CC BY
74
УДК 544.7
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ КРЕМНЕЗЕМА
© А. Х. Туктамышева1*, Р. Р. Гарафутдинов2, Р. Ф. Талипов1
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 67 78.
2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.
E-mail: tuktamyshevaa@mail.ru
Представлены результаты анализа различных вариантов химической модификации поверхности кремнезема, являющегося структурным аналогом стекла — материала, наиболее применимого при изготовлении биосенсоров. Исследованы плотность прививки функциональных групп и прочность пришивки репортеров. Обнаружено, что наибольшая степень иммобилизации соответствует силипорам группы AS, в то время как образцы групп GS и CS показали меньшую эффективность изученных схем модификации. Выявлено, что с увеличением количества проведенных химических реакций на поверхности степень последующей загрузки уменьшается. Генерация длинных гидрофобных линкерных фрагментов положительно сказывается на прочности закрепления иммобилизуемых молекул. Предложена наиболее приемлемая при изготовлении биосенсоров схема химической подготовки стеклянных подложек.
Ключевые слова: кремнезем, модификация верхностная концентрация, плотность прививки
Введение
Для широкого внедрения биосенсоров в практику медицинских и научных учреждений необходимо, чтобы они позволяли получать однозначные достоверные результаты. Эффективность биосенсоров как аналитических устройств определяется во многом свойствами поверхности подложки и материала, из которых они изготовлены. К таким свойствам относятся химическая однородность и шероховатость поверхности, плотность поверхностных функциональных групп и расстояние между ними. В связи с этим химическая модификация поверхности как необходимый этап при создании биосенсоров является ключевой стадией большинства биочиповых технологий.
В качестве подложек могут выступать различные материалы: кремний, стекло, золото, полимеры. Наиболее часто используется стекло в силу ряда его характерных свойств: нерастворимость в органических и неорганических растворителях, относительная химическая инертность, низкая фоновая флуоресценция, отсутствие неспецифических взаимодействий, прочность, доступность и простота в обращении. Перед иммобилизацией биомоле -кул стекло подвергают очистке, в результате которой поверхность становится более гладкой, с нее удаляются возможные органические загрязнения, ионы тяжелых металлов и освобождаются гидроксильные группы. Затем проводят функционализа-цию стекла действием алкоксисиланов. Возможна дальнейшая функционализация, осуществляемая путем взаимодействия поверхностных групп с различными соединениями [1].
Наиболее используемыми для иммобилизации биомолекул подложками являются стекла с приви-
поверхности, репортерныи краситель, по-
тыми аминогруппами. Шляпниковой и др. был предложен комплекс методов для анализа качества аминированных подложек [2]. Данными авторами было найдено, что для гибридизационного анализа наилучшими свойствами обладают стекла с плотностью аминогрупп 0.5-2.0 групп/нм2. Характеристики поверхности после обработки четырьмя ами-носиланами были исследованы методами атомносиловой микроскопии [3]. В литературе имеются также работы, посвященные созданию подложек с конусообразными дендримерными структурами на поверхности. Подобные дендримеры создают матрицу равноудаленных друг от друга аминогрупп [4, 5]. Другими авторами предложены дендример-ные структуры с карбоксильными группами, которые формируют монослой с гексагональной плотной упаковкой молекул, сохраняющий устойчивость при нагревании до 100 °С в течение 1-2 ч в воде и изменении pH от 4 до 7 [6].
Основными методами исследования физикохимических характеристик привитых слоев являются УВИ-спектроскопия в широкой области и эл-липсометрия. Обработкой стекла четырьмя разными аминосиланами были получены аминированные поверхности с переменной толщиной аминослоя, анализ которых проводился путем образования имина с последующей спектрофотометрией образцов [7, 8]. Поскольку количество молекул альдегида эквивалентно числу иминогрупп на поверхности, по абсолютной плотности имина данными авторами было найдено количество поверхностных аминогрупп.
