группой 4 .
80 пг/мл
IL-1ra TNF-a IFN-g GM-CSF IL-15 TNF-b IL-1a IL-12p70 IL-1b
■ Миобласты ■ Подвижная десна ■ Прикрепленная десна ■ Фибробласты
Рис. 1. Уровни секреции IL-1a, IL-1b, IL-1ra, TNF-fi, TNF-a, IL-15, GM-CSF, IFN-y, IL-12р70 в исследуемых группах клеток
12000 пг/мл
11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000
4000 I 3000
: I ■ 1. 1111 h. ь.
IL-6 HGF MCP-1 GROa IL-12p40 MIF
■ Миобласты ■ Подвижная десна l Прикрепленная десна ■ Фибробласты
Рис. 2. Уровни секреции IL-6, HGF, MCP-1, GROa, IL-12р40, MIF в исследуемых группах клеток
1400 пг/мл
IL-8 TRAIL МСР-3 VEGF M-CSF LIF IL-18
■ Миобласты ■ Подвижная десна ■ Прикрепленная десна ■ Фибробласты
Рис. 3. Уровни секреции IL-8, TRAIL, MCP-3, VEGF,
M-CSF, LIF, IL-18 в исследуемых группах клеток
Обсуждение
В настоящее время продолжают накапливаться данные, раскрывающие механизмы поддержания го-меостаза различных тканей за счет действия цитоки-нов, вне связи с воспалительной реакцией [26]. Скелетная мускулатура вырабатывает широкий спектр цитокинов в покое и при физической нагрузке [27], причем эти свойства наследуются также клетками, выделенными из данной ткани в качестве первичных культур [28]. Более того, увеличение уровней отдельных цитокинов усиливает миграцию и позиционирование миобластов во время формирования ранних миотубов [29], а во время дифференцировки клеток скелетной мускулатуры, может затормаживать ее, усиливая пролиферацию [30, 31]. Причем данные процессы могут как «самоподдерживаться» за счет аутокринных механизмов [32, 33], так и регулироваться извне [34—36].
Из всего спектра исследованных биологически активных молекул нами были выделены 25 белков, для концентрации которых удалось установить статистически значимые различия между дифференцированными миобластами и остальными типами клеток (IL-1a, IL-1b, IL-1ra, IL-2Ra, IL-3, IL-6, ^-12р40, IL-15, IL-16, IL-18, IFNy, TNF-p, M-CSF, MIF, TRAIL, LIF, HGF, MCP-1, MCP-3, GROa, GM-CSF, CCL27 (CTACK), CXCL9 (MIG), SCF, SCGF-b). Для данных цитокинов прослеживается четкая тенденция к повышению секреторной активности в ряду фибробласты кожи — ММСК прикрепленной части десны — ММСК подвижной части десны — дифференцированные ми-областы
Помимо этого мы включили в обсуждение представляющие интерес белки, не имеющие статистически достоверных отличий между группой дифференцированных миобластов и остальными типами клеток, но имеющие выраженную тенденцию к различию между группами: TNF-a (повышен у дифференцированных миобластов), VEGF и IL-8 (понижены у дифференцированных миобластов)
70000 пг/мл
SCGF-b IL-16 IL-2Ra IL-3 CTACK MIG SCF
■ Миобласты ■ Подвижная десна ■ Прикрепленная десна ■ Фибробласты
Рис. 4 Уровни секреции IL-2Ra, IL-3, IL-16, CTACK,
MIG, SCF, SCGF-b в исследуемых группах клеток
Ниже приведена подробная характеристика выбранных цитокинов с описанием их роли в процессах миогенеза, регуляции гомеостаза и репарации мышечной ткани.
Интерлейкины 1а, 1b, Ira
Нами отмечено статистически значимое повышение уровней экспрессии IL-1a, IL-1b, IL-1ra культурами миобластов (рис . 1), коррелирующие с данными других авторов [36]. Провоспалительные цитокины необходимы для запуска регенераторного процесса в мышечной ткани, что подтверждается результатами многочисленных наблюдений [37,38]. В частности, неадекватное назначение НПВС приводило к увеличению времени восстановления после спортивной травмы [37], задерживая пролиферацию и дифференцировку сателлитных клеток, а также выработку факторов роста [39].
В своей работе F . J . Authier с соавт . (1999) показали активное вовлечение группы IL-1 (включая IL-1a, IL-1b, IL-1ra) в скоординированную регуляцию числа, распределения клеток в объеме ткани во время нормального миогенеза . Более того, авторы установили динамическое изменение уровней цитокинов в зависимости от стадии регенераторного процесса Так, например, уровень IL-1b был максимальным на этапе слияния миобластов [40].
Отмечена постоянная секреция этих цитокинов в культурах миобластов и миотубов [36, 41, 42]. M . Podbregar с соавт . (2013) выявили, что уровень IL-1 в миотубах превышает таковой в миобластах, причем авторами также установлена обратная зависимость между IL-1, IL-6 и TNF-a. Более того, добавление IL-1a в состав культуральной среды наряду с IL-13, TNF-a, IFNy приводит к многократному усилению экспансии миосателлитных клеток in vitro [43].
В противоположность этим наблюдениям W . Li с соавт . (2009) описали катаболическое действие IL-1 на миотубы вплоть до распада миофибрилл, при воздействии больших доз цитокинов [44].
