CC BY
60
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, № 5(3) УДК 579.26:579.222
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ АМИДАЗ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS
© 2011 Ю.А.Павлова1'2, А.Н.Неустроева1, А.Ю.Максимов1'2
пермский государственный университет, г. Пермь 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
Поступила 18.07.2011
Исследованы почвенные культуры актинобактерий рода Rhodococcus, обладающие термостабильной амидазной активностью. Проведены ПЦР-анализ и секвенирование генов амидаз. Выявлены последовательности, гомологичные известным генам амидаз из R. erythropolis (GenBank, М88614), R. erythropolis (GenBank, E12517) и R. rhodochrous N774.
Ключевые слова', актинобактерии, амидаза, секвенирование, Rhodococcus.
Амидазы (КФ 3.5.1.4) - ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Они найдены у многих прокариот и эукариот. Микроорганизмы, активно использующие амиды и нитрилы в качестве ростового субстрата, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Agrob acterium, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, и др. [0, 0, 0, 0, 0, 0]. Известно, что у прокариот амидазная активность может быть сопряжена с метаболизмом нитрилов в нитрилгидратазно-амидазном пути гидролиза этих соединений, однако амидазы встречаются и у бактерий, не имеющих нитрилгидратазы [0].
Кроме способности к гидролизу амидов амидазы обладают также ацилтрансферазной активностью. Некоторые из этих ферментов проявляют стереоселективность по отношению к хиральным субстратам, например, к производным арилпро-пионовой кислоты. Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, аммонийных солей акриловой и никотиновой кислот, нестероидных противовоспалительных препаратов [0, 0].
Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью [7]. Известные амидазы подразделяются на четыре различные структурные группы [0]: I - сигнатурные ферменты, содержащие в первичной структуре GGSS-мотив (глицин-глицин-серин-серин); II - нитрилазы/цианидгидратазы; III - ацил-трансферазы; IV - уреазы [0]. Установлено, что даже у бактерий одного и того же вида встречаются структурно не родственные амидазы.
Данная работа посвящена исследованию анализу генов стереоселективных амидаз почвенных микроорганизмов, обладающих высокой амидазной активностью.
Павлова Юлия Андреевна, e-mail: lchm@iegm.ru; Неустроева Анна Николаевна, e-mail: lchm@iegm.ru; Максимов Александр Юрьевич, канд. биол. наук, e-mail: alm@iegm.ru
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объекты исследования - выделенные из почв штаммы актинобактерий Rhodococcus erythropolis и R. rhodochrous, активно трансформирующие амиды карбоновых кислот. Культуры изолировали из почвы методом прямого высева и выращивали на минеральной безазотной солевой среде N, содержащей ацетамид в концентрации 10 мМ. Трансформацию амидов и нитрилов с использованием активной биомассы проводили в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, рН 7.2, при начальной концентрации субстрата 2% параллельно при 25 и 50°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением конц. НС1 до концентрации 2%. Пробы центрифугировали 5 мин при 12 тыс об/мин. Продукты реакции анализировали методами ГХ (Shimatzu GC-20) и ВЭЖХ (Shimatzu LC-10A). В качестве стандартов использовали растворы чистых нитрилов, амидов и карбоновых кислот. Удельную активность амидазы выражали единицах (Ед), соответствующих 1 мкмоль продукта реакции (кислоты), образуемого за 1 мин, в пересчете на 1 мг веса сухих клеток (мкмоль/мг/мин). Хромосомную ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из акти-номицетов [0]. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) генов амидаз и секвенирования соответствующих ПЦР-фрагментов были разработаны прай-меры, комплементарные концевым участкам известных последовательностей генов амидаз, депонированных в базе данных GenBank (табл. 1). Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-SE ДНК-полимеразы (СибЭн-зим, Новосибирск) на термоциклере ТЗ (Biometra, Германия). Режим амплификации включал начальный цикл денатурации - 1 мин при 94°С; денатурацию, 94°С - 40 с; отжиг, 55-63° - 30 с; элонгацию, 72°С - 60 с; (35 циклов) и завершающий этап - 60 с при 72°С. Секвенирование последовательностей ПЦР-фрагментов проводили на приборе MagaBacelOOO (GE Healthcare) с использованием стандартных наборов в соответствии с инструкцией производителя. Сравнение последовательностей проводили с помощью программы ClustalW.