Несмотря на продолжающиеся исследования, проблема качества подложек для биочипов, обусловленная несовершенством технологий их изго-
* автор, ответственный за переписку
товления, остается актуальной задачей. Необходимы новые стратегии и/или методы модифицирования поверхности, которые помогут увеличить чувствительность и достоверность результатов, получаемых с помощью биосенсоров. Целью данной работы стал анализ различных вариантов химической модификации поверхности кремнезема на основе изучения таких ее характеристик как прочность пришивки иммобилизованных репортеров, поверхностная концентрация и плотность прививки функциональных групп.
Экспериментальная часть
В работе использовались следующие материалы и реактивы: силипор (STO. 30 м2/г), 3-амино-пропилтриэтоксисилан (APTES), 3-глицидокси-пропилтри-этоксисилан (GOPTES), 3-хлорпропил-триметоксисилан (CPTMS), янтарный ангидрид, дихлорангидриды терефталевой и глутаровой кислот, терефталевая, глутаровая, 4-оксиметилбен-зойная, 6-аминокапроновая, п-аминобензойная
кислоты, N-гидроксисукцинимид (NHS), дицикло-гексилкарбодиимид (ДЦК), этилендиамин (ЭДА), тетрагидрофуран (10 ppm H2O) производства фирм Aldrich, Fluka, ABCR, а также другие вспомогательные вещества и растворители отечественного производства.
Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Bio-Spec Mini, ВЭЖХ осуществляли на приборе LC-20AD (оба Shimadzu, Япония), перемешивание проводилось с помощью стационарных магнитных мешалок и ротационной мешалки для пробирок RM-1 (Elmi, Латвия).
Химическая модификация поверхности кремнезема проводилась поэтапно. Силипор обрабатывали «пираньей» (концентрированные H2O2 и H2SO4 в соотношении 1:1) из расчета 10 мл на 3 г силипо-ра в течение 1 ч, затем промывали дистиллированной водой до исчезновения кислой реакции промывных вод и сушили при 120 °С до постоянной массы.
Для создания на поверхности слоя привитых функциональных групп силипор обрабатывали соответствующими силанами:
1) для получения аминомодифицированного силипора (AS) - 5%-ным раствором APTES в ацетоне (из расчета 0.2 мл на 3 г силипора) при комнатной температуре и интенсивном перемешивании в течение 3 ч на магнитной мешалке, далее промывали последовательно ацетоном (2x10 мл) и водой (2x10 мл), сушили при 120 °С до постоянной массы.
2) для получения глицидоксимодифицирован-ного силипора (GS) - 5%-ным раствором GOPTES в бензоле (из расчета 0.3 мл на 3 г силипора) в присутствии NEt3 (1:24 v:v) в течение 5 ч при кипячении, далее промывали последовательно бензолом (2x10 мл) и хлороформом (2x10 мл), сушили при 130°С до постоянной массы.
3) для получения хлормодифицированного си-липора (CS) - 5%-ным CPTMS в толуоле (из расче-
та 0.15 мл на 3 г) при комнатной температуре и интенсивном перемешивании в течение 3 ч, промывали толуолом, хлороформом, этанолом и водой (по 10 мл), сушили при 130 °С до постоянной массы.
Дальнейшую модификацию вели следующим образом:
1) А8 модифицировали янтарным ангидридом (бензол, кипячение, 5 ч), дихлорангидридами те-рефталевой и глутаровой кислот (хлороформ, пиридин, комнатная температура, 4 ч), терефталевой и глутаровой кислотами (двукратный избыток ДЦК, абсолютный ТГФ, 4 ч) из расчета 0.27 ммоль реагента на 0.6 г А8.
2) модификацию 08 осуществляли с помощью 4-оксиметилбензойной, п-аминобензойной и 6-ами-нокапроновой кислот из расчета 0.2 ммоль на 0.6 г 08 при комнатной температуре в ТГФ в течение 3 ч при перемешивании.
3) для модификации С8 использовали п-аминобензойную кислоту и ЭДА из расчета 0.17 ммоль на 0.5 г С8. Реакции проводили при комнатной температуре в ТГФ в течение 3 ч при перемешивании в присутствии К2С03.