Интерлейкин-ß
Нами зарегистрировано многократное повышение уровня IL-6 в культурах дифференцированных миобластов по сравнению с ММСК десны, которые в свою очередь экспрессируют этот белок на более высоком уровне, чем фибробласты кожи (рис . 2).
Данный цитокин активно вырабатывается мио-бластами, причем его синтез может увеличиваться как в ответ на воздействие провоспали-тельных цитокинов (TNF-a, IFNy) [36,45], так и во время прохождения клеточной дифференци-ровки [27]. Аутокринная выработка IL-6 миобла-стами приводит к увеличению ими экспрессии миогенина и MyHC IIb и к последующему слиянию миотубов [46]. J . M . Peake с соавт. (2015) показали, что IL-6 постоянно вырабатывается в скелетной мускулатуре, и его уровень в плазме увеличивается после физической нагрузки [27] Помимо этого, вырабатываемый мышечными волокнами IL-6 является одним из важнейших регуляторов пролиферации миосателлитных клеток и задействован в гипертрофии мышечной ткани после нагрузки . Причем, он также вырабатывается миоту-бами и за счет паракринного механизма действия стимулирует пролиферацию миобластов [47].
Также описаны и негативные эффекты, оказываемые IL-6 на мышечную ткань, которые способствуют ее истощению . Подобное действие объясняется другой концентрацией, локализацией и временем секреции данного интерлейкина [48].
В отличие от полученных нами данных, P . Li с соавт . (2013) выявили снижение уровня IL-6 после прохождения миогенной дифференцировки, что приводило к повышенной лейкоцит-индуцированной гибели клеток. Однако авторы отметили, что возможно именно повышенные уровни IL-6 частично защищали ММСК от гибели, и регуляция уровня IL-6 может быть рассмотрена в качестве новой мишени для поддержания иммунопривилегированных свойств ММСК [49].
Помимо этого известно, что IL-6 участвует в поддержании стволовости ММСК [50]
Интерлейкин-8
После физической нагрузки T . Akerstrom с соавт . (2005), показали увеличение выработки IL-8 в скелетной мускулатуре [51], а L . Frydelund-Larsen с соавт . (2007) — увеличение рецепторов к этому интерлейкину [52]. Причем экспрессия интерлейкина запускалась и достигала максимума через несколько часов после физической нагрузки Авторы полагают, что основная роль данного цитокина — индукция неоваскулогенеза в условиях ишемии, вызванной физической нагрузкой В проведенном нами исследовании отмечена низкая секреция IL-8 дифференцированными миобластами по сравнению с другими клетками (рис 3) Данный феномен, по-видимому, можно объяснить отсутствием необходимых стимулов, запускающих его экспрессию
Интерлейкин-12
IL-12 — характеризуется гетеродимерной структурой, состоящей из двух субъединиц: тяжелой 40 кДа (р40) и легкой 35 кДа (р35), связанных между собой дисульфидными мостиками . В процессе синтеза белка образуются гомодимер р40 и гетеродимер
70кДа (p70). Только последний обладает биологической активностью [53]. В свою очередь, субъединица p40 может связываться с рецептором IL-12 и таким образом действовать как антагонист [54]. Субъединица р40 секретируется в большом избытке, по сравнению с p70
Нами выявлено, что секреция дифференцированными миобластами субъединицы р40 практически в 100 раз превышала секрецию р70 (рис . 1, 2) . Данные различия уменьшались в ряду ММСК подвижной десны — ММСК прикрепленной десны — фибробласты кожи .
Romanazzo et al . показали, что гиперэкспрессия субъединицы ^-12р35 выступает в качестве фактора, усиливающего миогенную дифференцировку [55]
Интерлейкин-15
IL-15 широко представлен в мышечной ткани [27]. L . S . Quinn с соавт . (2002) установили, что его воздействие приводит к увеличению содержания тяжелых цепей миозина и альфа-актина в дифференцированных миотубах . Причем, в отличие от инсулиноподобного фактора роста, IL-15 не меняет пролиферативную активность клеток и их способность к дифференцировке [56].
В более поздних работах, анализируя свой опыт E . E . Pistilli и L . S . Quinn (2013) пришли к выводу, что функция IL-15 более широкая и заключается в регулировке и определении оксидативного фенотипа мышечной ткани [57] Созвучно с этим выводом W . Li с соавт . выявили, что IL-15 способствует защите миобластов от повреждения активными формами кислорода [58].
Наши данные подтверждают повышение концентрации IL-15 при дифференцировке в миогенном направлении (рис 1)
Интерлейкин-18
Синтез IL-18 вместе с TNFa характерен для мышечных волокон 2 типа [59]. По современным представлениям считается, что он имеет отношение к регуляции деятельности здоровой мышечной ткани B . Chandrasekar с соавт . (2005) показали, что IL-18 совместно с IL-1 индуцирует гипертрофию в кардио-миоцитах [60]. Мы также наблюдаем наибольший синтез IL-18 миобластами в сравнении с другими группами клеток (рис 3), который, по-видимому, активно вырабатывается дифференцированными миобластами для аутокринного поддержания неуточ-ненных на сегодня функций
Интерферон гамма
Повышение уровня IFNy в культуральной среде дифференцированных миобластов, отмеченное нами, играет роль в аутокринной стимуляции пролиферации и слияния миобластов (рис . 1) [61]. Показано, что добавление блокирующих антител к рецептору IFNy приводит к снижению пролиферации клеток в месте повреждения (макрофагов, T-лимфоцитов, NK-киллеров, а так же миобластов) in vivo, а также снижению количества восстановленных волокон, и усилению степени фиброза. Такая же картина наблюдается и у нокаутных по гену IFNy мышей [62].