Таблица 1. Праймеры для амплификации генов амидазы
Выявляемый тип гена Праймер Последовательность
амидаза, гомологичная ферментам из К. егуЛгороИя (Е12517) и К. гЪойосЪгоиъ N-774 (Х54074) AmiRhd-1 AmiRhd-2 5'-ATGGCGACAATCCGACCTGACGACA 5' -C TAGGC GGGGC TG AGTTGTGGTGC AGA
амидаза, гомологичная ферменту из К егмЪгороИъ (М88714) AmiReR-1 AmiReR-2 5' -ATGC GAC AC GGTGAC АТС ТС С ТС GA 5' -ТТАС GC ТТС GAC GGTC TTC ТС GAC
амидаза, гомологичная ферменту из К егмЪгороИъ (АУ026386) AmiReX-1 AmiReX-2 5' -GTGC GAC С С AATC GC С С ATTC GGC С 5' -С TAC CGCAGCACCGGTGCGCTCGG
амидаза, гомологичная ферментам из К. ИЫосИгош ,Т1 (838270) Шюс1ососст ер. (ВБ061400) Ami.Tl-1 Ami.Tl-2 5' -ATGTC TTC GTTGAC ТС С С С С С AATT 5'-TTATGTCAGGGTGCCGGCTGCAGC
AmiBD-2 5' -ТС AGGAC GGC АС С GAGGGTC GC GG
амидаза, гомологичная ферменту КЬсхЗососсия ер. (А19131) AmiRsp-1 AmiRsp-2 5'-ATGGGCTTGC ATGAAC TGACGCTCG 5' -TC AAAGC GGC GC С AGTC GC GGC С A
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведён скрининг образцов подзолистых супесчаных почв, собранных в районах г. Березников, г. Соликамска и г. Перми Пермского края. В результате скрининга нами выделено более 400 культур грамположительных бактерий, активно метабо-лизирующих амиды и нитрилы, из них 38, обладающих амидазной активностью более 5
мкмоль/мг/мин. Основная часть активных изолятов была представлена актинобактериями, в основном относящимися к роду Rhodococciis. Методами полифазной таксономии изоляты идентифицированы как представители рода Rhodococciis: R. erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber [0]. Их видовая принадлежность была подтверждена методом ПЦР генов 16S рРНК с видоспецифическими прай-мерами (рис. 1).
Рис. 1. Идентификация штаммов К егуЖгороИх по генам 168 РНК. К г/юс/осИгоих ИЭГМ7т и К егуЖгороИх ИЭГМ62т - типовые штаммы соответствующих видов.
Показано, что большинство амидаз изолятов Rhodococcus высокоактивны при повышенной температуре (50°С), что свидетельствует также об их технологической стабильности и является положительным признаком для биотехнологического применения.
Установлено, что ферменты исследуемых культур способны активно трансформировать большой
ряд амидосоединений, включая алифатические, разветвленные, непредельные, гидроксилирован-ные и некоторые ароматические амиды [0]. Наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов являются ацетамид и пропионамид (наиболее простые по структуре и легко метаболизи-руемые субстраты). Однако некоторые штаммы, селекционированные на изобутиронитриле и изо-
бутирамиде предпочитали именно эти субстраты с пространственно затрудненным доступом к амид-ной группе. Известно, что штаммы, выделенные методом обогащенной культуры, часто проявляют высокую конвертирующую способность именно к тому субстрату, который использовался для селекции. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью.
В ходе селекционного процесса при постепенным повышении концентрации субстрата (нитрила) выделены культуры Я. егу1/ттро/1.\ 4-1-6, 4-1-6 6-21, 11-2, 11-1-3 и Я. гЬсхЗосЬгогм 11-8, 11-85, проявляющие амидазную активность более 12 Ед. при 25 °С и более 30 Ед. при 50°С, а также активность нитрилгидратазы более 10°С.
Проведён молекулярный анализ генов амидаз. Показано, что геномы изолятов ЯЬскЗососсш содержат преимущественно последовательности, родственные ранее известным генам амидаз двух
структурных групп: I - энантиоселективные амида-зы, как у Я. егу1/ттро/1.\ (СепВапк, Е12517), Я. гЪо^сЪгог^ N-771, (СепВапк, Х54074) и II - алифатические амидазы, как у Я. егу1/ттро/1.\ (СепВапк, М88614).
Гены других видов амидаз встречались со значительно меньшей частотой. Последовательности группы I, были обнаружены у отдельных изолятов Я. егу1/ттро/1.\ и Я. гЬоЛосЬгоня. Другие культуры тех же видов содержали другие ферменты. Результаты ПЦР-анализа подтвердили, что наличие амидазы определённого типа не является видоспеци-фическим признаком.
Большинство штаммов также содержали последовательности, родственные генам а- и (3-субъединиц Бе-содержащей нитрилгидратазы штаммов Я. гЬсхЗосЬгогм N-774, ЯЬоЛососсш ер. 11312.
Рис. 2. ПЦР-анализ последовательностей, гомологичных генам амидазы К егуЖгороИх. СепВапк, Е12517, у почвенных изолятов Ююс1ососсих.