Азокрасители А (4-амино-4’-карбоксиазобен-зол) и В (4-М,К-диметил-амино-4’-карбоксиазо-бензол) получали по реакции азосочетания. К 2.9 г п-аминобензойной кислоты приливали 20 мл 10% НС1, охлаждали во льду до 0-5 °С и приливали при перемешивании охлажденный до 0-5 °С раствор 1.5 г КаМ02, после чего смесь оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Избыток КаМ02 удаляли добавлением раствора 1.0 г суль-фаминовой кислоты в 4 мл воды. К 2.0 мл анилина (в случае синтеза А) или 2.6 мл К,К-диметилани-лина (в случае синтеза В) прибавляли по 13 мл 10% НС1. Растворы гидрохлоридов данных анилинов и диазониевой соли охлаждали во льду до 0-5°С, сливали при перемешивании и выдерживали на холоду 1 ч. Далее выпавшие осадки азокрасителей отфильтровывали и сушили на воздухе. Азокраситель А - порошок желтого цвета, Яг = 0.8 (ацетон:хлороформ = 3:1), В - порошок ярко-красного цвета, = 0.2 (хлороформ). Индивидуаль-
ность продуктов азосочетания подтверждена с помощью ТСХ и ВЭЖХ.
Для иммобилизации А образцы силипора с привитыми карбоксигруппами выдерживали в растворе 0.12 г №Н8 и 0.15 г ДЦК в 3 мл абсолютного ТГФ в течение 2 ч, промывали ТГФ (2x10 мл) и сушили при 120 °С. Прививку азокрасителя А осуществляли путем обработки силипора с актив иро-ванными карбоксигруппами смесью 7 мг А в 400 мкл ДМСО и 100 мкл 0.5 М карбонатного буфера (№2С03/КаНС03=1:1) в течение суток. Далее промывали этанолом (2x10 мл) и водой (2x10 мл) до тех пор, пока промывные воды переставали окрашиваться. Сушили при 120 °С.
Для иммобилизации В соответствующие образцы силипора обрабатывали 0.3 мл ЭДА в присутст-
вии двукратного избытка ДЦК в абсолютном ТГФ в течение 4 ч, промывали ТГФ (2x10 мл) и сушили при 120 °С. Присоединение В проводили в абсолютном ТГФ в присутствии 0.1 г ДЦК в течение 3 ч. Промывку осуществляли ТГФ (2x10 мл), этанолом (2x10 мл) и водой (2x10 мл) до полного обесцвечивания промывных вод. Сушили при 120 °С.
Гидролиз осуществляли, приливая к 20 мг каждого из образцов силипора независимо по 700 мкл 25%-ного водного раствора аммиака и 700 мкл воды. Кинетику гидролиза изучали путем спектрофотометрического анализа аликвот (по 20 мкл), отобранных через промежутки времени 5, 10, 20, 30, 50, 90 и 120 мин. Полный гидролиз проводили, растворяя по 10 мг этих же образцов в 180 мкл 10%-ного №ОН.
Результаты и обсуждение
Необходимость повышения качества биосен-сорных устройств выводит на первое место решение таких вопросов, как оптимизация условий реакции модификации и расстояния между иммобилизованными биомолекулами. Оба эти фактора связаны с характером поверхности и многие проблемы обусловлены главным образом изменениями в состоянии поверхности и привитого молекулярного слоя, поэтому исследование химической подготовки поверхности составляет значительную часть работ, посвященных биочипам.
Наиболее применимым материалом при изготовлении биочипов является стекло. Поскольку в ходе его обработки на поверхности формируются слои, сходные по структуре с кремнеземом, нами в качестве модельной системы был взят силипор с удельной площадью поверхности 30 м2/г и изучены варианты его химической модификации с целью оценки эффективности различных синтетических схем. Силипор подвергали стандартной процедуре очистки путем обработки «пираньей» с последующей функционализацией (схема 1). Для создания на поверхности слоя привитых аминогрупп осуществляли ее обработку раствором АРТЕ8, глицидоксиг-рупп - 00РТЕ8, хлорпропильных групп - СРТМ8.