Факторы некроза опухоли альфа и бета
Высокая концентрация TNF-a может объясняться тем, что он вырабатывается мышечными клетками, в частности миобластами, и является фактором ауто-кринной регуляции [63]. Причем его синтез начинается на ранних стадиях миогенеза и постоянно растет по мере дифференцировки [30,64]. Хотя нами при попарном сравнении не установлено достоверных отличий уровней TNF-a в группах миобласты — подвижная десна, подвижная десна — прикрепленная десна, указанный выше феномен повышения секреторной активности коррелирует с нашими данными в ряду фибробласты кожи — ММСК десны — дифференцированные миобласты (рис . 1). Роль TNF-a и его важнейшего гомолога лимфотоксина-альфа (ранее называемого TNF-p) в регенерации была исследована Collins и Grounds в 2001г . , которые подтвердили экспрессию цитокинов в миобластах и миотубах как в первичных культурах, так и на срезах тканей . Позже Y . Torrente et al . (2003) установили, что TNF-a до-зозависимо увеличивает подвижность миобластов в зоне поражения . Авторы связывают данный эффект, как с прямой хемоаттрактивной активностью TNF-a на миобласты, так и за счет косвенного повышения активностей матриксных металллопротеаз [65].
Макрофагальный колониестимулирующий
фактор
S . Keeling с соавт . (2013) продемонстрировали, что использование культуральной среды от дифференцированных, липополисахарид-индуцированных макрофагов, приводит к увеличению длины мио-тубов и числа ядер в миотубах . С другой стороны в среде от недиффиренцированных макрофагов про-лиферативная активность миобластов была значительно выше [66]. N . A . Dumont и J . Frenette (2013) (на моделях in vitro и in vivo) установили, что макрофаги, стимулированные M-CSF, задействованы в восстановлении мышечных волокон после атрофии [67]. В нашем исследовании миогенная дифферен-цировка сопровождалась усилением синтеза M-cSF (рис 3)
Сосудистый эндотелиальный фактор роста
В скелетной мускулатуре в отсутствии ишемии ангиогенный фактор VEGF и рецепторы к нему преимущественно экспрессируются покоящимися са-теллитными клетками [68, 69]. В свою очередь в условиях гипоксии, его выработка многократно возрастает за счет других клеток мышечной ткани . Причем известно, что VEGF in vivo значительно (дозозависимо) усиливает регенерацию мышечной ткани [70, 71]. Данный механизм был детально изучен in vitro: VEGF в 3,5 раза увеличивает выживаемость миобластов за счет снижения индуцированного ишемией апоптоза [72] Дополнительно к этому VEGF, воздействуя на дифференцирующиеся миобласты, повышает эффективность диф-ференцировки, усиливает миграцию миобластов и гипертрофию миотубов [72, 73] Полученные нами данные свидетельствуют, что VEGF вырабатывается в культуре дифференцированных миобластов, хотя и в меньшем количестве по сравнению с другими типами клеток (рис 3) Данный факт может быть обусловлен, с одной стороны, отсутствием ишемии
(клетки инкубировали в стандартных условиях) С другой стороны, популяция миобластов на момент исследования секреторного профиля находилась в стабильном состоянии, и вырабатываемый низкий уровень VEGF, по всей видимости, — «фоновый», достаточный для ее аутокринного поддержания Отчасти тем же могут быть обусловлены сходные паттерны изменения уровней IL-8 в исследованных группах клеток
Фактор, ингибирующий миграцию
макрофагов
Benigni et al . открыли неортодоксальный эффект MIF, заключающийся в аутокринной стимуляции гликолиза в мышцах [74]. J . Reimann с соавт . (2010) на основе изучения нормальной скелетной мускулатуры и при воспалительной миопатии сделали вывод, что MIF, помимо участия в воспалении, выполняет пока не установленную функцию в ответе мышечных волокон на повреждение [75] Мы не можем связать повышенный уровень MIF в группе дифференцированных миобластов с каким-либо повреждением (рис . 2) . Возможно данный факт (как и повышенный уровень IL-15) отражает более активный энергообмен в данной клеточной популяции
TNF-связанный апоптоз-индуцирующий
лиганд
TRAIL относится к суперсемейству фактора некроза опухоли и играет важную роль в развитии и поддержании гомеостаза множества тканей, в том числе и мышечной . J . O'Flaherty с соавт . (2006) установили важную роль TRAIL в регуляции миогенеза, заключающуюся в запуске апоптоза части миобластов после пролиферации перед дифференцировкой [76]. Более того, цитокин регулирует апоптоз как в миосателлит-ных клетках [77], так и в мышечных волокнах [78], поддерживая нормальное состояние ткани Повышенные уровни TRAIL в культурах миобластов и ММСК подвижной части десны, выявленные в нашем эксперименте, могут отражать стабилизацию в них процессов апоптоза и пролиферации (рис 3)
Лейкемия ингибирующий фактор