Проведено секвенирование полученных ПЦР-фрагментов с помощью ДНК-секвенатирующей системы Ме§аВа8е1000. Установлено, что гомоло-
гия исследуемых генов почвенных изолятов известной последовательности Е12517 составляет от 97,83 до 100% (табл. 2).
Таблица 2. Процент гомологии генов амидаз группы I
штамм Е12517 4-1-6 4-1-7 11-8 6-2-1 11-1-3/4
К егу^ЬгороНя Е12517 100,00% 98,40% 99,10% 99,17% 99,23% 98,00%
К егу^ЬгороНя 4-1-6 100,00% 99,29% 99,29% 99,17% 97,83%
К егу^ЬгороНя 4-1-7 100,00% 100,00% 99,90% 98,53%
К гЬойосЬгоиз 11-8 100,00% 99,87% 98,53%
К егу^ЬгороНя 6-2-1 100,00% 98,59%
К егу^ЬгороНя 11-1-3/4 100,00%
Высокая степень гомологии исследованных последовательностей ДНК из различных источников свидетельствует о высокой консервативности структуры генов и соответствующих ферментов.
При переводе нуклеотидной последовательности в аминокислотную установлено, что у исследуемых штаммов есть ряд нуклеотидных замен по сравнению с ранее известными последовательностями, что, вероятно, обуславливает ранее установ-
ленные различия субстратной специфичности ферментов [0, 0].
Притом сходство соответствующих аминокислотных последовательностей составило от 99,7 до 100%, т.е. ряд замен нуклеотидов являются синонимическими, не приводят к заменам аминокислот (рис. 3).
Таким образом, установлено, что среди культур, обладающих высоким уровнем амидазной активно-
сти, преобладают представители рода Ююс1ососсгш. Среди почвенных изолятов /Июс/ососсня. обладающих высокой амидазной активностью, наиболее распространены гены амидаз двух типов, гомологичные последовательностям из Я. еп^ЬгороШ, СепВапк, Е12517 и Я. егу1Нго/ю11.\. СепВапк, М88614. Гены ранее известного структурного типа энантиоселективных амидаз гомологичных последо-
вательности Е12517, широко представлены у родо-кокков, обитающих в почве естественной среды. Показано, что гены исследуемого структурного типа амидаз встречаются у изолятов разных видов /{/юс/ососснл и обладают высокой степенью консервативности, но при этом не являются обязательным элементом генома.
еat f р тт 5 re н yv ft £ n р l5 ан yvtt si f ft sd gv lt gr r vai kj» eatppttsrehjjvpta^enflsawyvttsiр ft ed g v lt gr r 7 ai к» eat pftt sre h sv ft e h p le ah yvtt 5 г p ft ED g v lit gr rvai k* Eat pptt sre h sv ptA^ e h p ls AH YVTT sI PPT sd gv ltgrrvAlk> EÍTPPTTSREHSVPTAÍEMPL5AH7VTT5I PPTSDGVLTGPRVAI Kj eat p f tt sre h Sv ft дЧе h p le aw y vtt s i p ft ed g v lt gr r v a i m EATPPTTSREHJvPTA^lMPLSAWYVTTSI pptsdgv LTGPRVAI k¡j
MATIF РРРНAl DTAASH YGlTLtiQSAFljEWE'ALIDGA LG SY D V VD í L TAD MAT IP PDDNAI DTAAPHYGITLDQSARLE4PALIDGA LGSYDVVDgLYAD H AT I F № D U AI DT AA ft H TGI T LD <? S A fcLEtt P A LI D G A LG 5 Y D VVD g L V AD HAT IE PI) DH AI DT A A ft H Y <31TLDQ S A P LE W PftLIDGALOSYDVVDQLY AD MATIPPDDKAIDT A A KH Y GIT LC <3 S A RLE W P A LID G A LG " VD QLTf AD HATIH PDDflAIDTAARHYGITLDQEARLEWPALIDGA LGSYDVVDQLYAD MATIRPPDNM DTAAXHYGITLDQSARLEWPALIDGA LGE,"YDVVDQLYAD
TEanslatlon_ll-3_gen-e Tr an si at ion^62 l^gene Translation_4~l~7 gene
Translatian_11^2_gttw Translation Е125П g^ne
УСр«ЛН#НН4Я
rranslation_ll-l-3J_gene Translation ll-Э gene Translation 621 gene2 Translation 4-1-7 gene Translation_4^1-,&_gene Ti a n s 1 a 11 о n_ 11 - 2_ ge ne T1 a n si a t i o n^E12 517_ge ne
[1 AT IR PDD К AI DT AA R К YGIT LD Q S A RLE W P A LI D Gñ LG S Y О V VD Q L Y AD
Усредненная
E AT P P TT S RE H T V PT AS E H í> LS АИ Y VTT SI P PT SU BU LT GR RV AI KUH VT
Ttanslation_ll-l-34_geíre Transí at
Translation 621 gent Translation 4-1-7 gene Translation_4-l—6_g*ne Translation_ll-2_yene Ti a n s1 a t i о n_El2 517_ge ne
Усреднен ная