Второй раунд модификации приводил к созданию на поверхности карбокси- или аминогрупп. Для функционализации А8 использовали янтарный ангидрид (образец А8-1), терефталоилдихлорид (А8-2), глутарилдихлорид (А8-3), терефталевую (А8-4) и глутаровую (А8-5) кислоты. Функциона-лизацию 08 проводили 4-оксиметилбензойной (08-1), п-аминобензойной (08-2), 6-аминокапроно-вой (08-3) кислотами и ЭДА (08-4), С8 - п-аминобензойной кислотой (С8-1) и ЭДА (С8-0-2). Эффективность указанных схем оценивали с помощью иммобилизованных репортерных красителей А и В (рис. 1).
Схема 1
Химическая модификация поверхности силипора.
ESi-OH Si
= Si
;o
H2SO4 (конц.) : H2O2 (конц.) 1:1 rt, 1 ч
APTES
ESi-OH
ESi-OH
ESi-OH
CPTMS
|-NH2
AS
A, pH=9.0 АААААА
B, ДЦК
ВВВВВВ
Прививку А осуществляли на поверхности, несущие карбоксигруппы после их активации N гидроксисукцинимидом. По этому пути получены образцы А8-1-А, А8-2-А, А8-Э-А, А8-4-А, А8-5-А, 08-1-А, 08-2-А, 08-Э-А. Присоединение В проводили после генерации на поверхности аминогрупп взаимодействием соответствующих функциональных групп с этилендиамином, в результате чего получены образцы А8-1-2-В, А8-2-2-В, А8-Э-2-В, А8-4-2-В, А8-5-2-В, 08-4-2-В, С8-0-2-В, С8-1-2-В. Красителями были обработаны также исходные А8, 08 и С8 (образцы А8-0-В, 08-0-А и С8-0-А). Все образцы имели окраску от бледно-бежевой до яркооранжевой.
азокраситель А
N
азокраситель В Рис. 1. Структуры репортерных красителей.
Поскольку количество иммобилизованного репортера характеризует количество активных функциональных групп на поверхности [7, 8], нами было
проведено полное растворение образцов силипоров в 10%-ном №ОН. Значения оптических плотностей полученных растворов, найденные при длине волны 460 нм, соответствущей полосе поглощения азокрасителей А и В, при пересчете на единицу поверхности позволили найти плотность прививки р (табл.).
Оказалось, что наибольшее количество иммобилизованного красителя соответствует силипорам А8, А8-1-2-В и А8-3-2-В, несущим первичные аминогруппы. Образцы групп 08 и С8 показали меньшую степень прививки, что свидетельствует о меньшей эффективности данных синтетических схем.
Характеристика образцов модифицированного кремнезема
Таблица
№№ Образцы Структура линкерного фрагмента р, групп/нм2 ДА, отн. ед.
