CC BY
202
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2008, 149 2, с. 103-106
УДК 57:612.398:616-074
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРИМЕНЕНИЯ КРАСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ МЕТОДОМ КЛИНОВИДНОЙ ДЕГИДРАТАЦИИ
© 2008 г. Л.М. Обухова
Нижегородская государственная медицинская академия
Посрупила в иедакцию 06.03.2008
Показана возможность использования водорастворимых красителей для определения локализации белков в высохшей капле сыворотки крови. Установлено рабочее разведение используемых красителей, и определены наиболее специфичные из них, применение которых позволяет подразделять собственно протеины и пептиды. Выявлено, что наиболее информативным было использование амидочерного 10В и толуидинового синего. При окрашивании сыворотки крови вышеназванными красителями имело место максимальное количество концентрических зон окраски в высохшей капле.
Ключевок слова: белки, клиновидная дегидратация, красители.
Введение
Интерпретация результатов анализа биологических жидкостей, проведенного методом клиновидной дегидратации [1], возможна только при известном местоположении различных фракций белков в высохшей капле.
В гистологии известно применение красителей для определения локализации различных групп веществ [2]. При этом неорганические и органические вещества изучаемых объектов вступают в химическую реакцию с различными реактивами, образуя окрашенные продукты реакции. По формирующейся окраске можно судить не только о наличии, но и о количественном содержании исследуемого вещества [3].
В изученной литературе была обнаружена только одна статья по использованию красителей для определения локализации белков в фации - проводили окрашивание уже высохшей капли после ее фиксации [4]. Такой подход не позволяет отслеживать миграцию различных групп белков при испарении жидкости и может вносить искажение в конечный результат исследования, поскольку при данном способе обработки вымываются все солевые компоненты.
Задачей данной работы явилась разработка метода выявления локализации белков в высохшей капле сыворотки крови путем применения растворов красителей.
Экспериментальная часть
В ходе разработки способа были изучены спиртовой раствор эозина и растворы водорас-
творимых красителей: метиленовый синий, то-луидиновый синий, кармин, альциановый голубой, амидочерный 10В, кумасси бриллиантовый синий Я-250, оранжевый О, бромфеноловый синий, бромкрезоловый пурпурный. Данные красители применяют как в клинической диагностике для количественного определения суммарного белка в растворе, так и в гистохимии для выявления белков.
Насыщенные водные растворы красителей добавляли к сыворотке крови в следующих объемных соотношениях: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:10; 1:20; 1:50; 1:100. После пробы тщательно перемешивали и исследовали методом клиновидной дегидратации.
В качестве тестируемых жидкостей использовали сыворотку крови человека, сыворотку крови теленка, 10% раствор сывороточного человеческого альбумина, раствор гексапептида ар-гинил-а-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин 50 мкг/мл.
Результаты и обсуждение
Предварительно была проведена исследовательская работа по определению типа красителей и их наиболее подходящей концентрации. От применения растворимых в спирте гистохимических красителей пришлось отказаться, поскольку при добавлении их к содержащим белки жидкостям происходила денатурация последних. Насыщенность окраски высохших капель в ряду разведений для каждого из водорастворимых красителей падала с уменьшением его количества в пробе. Наиболее окрашенны-
ми, соответственно, были образцы с добавлением красителя к исследуемому раствору в соотношении 1:1. Однако при этом интенсивность окраски затрудняла наблюдение. Оптимальным для всех перечисленных красителей оказалось разведение в соотношении 1:3, которое и было использовано в дальнейшем.
Далее сравнивали картины высохших капель сыворотки крови, раствора альбумина и раствора гексапептида при добавлении различных красителей (табл. 1). Альциановый голубой и кумасси бриллиантовый синий (рис. 1) окрашивали белки сыворотки крови, альбумин и пептид. Несмотря на то, что альциановый голубой
Таблица 1
Окрашивание биологических жидкостей различными красителями при исследовании методом клиновидной дегидратации
Сыворотка крови человека Сыворотка крови теленка 10% раствор сывороточного человеческого альбумина Раствор гексапептида
Метиленовый синий + + + -
Толуидиновый синий + + + -
Бромфеноловый синий + + + -
Альциановый голубой + + + +
Кумасси бриллиантовый синий Я-250 + + + +
Кармин + + + -
Оранжевый О + + + -
Амидочерный 10В + + + -
Бромкрезоловый пурпурный + + +
Рис. 1. Картины высохших капель биологических Рис. 2. Картины высохших капель биологических
жидкостей при добавлении кумасси бриллиантового жидкостей при добавлении амидочерного 10В
синего Я-250 (20:1): а) сыворотка крови человека; б) (20:1): а) сыворотка крови человека; б) раствор сы-
раствор сывороточного человеческого альбумина; в) вороточного человеческого альбумина; в) раствор
раствор гексапептида гексапептида
Таблица 2
Количество выявленных зон окраски в высохшей капле сыворотки крови при окрашивании различными красителями
Красители Метиленовый синий Толуидиновый синий йинис й ы в О лон е 2 о р Ш й о ю о и « 3 и о онаи л л < й ы в о тн 0 а5 и 52 1 ск ю 5 и ни 8 ° а Кармин Оранжевый О т о й ын а о ч о д < й ы вй 1 § 0 зр 8. ^ 1 £ р
Количество зон 3 4 2 2 2 3 3 4 3
считается красителем селективным преимущественно к кислым мукополисахаридам [5], окрашивание происходит за счет формирования электростатических связей между молекулой красителя, несущей положительный заряд, и отрицательно заряженными участками мукопо-лисахарида. Кумасси бриллиантовый синий связывается с положительно заряженными аминогруппами аминокислот, входящих в состав белковой молекулы. Следовательно, механизм образования окрашенного комплекса будет одинаков как для молекул белка, так и для различных пептидов.