Установлено, что данный цитокин играет важную роль в работе скелетной мускулатуры, отвечая за гипертрофию после физической нагрузки, а также за регенерацию [79]. Как показали Kurek et al . у но-каутных по LIF мышей объем регенерирующей ткани значительно снижен по сравнению с контролем Кроме того, экзогенное введение LIF стимулировало регенерацию в большей степени у мутантных животных по сравнению с нормальными [80]. И хотя ранее считалось, что основной механизм действия цитокина связан с индукцией митотической активности миобластов (чем объяснялось увеличение их числа [81], L . C . Hunt с соавт . (2010) установили связь механизма действия LIF со снижением протео-литической активности каспазы 3 . Таким образом, LIF прежде всего выступает в качестве антиапо-птотического агента в отношении миобластов [82]. В нашем эксперименте повышение концентрации LIF было сопоставимо с уровнями TRAIL (рис . 3) . Возможно данное наблюдение отражает сбалансированный синергичный эффект двух цитокинов
Фактор роста гепатоцитов
HGF секретируется клетками мезенхимального происхождения и участвует в гомеостазе множества тканей [83]. Помимо этого HGF активно задействован в аутокринной регулировке пролиферации и дифференцировки ММСК [83, 84]. K .J . Miller с соавт (2000) установили, что в мышечной ткани дополнительно к способности активировать покоящиеся сателлитные клетки HGF блокирует их дифференцировку, увеличивая число миобластов в течение 3 суток после травмы in vivo, а также in vitro . Его длительное воздействие или высокие концентрации отдаляли сроки наступления регенерации, однако эффект исчезал после отмены [85]. Также показано, что миобласты экспрессируют не только HGF, но и рецепторы к нему, тем самым образуя аутокринную петлю для поддержания своей пролиферации [86]. Установлено, что HGF в избытке представлен в межклеточном матриксе скелетной мускулатуры и высвобождается, активируя при этом сателлитные клетки, например, при травме или растяжении [87]. Примечательно, что HGF в нашем исследовании является одним из нескольких цитоки-нов, продемонстрировавших многократный рост в культурах ММСК подвижной и прикрепленной десны по сравнению с фибробластами кожи (в 20 и 10 раз, соответственно), что согласуется с литературными данными (рис 2) В то же время дальнейшее увеличение концентрации HGF в группе миобластов, по видимому, связано с его активной секрецией и накоплением во внеклеточном пространстве
Хемокины: моноцитарный хемоаттрактантный белок 1, моноцитарный хемоаттрактантный белок-3, рост-регулируемый белок альфа, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
Воспалительный процесс является важной частью регенерации мышц . После нагрузки или травмы в зависимости от интенсивности воздействия мышечная ткань вырабатывает не только спектр провоспали-тельных цитокинов, но также хемокинов и факторов роста С одной стороны, как уже упоминалось, они оказывают аутокринное действие, а с другой — обеспечивают взаимодействие с клетками иммунной системы, которые в патологических условиях многократно амплифицируют цитокиновый сигнал и воспалительную реакцию [36, 88—90].
Среди хемокинов, вырабатываемых мышечными клетками, Henningsen et al . отметили усиление секреции MCP-1 (CCL2), МСР-2 (CCL8) и MCP-3 (CCL7) при дифференцировке в миогенном направлении [89] Peterson et al показали, что уровень GM-cSF значимо увеличивается в ответ на растяжение миоту-бов (с силой до 70 кПа), тем самым усиливая хемотаксис нейтрофилов [28]. S . Miyatake с соавт . (2015) зарегистрировали рост концентрации GROa (CXCL1), продуцируемого миобластами под воздействием электрических стимулов [88] В целом, нами in vitro продемонстрировано, что выработка хемокинов уве-
личивается вместе с дифференцировкой миобла-стов, что подтверждается литературными данными (рис . 1-3) [88, 89, 91].
Другие цитокины
Для белков ^^а, ^-3, ^-16, С^27 (СТАСК), СХ^9 (МО, SСF, SСGF-b мы обнаружили статистически значимые различия при сравнении группы миобластов с остальными типами клеток (рис 4) В то же время в современной научной литературе отсутствует информация о связи указанных цитокинов с процессами миогенеза или регуляцией функций скелетной мускулатуры в норме и при патологии
Заключение
Результаты проведенного нами исследования показали, что популяции ММСК из прикрепленной и подвижной частей десны, а также дифференцированные миобласты заметно отличаются от фибро-бластов кожи по профилям секреторной активности . Причем, несмотря на общий источник, клетки подвижной десны в отличие от прикрепленной ее части более активно синтезируют ряд биологически активных молекул, играющих важную роль в миогенезе, поддержании гомеостаза и репарации мышечной ткани . Более того, синтез этих же цитокинов заметно увеличивается в популяции дифференцированных миобластов (за исключением VEGF, ^-12р70, ^-10). Данный факт, по нашему мнению, можно объяснить наличием в ММСК, выделенных из подвижной части десны, прогениторных клеток, вырабатывающих про-миогенные цитокины .