1. А8-0-В
2. А8-1-А
Э. А8-1-2-В
4. А8-2-А
5. А8-2-2-В
6. А8-Э-А
7. А8-Э-2-В
8. А8-4-А
9. А8-4-2-В
10. А8-5-А
11. А8-5-2-В
12. 08-0-А
1Э. 08-1-А
14. 08-2-А
15. 08-Э-А
16. 08-4-2-В
17. С8-0-А
18. С8-0-2-В
19. С8-1-2-В
I--КИСО—В
I--КИСО(СИ2)2СОКИ—А
I—КИСО(СИ2)2СОКИ(СИ2)2КИСО — В
I--КИСО-р-СбЩ-СОКИ—А
I— КИСО-р- С6И4- СОКИ(СИ2)2КИСО — В
I--КИСО(СИ2)ЭСОКИ—А
I--КИС О (С И2)ЭС ОКИ(С И2)2КИС О — В
I—МЫСО-р-С6Ы4-СОМЫ—А
|--КИСО-р-С6И4-СОКИ(СИ2)2КИСО — В
I КИСО(СИ2)ЭСОКИ—А
I КИСО(СИ2)ЭСОКИ(СИ2)2КИСО — В
I ОСИ2—А
ОИ
I ОСИ2—О-р-СбИ4-СОКИ—А
ОИ
н
I—оси
ОСИ2—^ О-р-С^-ШСО —А ОИ
' NЫ(CЫ2)5CОNЫ— А
ОИ
I ОСИ2—КЩС^^ИСО — В
ОИ
| КИ—А
I КИ(СИ2)2КИСО — В
I--NH-p-C6H4-CОNH(CH2)2NHCО — В
2.015±0.002 0.405
0.138±0.004 0.080
0.757±0.001 0.4Э0
0.127±0.004 0.040
0.Э44±0.006 0.158
0.081±0.007 0.068
0.52Э±0.005 0.485
0.094±0.006 0.05Э
0.Э29±0.002 0.187
0.045±0,00Э 0.008
0.461±0.001 0.214
0.540±0.005 0.145
0.150±0.00Э 0.064
0.240±0.002 0.079
0.144±0.003 0.071
0.ЭЭ1±0.002 0.188
0.Э60±0.004 0.109
0.198±0.002 0.09Э
По данным [6], для гибридизационного анализа наиболее оптимальным является значение плотности функциональных групп от 0.5 до 2.0 групп/нм2. Из проанализированных образцов этому критерию удовлетворяют всего четыре образца. Однако в случае необходимости пространственного разрежения иммобилизованных молекул образцы с большим значением р могут оказаться непригодными для изготовления биосенсоров. Увеличение количества проведенных химических реакций на поверхности снижает степень загрузки, что связано с протеканием побочных реакций и закономерным уменьшением количества доступных для целевого взаимодействия групп. Для образца С8-0-А в ходе отмывки водой происходила полная потеря окраски, что свидетельствует об отсутствии образования ковалентных связей.
Важнейшим параметром качества биосенсоров является стойкость иммобилизованных молекул к отщеплению, которая зависит от природы связей, удерживающих их на поверхности подложки. В биочипах, как правило, макромолекулы закреплены посредством амидной связи, способной расщепляться в водных средах. Скорость такого отщепления зависит от молекулярного окружения и pH среды. Кроме того, может происходить частичное отщепление и модификатора стекла. Прочность прививки репортеров оценивали в модельной системе по разности скоростей их отщепления при гидролизе в водном растворе аммиака, который обладает способностью расщеплять амидную связь и в то же время практически не растворяет силипор, и в чистой воде. Спектрофотометрический анализ аликвот позволил построить кинетические кривые реакций гидролиза (рис. 2). Разность значений оптической плотности растворов гидролиза ДА была определена для конечной точки (120 мин) кривых аппроксимации.
Поскольку полученные образцы характеризуются различной степенью прививки репортеров, а ДА является абсолютной величиной, она не позволяет проводить прямое сравнение и оценку прочности иммобилизации красителей. В связи с этим были рассчитаны значения Др/р, являющиеся нормализованным показателем разности количества отщепившихся в ходе гидролиза репортерных молекул (рис. 3). Анализ полученных данных позволил выявить следующие закономерности:
1) для образцов, полученных иммобилизацией репортеров на немодифицированные поверхности (А8-0-В, 08-0-А и С8-0-2-В), т.е. не имеющих лин-керного фрагмента, наблюдается сравнимая эффективность отщепления красителей как в воде, так и в водном аммиаке, что свидетельствует о негативном (катализирующем гидролиз) влиянии ближнего молекулярного окружения - оставшихся силаноль-ных групп поверхности и аминогрупп.
2) алкильные цепи в качестве линкерного фрагмента придают большую стойкость к гидролизу по сравнению с арильными.
3) увеличение длины СН2-цепи линкерного фрагмента приводит к повышению стойкости к гидролизу, что объясняется, по-видимому, увеличением гидрофобности молекулярного окружения амидных связей.