Кармин, метиленовый синий, толуидиновый синий, бромфеноловый синий, амидочерный 10В (рис. 2) и оранжевый О окрашивали только образцы сыворотки крови и альбумина (табл. 1). Согласно литературным данным [6], связывание с белками амидочерного 10В весьма специфично: нуклеиновые кислоты, полисахариды (хонд-роитин сульфат), аминокислоты и некоторые другие азотсодержащие вещества не дают окрашенных производных. Суммарные белки окрашиваются в различные цвета от черного до красного [7]. Этот факт весьма примечателен, поскольку поставленная нами задача определяет выбор такого красителя, который по-разному окрашивает различные группы белков.
Следовательно, вышеперечисленные красители специфично окрашивают только белки и являются наиболее пригодными при исследовании локализации различных белков в высохшей капле плазмы крови.
Количество окрашенных концентрических зон в высохшей капле сыворотки крови при применении различных водорастворимых красителей значительно различалось (табл. 2).
Наибольшее количество зон окраски было выявлено при использовании амидочерного 10В и толуидинового синего: краевая, промежуточная, состоящая из двух подзон, и центральная. В
некоторых случаях в краевой зоне обнаруживали более светлый узкий краевой ободок, причем для такого образца сыворотки крови этот феномен наблюдался при использовании всех красителей.
Заключение
Следовательно, наиболее информативными были результаты, полученные с окрашиванием сыворотки крови следующими водорастворимыми красителями - амидочерным 10В и то-луидиновым синим. Только при использовании двух вышеназванных красителей специфично окрашивались только протеины, при отсутствии окраски пептидов, и имело место максимальное количество концентрических зон окраски различных групп белков, то есть наиболее точно осуществлялась их дифференциация.
Таким образом, установлено рабочее разведение для красителей при изучении локализации белков в высохшей капле биологической жидкости. Определены наиболее специфичные для выявления белков красители, применение которых позволит подразделять собственно протеины и пептиды.
Список литературы
1. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. М.: Хризостом, 2001. 304 с.
2. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. М.: Иностранная литература, 1962. 962 с.
3. Волкова О.В., Елецкий Ю.К.. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: Медицина,1982. 304 с.
4. Яхно Т.А., Яхно В.Г., Санин А.Г. и др. Белок и соль: пространственно-временные события в высыхающей капле // Журн. технической физики. 2004. Т. 49. Вып. 8. С. 1055-1063.
5. Селиванов Е.В. Красители в биохимии и медицине: Справочник. Барнаул: Азбука, 2003. 40 с.
6. Шишкин С.С. Использование связывания красителей для количественного определения содержа-
ния белка в растворах (обзор)// Вопросы медицинской химии. 1982. Т. 28. № 5. С. 134-141.
7. Фрайштат Д.М. Реактивы и препараты для микроскопии: Справочник. М.: Химия, 1980. 480 с.
COMPARATIVE ANALYSIS OF DYE APPLICATION IN PROTEIN DETERMINATION DURING THE INVESTIGATION OF BIOLOGICAL LIQUIDS BY THE METHOD OF WEDGE-SHAPED DEHYDRATION
L.M. Obukhova
The possibility of application of water-soluble dyes in the determination of protein localization in the dried drop of blood serum is shown. The operating dilution for the used dyes is found and the most specific dyes are determined which make it possible to separate proteins and peptides. It is found that the most informative data are obtained with the use of amidoblack 10 B and toluidine blue. During the coloring of the blood serum with the above-mentioned dyes, the maximum number of concentric coloring zones is observed in the dried drop.