На основании полученных данных можно предположить, что основной вклад в повышение синтеза представленных белков вносят формирующиеся при индукции миогенной дифференцировки мио-тубы . Причем они же ответственны за экспрессию ряда цитокинов, концентрации которых значимо отличаются от профиля секреции ММСК десны Активно секретируемый популяциями ММСК подвижной части десны и дифференцированными ми-областами набор цитокинов, хемокинов и факторов роста близок к профилю биологических маркеров скелетной мускулатуры на различных этапах ее морфогенеза, что подтверждает их высокий мио-генный потенциал
Таким образом, культура ММСК подвижной части десны до и после индукции миогенной дифферен-цировки потенциально обладает положительным эффектом в отношении регенерации скелетной мускулатуры Полученные результаты дают основания рассматривать выявленную нами субпопуляцию ММСК подвижной части десны в качестве перспективного кандидата для клинического применения у пациентов с заболеваниями мышечной ткани
Благодарности
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00166).
ЛИТЕРАТУРА:
1. Schiaffino S ., Partridge T . Skeletal muscle repair and regeneration . dordrecht: Springer Netherlands; 2008 .
2 . Robertson T .A ., Maley M .A ., Grounds M . D . et al . The role of macrophages in skeletal muscle regeneration with particular reference to chemotaxis . Exp . Cell Res . 1993; 207(2): 321-31.
3 . Novak M . L ., Bryer S . C ., Cheng M . et al . Macrophage-specific expression of urokinase-type plasminogen activator promotes skeletal muscle regeneration . J . Immunol . 2011; 187(3): 1448-57 .
4 . Christopher-Stine L., Plotz P . H . Myositis: an update on pathogenesis . Curr . Opin . Rheumatol . 2004; 16(6): 700-6 .
5 . Spencer M . J . , Walsh C . M . , Dorshkind K . A . et al . Myonuclear apoptosis in dystrophic mdx muscle occurs by perforin-mediated cytotoxicity . J . Clin . Invest . 1997; 99(11): 2745-51.
6 . Pedersen B . K ., Febbraio M .A . Muscle as an endocrine organ: focus on muscle-derived interleukin-6 . Physiol . Rev. 2008; 88(4): 1379-406 .
7 . Зорин В .Л ., Зорина А . И ., Пулин А .А . и др . Перспективы использования клеток, обладающих миогенным потенциалом, в лечении заболеваний скелетных мышц: обзор исследований . Ч . 1. Сателлитные клетки . Патологическая физиология и экспериментальная терапия 2015; 59(2): 88-98 .
8 . Зорин В .Л ., Зорина А. И ., Пулин А .А . и др . Перспективы использования клеток, обладающих миогенным потенциалом, в лечении заболеваний скелетных мышц: обзор исследований Ч 2 Популяции стволовых клеток мышечного и немышечного происхождения Патологическая физиология и экспериментальная терапия 2015;59(3): 106-17 .
9 Зорин В Л , Еремин И И , Рыбко В А и др Слизистая оболочка полости рта — новый источник для получения миобластов . Гены Клетки 2014; 9(3): 76-84 .
10 . Mitrano T. I ., Grob M . S ., Carrion F . et al . Culture and characterization of mesenchymal stem cells from human gingival tissue . J . Periodontol . 2010; 81(6): 917-25 .
11 Зорин В Л , Зорина А И , Еремин И И и др Сравнительный анализ остеогенного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток слизистой оболочки полости рта и костного мозга . Гены Клетки 2014; 9(1): 50-7 .
12 Treves-Manusevitz S , Hoz L , Rachima H et al Stem cells of the lamina propria of human oral mucosa and gingiva develop into mineralized tissues in vivo . J . Clin . Periodontol . 2013; 40(1): 73-81.
13 . Tomar G . B . , Srivastava R . K ., Gupta N . et al . Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are superior to bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative medicine Biochem . Biophys . Res . Commun . 2010; 393(3): 377-83 .
14 Huang G T , Gronthos S , Shi S Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs those from other sources: their biology and role in regenerative medicine . J . Dent . Res . 2009; 88(9): 792-806
15 . Amable P . R ., Teixeira M .V. T., Carias R . B .V. et al . Protein synthesis and secretion in human mesenchymal cells derived from bone marrow, adipose tissue and Wharton's jelly . Stem Cell Res Ther . 2014; 5(2): 53 .
16 Podbregar M , Lainscak M , Prelovsek O et al Cytokine response of cultured skeletal muscle cells stimulated with proinflammatory factors depends on differentiation stage . Sci . World J . 2013; 2013: 1-8 .
17 Perrini S , Ficarella R , Picardi E et al Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans . PLoS One 2013; 8(3): e57892 .
18 . Naftali-Shani N ., Itzhaki-Alfia A ., Landa-Rouben N . et al . The origin of human mesenchymal stromal cells dictates their reparative properties . J . Am . Heart Assoc . 2013; 2(5): e000253 .
19 Hsieh J , Wang H , Chang S et al Mesenchymal stem cells from human umbilical cord express preferentially secreted factors related to neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis PLoS One 2013; 8(8): e72604
20 Rouger K , Larcher T , Dubreil L et al Systemic delivery of allogenic muscle stem cells induces long-term muscle repair and clinical efficacy in duchenne muscular dystrophy dogs . Am . J . Pathol . 2011; 179(5): 2501-18 .
21 Shi D , Reinecke H , Murry C E et al Myogenic fusion of human bone marrow stromal cells, but not hematopoietic cells Blood 2004; 104(1): 290-4 .