4) образцы группы А8 в целом характеризуются наибольшим параметром Др/р, что обусловлено, вероятно, отсутствием побочных реакций при модификации (как, например, при раскрытии эпокси-цикла для 08), и отсутствием каталитического действия ближних групп атомов при гидролизе (как, например, гидроксигрупп в случае 08).
5) не наблюдается зависимости между количеством амидных связей и стойкости к гидролизу, несмотря на то, что теоретически увеличение их количества должно приводить к большей вероятности отщепления репортера.
Время, мин
Рис. 2. Скорость отщепления красителя для образца А8-3-2-В.
Таким образом, методом молекулярного наслаивания было получено 19 различных образцов химически модифицированного кремнезема, для которых оценена степень загрузки поверхности и гидролитическая стойкость иммобилизованных репортеров. Обнаружено, что в целом наибольшая степень иммобилизации соответствует силипорам группы А8, в то время как образцы групп 08 и С8 показали меньшую эффективность изученных схем модификации, что связано с возможностью протекания для последних нежелательных реакций. Выявлено, что с увеличением количества проведенных химических реакций на поверхности степень последующей загрузки уменьшается, однако при этом генерация длинных гидрофобных линкерных фрагментов положительно сказывается на прочности закрепления иммобилизуемых молекул. Полученные результаты позволяют считать наиболее приемлемой при изготовлении биосенсоров синтетическую схему, включающую первоначальное создание аминомодифицированной поверхности стекла с последующей генерацией на ней длинных гидрофобных линкеров алкильной природы.
Рис. 3. Сравнительная диаграмма значений Ap/p.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (контракт №16.518.11.7047).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гарафутдинов Р. Р., Шепелевич И. С., Чемерис А. В., Талипов Р. Ф. Химические аспекты создания ДНК-чипов // Вестник Башкирского университета. 2005. №1. С. 49-54.
2. Шляпникова Е. А., Шляпников Ю. М., Афанасьев В. Н., Афанасьева Г. В., Гаврюшкин А. В., Белецкий И. П. Исследование качества аминированных подложек, используемых для гибридизационного анализа // Биоорганиче-ская химия. 2007. Т. 33. №2. С. 261-268.
3. Oh S. J., Cho S. J., Kim Ch. O., Park J. W. Characteristics of DNA Microarrays Fabricated on Various Aminosilane Layers // Langmuir 2002. 18. 1764-1769.
4. Hong B. J., Oh S. J., Youn T. O., Kwon S. H., Park J. W. Nanoscale-Controlled Spacing Provides DNA Microarrays with the SNP Discrimination Efficiency in Solution Phase // Langmuir, 2005. 21. 4257-4261.
10.
Hong B. J., Sunkara V., Park J. W. DNA microarrays on nanoscale-controlled surface // Nucleic Acids Research. 2005. 12. 1-8.
Hong B. J., Shim J. Y., Oh S. J., Park J. W. Self-Assembly of a Dendron through Multiple Ionic Interaction to Give Mesos-pacing between Reactive Amine Groups on the Surface // Langmuir 2003. 19. 2357-2365.
Moon J. H., Shin J. W., Kim S. Y., Park J. W. Formation of Uniform Aminosilane Thin Layers: An Imine Formation To Measure Relative Surface Density of the Amine Group // Langmuir 1996. 12. 4621-4624.
Moon J. H., Kim J. H., Kim Ki-jeong, Kang T. H., Kim B., Kim Ch. H., Hahn J. H., Park J. W. Absolute Surface Density of the Amine Group of the Aminosilylated Thin Layers: Ultraviolet-Visible Spectroscopy, Second Harmonic Generation, and Synchrotron-Radiation Photoelectron Spectroscopy Study // Langmuir 1997. 13. 4305-4310.
Тертых В. А., Белякова Л. А. Химические реакции с участием поверхности кремнезема. Киев: Наукова думка, 1991. 264 с. Химия привитых поверхностных соединений / Под ред. Лисичкина Г. В. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2003. 592 с.
5
б
7
8.
9.
Поступила в редакцию 25.05.2012 г.