v а о v p ни ff g3rtye3 ft p sfd ATWT r lla ao atvtokktc ed lc fsoss
v a (j vp hm 3jgs rt ve g ft f £ r d at v vt rllaag at v ag ka vc edlcfsgss
v a g vp гш jf ge rt v e g ft p s rd at v vt rl la ag at v ag к a vc ed lc f 2 g se va g v piш h gs rt v 5 g ft p e r d at v vt rlla ag at v ag ka vc ed lc f 5 g 5e
v a g vp mil h ge rt ve g ft p er d at v vt rlla ag at v ag ka vc edlcfsgse
v a g v p пн h ge rt ve g ft p s r □ atv vt rlla ag a tv ag ka vc e d lc f s g se .'s о vpijhjifliiftvegft p 5edat vlt rlla ag at v ag ka vc e l' lc f::gss
V a G V P tllJ H GS rtV E G FT F 5 R DatV RLLA AG at V AG KA VC EDLCF5G5S
Translation_ll^l-.34_gene Translation_l 1-в_дег» Transí at
TtahSlation_^-l-7_gene Transí at
Translatian_ii-2 gins T r a n s1 a t i o n_E12 517_g e ne
Усредненная
t4tp a5gp vp kpwd p<JftE aggs3gg5a alva «gd vdfaiggdíggsiripa ftpasgpvrmpwdpqpeaggssgssaalvahgdvdfaiüüd^ggsiripa ftpaegpvr hpwd pqre aggseggsaalvaugd vpfa igcjdqggsi ri pa ftpasgpvphpwd pceeaggssggsaalvahgdvdfaiggdqggsi pi pa ftpasgpvr hpwd pqreaggssgssaalvangdvdfaigbdqggsiripa ftpaegpvrhpwd p^reaggeeggeaalva ngdvdfaiggdqggei p i pa ft pas gpvr h p wep q re agg ee gg eaalva h g□vd faig gdq g ge irip a
ftpaegpvrhpkd р£>ее aggs5ggsaalvahgd vdfaiggdqggsiri pa
Рис. 3. Сравнение полных белковых последовательностей амидаз Rhodococcus.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», 2009-2013 гг., шифр 2009-1.1201-018-001.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Перцовпч СЛ. и др. Алифатическая амидаза из Шюс1ососс11$ гЬойосЬгоиз - представитель семейства нитрилаз/цианидгидратаз // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1556-1565.
2. Максимов А.Ю. и др. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма
Rhodococcus sp. gtl // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 1.С. 63-68.
3. Клонирование ДНК. Методы. М., 1988. 538 с.
4. Демаков В.А. и др. Почвенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью // Вестник Пермского ун-та. 2009. С. 79-83.
5. Кузнецова М.В. и др. Распространение нитрилконверти-рующих бактерий в почвах Пермского края // Вестник Пермского ун-та. 2007. Т. 5. С. 96-99.
6. Asano Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic synthesis - selection and optimization of biocatalysts // J. Biotechnol. 2002. V. 94. P. 65-72.
7. Banerjee A., Shatma R., Banerjee U.C. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 60. P. 33-44.
8. Cowan D. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremo-philes. 1998. V. 2. № 3. P. 207-216.
9. Fornaud D., Arnaud A. Aliphatic and enantioselective ami-dases: from hydrolysis to acyl transfer activity // Appl. Microbiol. 2001. V. 91. № 9. P. 381-393.
10. Kotlova E.K. et al. Isolation and primary characterization of an amidase from Rhodococcus rhodochrous И Biochemistry. 1999. V. 64. N. 4. P. 384-389.
COMPARATIVE ANALYSIS OF GENE SEQUENCES OF AMIDASES OF SOIL ACTINOBACTERIA RHODOCOCCUS
© 2011 Yu.A. Pavlova1, A.N. Neustroeva1, A.Yu. Maksimov 12
1 Perm State University, Perm institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of RAS, Perm
The soil culture of Rhodococcus actinobacteria with thermostable amidase activity have been investigated. PCR and sequencing of amidase genes were performed. The homologous sequences that are to known genes of the amidase of R. erythropolis (GenBank, M88614), R. erythropolis (GenBank, E12517) and R. rhodochrous N774 were identified.
Key words: actinobacteria, amidase, sequencing, Rhodococcus.
Pavlova Yulia Andreyevna, e-mail: lchm@iegm.ru; Neustroeva Anna Nikolaevna, e-mail: lchm@iegm.ru; Maksimov Aleksander Yurievich, Candidate of Biology, e-mail: alm@iegm.ru