22 . Maxson S . , Lopez E .A., Yoo D . et al . Concise review: role of mesenchymal stem cells in wound repair Stem Cells Transl Med 2012; 1(2): 142-9 .
23 . Gnecchi M . , Zhang Z., Ni A. et al . Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy . Circ . Res . 2008; 103(11): 1204-19 .
24 Kinnaird T , Stabile E , Burnett M S et al Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms . Circulation 2004; 109(12): 1543-9 .
25 . Giannoudis P ., Jones E ., Yang X . et al . Mesenchymal stem cells and skeletal regeneration . 1st ed . Academic Press; 2013 .
26 . Yorio T ., Clark A. , Wax M . B . Ocular therapeutics: eye on new discoveries . 1st ed . Academic Pres; 2008 .
27 . Peake J . M ., Delia Gatta P ., Suzuki K . et al . Cytokine expression and secretion by skeletal muscle cells: regulatory mechanisms and exercise effects . Exerc . Immunol . Rev . 2015; 21: 8-25 .
28 . Peterson J . M ., Pizza F.X . Cytokines derived from cultured skeletal muscle cells after mechanical strain promote neutrophil chemotaxis in vitro . J . Appl . Physiol . 2008; 106(1): 130-7 .
29 . Griffin C .A ., Apponi L . H ., Long K . K . et al . Chemokine expression and control of muscle cell migration during myogenesis J Cell Sci 2010; 123(Pt 18): 3052-60 .
30 . Li Y . P ., Schwartz R . J . TNF-alpha regulates early differentiation of C2C12 myoblasts in an autocrine fashion . FASEB J . 2001; 15(8): 1413-5 .
31. Yahiaoui L ., Gvozdic D ., Danialou G . et al . CC family chemokines directly regulate myoblast responses to skeletal muscle injury . J . Physiol . 2008; 586(16): 3991-4004 .
32 . Luo G ., Hershko D . D ., Robb B .W . et al . IL-1beta stimulates IL-6 production in cultured skeletal muscle cells through activation of MAP kinase signaling pathway and NF-kappa B Am J Physiol Regul Integr . Comp . Physiol . 2003; 284(5): R1249-54 .
33 Al-Shanti N , Saini A , Faulkner S H et al Beneficial synergistic interactions of TNF-alpha and IL-6 in C2 skeletal myoblasts--potential cross-talk with IGF system . Growth Factors 2008; 26(2): 61-73 .
34 . Alvarez B ., Quinn L . S ., Busquets S . et al . Tumor necrosis factor-a exerts interleukin-6-dependent and -independent effects on cultured skeletal muscle cells . Biochim . Biophys . Acta — Mol . Cell Res . 2002; 1542(1-3): 66-72 .
35 Frost R A , Nystrom G J , Lang C H Lipopolysaccharide and proinflammatory cytokines stimulate interleukin-6 expression in C2C12 myoblasts: role of the Jun NH2-terminal kinase . Am . J . Physiol . Regul . Integr . Comp . Physiol . 2003; 285(5): R1153-64 .
36 De Rossi M Cytokines and chemokines are both expressed by human myoblasts: possible relevance for the immune pathogenesis of muscle inflammation . Int . Immunol . 2000; 12(9): 1329-35 .
37 . Mishra D . K ., Fridén J ., Schmitz M . C . et al . Anti-inflammatory medication after muscle injury A treatment resulting in short-term improvement but subsequent loss of muscle function J Bone Joint Surg . Am . 1995; 77(10): 1510-9 .
38 . Baoge L ., Van Den Steen E ., Rimbaut S . et al . Treatment of skeletal muscle injury: a review . ISRN Orthop . 2012; 2012: 689012 .
39 Rahusen F T G , Weinhold P S , Almekinders L C Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and acetaminophen in the treatment of an acute muscle injury . Am . J . Sports Med . 2004; 32(8): 1856-9 .
40 Authier F J , Chazaud B , Plonquet A et al Differential expression of the IL-1 system components during in vitro myogenesis: Implication of IL-1 ß in induction of myogenic cell apoptosis . Cell Death Differ . 1999; 6(10): 1012-21.
41. Grabiec K ., Tokarska J ., Milewska M . et al . Interleukin-1beta stimulates early myogenesis of mouse C2C12 myoblasts: the impact on myogenic regulatory factors, extracellular matrix components, IGF binding proteins and protein kinases . Pol . J . Vet . Sci . 2013; 16(2): 255-64.
42 Broussard S R , McCusker R H , Novakofski J E et al IL-1beta impairs insulin-like growth factor i-induced differentiation and downstream activation signals of the insulin-like growth factor i receptor in myoblasts . J Immunol . 2004; 172(12): 7713-20 .
43 Fu X , Xiao J , Wei Y et al Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion Cell Res 2015; 25(6): 655-73
44 Li W , Moylan J S , Chambers M A et al Interleukin-1 stimulates catabolism in C2C12 myotubes . Am . J . Physiol . Cell Physiol . 2009; 297(3): C706-14 .
45 . Bartoccioni E . , Michaelis D ., Hohlfeld R . Constitutive and cytokine-induced production of interleukin-6 by human myoblasts Immunol . Lett. 1994; 42(3): 135-8 .
46 . Hoene M ., Runge H ., Häring H . U . et al . Interleukin-6 promotes myogenic differentiation of mouse skeletal muscle cells: role of the STAT3 pathway . Am . J . Physiol . Cell Physiol . 2013; 304(2): C128-36 .
47 Serrano A L , Baeza-Raja B , Perdiguero E et al Interleukin-6 is an essential regulator of satellite cell-mediated skeletal muscle hypertrophy . Cell Metab . 2008; 7(1): 33-44 .
48 Pelosi M , De Rossi M , Barberi L et al IL-6 impairs myogenic differentiation by downmodulation of p90RSK/eEF2 and mT0R/p70S6K axes, without affecting AKT activity Biomed Res Int 2014; 2014: 206026
49 Li P , Li S -H , Wu J et al Interleukin-6 downregulation with mesenchymal stem cell differentiation results in loss of immunoprivilege J . Cell Mol . Med . 2013; 17(9): 1136-45 .
50 . Pricola K.L., Kuhn N .Z., Haleem-Smith H . et al . Interleukin-6 maintains bone marrow-derived mesenchymal stem cell stemness by an ERK1/2-dependent mechanism . J . Cell Biochem . 2009; 108(3): 577-88 .
51 Akerstrom T , Steensberg A , Keller P et al Exercise induces interleukin-8 expression in human skeletal muscle J Physiol 2005; 563(Pt 2): 507-16 .
52 . Frydelund-Larsen L . , Penkowa M ., Akerstrom T . et al . Exercise induces interleukin-8 receptor (CXCR2) expression in human skeletal muscle . Exp . Physiol . 2007; 92(1): 233-40 .
53 . Gillessen S . , Carvajal D ., Ling P . et al . Mouse interleukin-12 tIL-12) p40 homodimer: a potent IL-12 antagonist . Eur . J . Immunol . 1995; 25(1): 200-6 .
54 . D'Andrea A ., Rengaraju M ., Valiante N . M . et al . Production of natural killer cell stimulatory factor tinterleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells . J . Exp . Med . 1992; 176(5): 1387-98 .
55 . Romanazzo S ., Forte G ., Morishima K . et al . IL-12 involvement in myogenic differentiation of C2C12 in vitro . Biomater . Sci . 2015; 3(3): 469-79 .
56 . Quinn L . S ., Anderson B . G ., Drivdahl R . H . et al . Overexpression of interleukin-15 induces skeletal muscle hypertrophy in vitro: implications for treatment of muscle wasting disorders . Exp . Cell Res . 2002; 280(1): 55-63 .
57 . Pistilli E . E ., Quinn L . S . From anabolic to oxidative: reconsidering the roles of IL-15 and IL-15Ra in skeletal muscle . Exerc . Sport . Sci . Rev . 2013; 41(2): 100-6 .
58 . Li F ., Li Y ., Tang Y . et al . Protective effect of myokine IL-15 against H2O2-mediated oxidative stress in skeletal muscle cells . Mol . Biol . Rep . 2014; 41(11): 7715-22 .
59 . Plomgaard P ., Penkowa M ., Pedersen B . K . Fiber type specific expression of TNF-alpha, IL-6 and IL-18 in human skeletal muscles . Exerc . Immunol . Rev . 2005; 11: 53-63 .
60 . Chandrasekar B . , Mummidi S ., Claycomb W . C ., et al . Interleukin-18 is a pro-hypertrophic cytokine that acts through a phosphatidylinositol 3-kinase-phosphoinositide-dependent kinase-1-Akt-GATA4 signaling pathway in cardiomyocytes . J . Biol . Chem . 2005; 280(6): 4553-67
61. Kalovidouris A. E ., Plotkin Z ., Graesser D . Interferon-gamma inhibits proliferation, differentiation, and creatine kinase activity of cultured human muscle cells . II . A possible role in myositis . J . Rheumatol . 1993; 20(10): 1718-23 .
62 . Cheng M ., Nguyen M ., Fantuzzi G . et al . Endogenous interferon-gamma is required for efficient skeletal muscle regeneration . Am . J . Physiol . Cell Physiol . 2008; 294(5): C1183-91.
63 . Saghizadeh M ., Ong J . M ., Garvey W . T . et al . The expression of TNF alpha by human muscle . Relationship to insulin resistance . J . Clin . Invest . 1996; 97(4): 1111-6 .
64 . Chen S . , Jin B . , Li Y . TNF-alpha regulates myogenesis and muscle regeneration by activating p38 MAPK . Am . J . Physiol . Cell Physiol . 2007; 292(5): C1660-71.
65 . Torrente Y. , El Fahime E ., Caron N . J . et al . Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) stimulates chemotactic response in mouse myogenic cells . Cell Transplant . 2003; 12(1): 91-100 .
66 . Keeling S ., Deashinta N ., Howard K. M . et al . Macrophage colony stimulating factor-induced macrophage differentiation influences myotube elongation . Biol . Res . Nurs . 2013; 15(1): 62-70 .
67 . Dumont N .A. , Frenette J . Macrophage colony-stimulating factor-induced macrophage differentiation promotes regrowth in atrophied skeletal muscles and C2C12 myotubes . Am . J . Pathol . 2013; 182(2): 505-15 .
68 . Rissanen T.T., Vajanto I . , Hiltunen M . O . et al . Expression of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2 (KDR/Flk-1) in ischemic skeletal muscle and its regeneration . Am . J . Pathol . 2002; 160(4): 1393-403 .
69 . Couffinhal T ., Silver M ., Zheng L . P . et al . Mouse model of angiogenesis . Am . J . Pathol . 1998; 152(6): 1667-79 .
70 . Arsic N ., Zacchigna S ., Zentilin L . et al . Vascular endothelial growth factor stimulates skeletal muscle regeneration in Vivo . Mol . Ther . 2004; 10(5): 844-54 .
71. Швальб П . Г ., Гавриленко А. В ., Калинин Р . Е . и др . Эффективность и безопасность применения препарата «Неоваскулген» в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (IIb-III фаза клинических испытаний) . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; 6(3): 83 .
72 . Germani A. , Di Carlo A ., Mangoni A . et al . Vascular endothelial growth factor modulates skeletal myoblast function . Am . J . Pathol . 2003; 163(4): 1417-28 .
73 . Bryan B .A., Walshe T . E ., Mitchell D . C . et al . Coordinated vascular endothelial growth factor expression and signaling during skeletal myogenic differentiation . Mol . Biol . Cell . 2008; 19(3): 9941006 .
74 . Benigni F ., Atsumi T ., Calandra T . et al . The proinflammatory mediator macrophage migration inhibitory factor induces glucose catabolism in muscle . J . Clin . Invest . 2000; 106(10): 1291-300 .
75 . Reimann J ., Schnell S ., Schwartz S . et al . Macrophage migration inhibitory factor in normal human skeletal muscle and inflammatory myopathies . J Neuropathol . Exp . Neurol . 2010; 69(6): 654-62
76 . O'Flaherty J ., Mei Y ., Freer M . et al . Signaling through the TRAIL receptor DR5/FADD pathway plays a role in the apoptosis associated with skeletal myoblast differentiation . Apoptosis 2006; 11(12): 2103-13 .
77 . Mampuru L . J . , Chen S . J ., Kalenik J . L . et al . Analysis of events associated with serum deprivation-induced apoptosis in C3H/Sol8 muscle satellite cells . Exp . Cell Res . 1996; 226(2): 372-80 .
78 . Sandri M ., Carraro U . Apoptosis of skeletal muscles during development and disease . Int . J . Biochem . Cell Biol . 1999; 31(12): 1373-90 .
79 . Broholm C ., Laye M . J ., Brandt C . et al . LIF is a contraction-induced myokine stimulating human myocyte proliferation . J . Appl . Physiol . 2011; 111(1): 251-9 .
80 . Kurek J . B ., Bower J .J ., Romanella M . et al . The role of leukemia inhibitory factor in skeletal muscle regeneration . Muscle Nerve 1997; 20(7): 815-22 .
81. White J . D . , Davies M . , Grounds M . D . Leukaemia inhibitory factor increases myoblast replication and survival and affects extracellular matrix production: combined in vivo and in vitro studies in post-natal skeletal muscle . Cell Tissue Res . 2001; 306(1): 129-41.
82 . Hunt L . C ., Tudor E . M ., White J . D . Leukemia inhibitory factor-dependent increase in myoblast cell number is associated with phosphotidylinositol 3-kinase-mediated inhibition of apoptosis and not mitosis . Exp . Cell Res . 2010; 316(6): 1002-9 .
83 . Forte G . , Minieri M ., Cossa P . et al . Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells: proliferation, migration, and differentiation . Stem Cells 2006; 24(1): 23-33 .
84 . Neuss S ., Becher E ., Wöltje M . et al . Functional expression of HGF and HGF receptor/c-met in adult human mesenchymal stem cells suggests a role in cell mobilization, tissue repair, and wound healing . Stem Cells 2004; 22(3): 405-14 .
85 . Miller K . J . , Thaloor D . , Matteson S . et al . Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle . Am . J . Physiol . Cell Physiol . 2000; 278(1): C174-81.
86 . Anastasi S ., Giordano S ., Sthandier O . et al . A natural hepatocyte growth factor/scatter factor autocrine loop in myoblast cells and the effect of the constitutive Met kinase activation on myogenic differentiation . J . Cell Biol . 1997; 137(5): 1057-68 .
87 . Tatsumi R ., Allen R . E . Active hepatocyte growth factor is present in skeletal muscle extracellular matrix . Muscle Nerve 2004; 30(5): 654-8 .
88 . Miyatake S ., Bilan P . J ., Pillon N . J . et al . Contracting C2C12 myotubes release CCL2 in an NF-KB-dependent manner to induce monocyte chemoattraction . Am . J . Physiol . Endocrinol . Metab . 2015 Nov 10 . [Epub ahead of print].
89 . Henningsen J . , Pedersen B . K . , Kratchmarova I . Quantitative analysis of the secretion of the MCP family of chemokines by muscle cells . Mol . Biosyst . 2011; 7(2): 311-21.
90 . Shireman P . K . , Contreras-Shannon V . , Ochoa O . et al . MCP-1 deficiency causes altered inflammation with impaired skeletal muscle regeneration . J . Leukoc . Biol . 2007; 81(3): 775-85 .
91. Iwasaki S ., Miyake M ., Hayashi S . et al . Effect of myostatin on chemokine expression in regenerating skeletal muscle cells . Cells Tissues Organs . 2013; 198(1): 66-74 .
Поступила: 20.08.2015
