CC BY
32ВАКЦИНОЛОГИЯ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.В.Аронова, Н.Н.Оноприенко, М.В.Цимбалистова, Н.В.Павлович
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА У ЛЮДЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ЖИВОЙ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНОЙ
Ростовский противочумный институт, Ростов-на-Дону
Цель. Сравнительный анализ показателей гуморального и клеточного иммунитета у вакцинированных против туляремии людей. Материалы и методы. В реакции непрямой гемагглютинации и реакции лейкоцитолиза с тулярином были изучены образцы сывороток и крови 258 иммунизированных людей. Результаты. Показано, что 73% обследованных имели как специфические антитела, так и положительные значения клеточного иммунитета. Наличие противотуляремийного иммунитета зарегистрировано у 26 из 30 людей, иммунизированных 10 — 20 лет назад. Однако у 76 человек (26%) мы обнаружили расхождение результатов двух использованных методов, что затрудняет оценку состояния специфического иммунитета. Так, использование только одного метода, характеризующего либо гуморальный, либо клеточный иммунитет, не дает объективной информации. Заключение. Для повышения достоверности результатов оценки состояния противотуля-ремийного иммунитета целесообразно использование двух методов, направленных на выявление как специфических антител, так и реакции гиперчувствительности замедленного типа. Только положительные иммунологические показатели обоих тестов подтверждают наличие иммунитета против Francisella tularensis и возможность переноса сроков ревакцинации.
Журн. микробиол., 2014, № 5, С. 32—37
Ключевые слова: вакцинальный иммунитет, противотуляремийный иммунитет у людей, специфические антитела, реакция гиперчувствительности замедленного типа
N.V.Aronova, N.N.Onoprienko, M.V.Tsmbalistova, N.V.Pavlovich
COMPARATIVE ANALYSIS OF PARAMETERS OF HUMORAL AND CELL SPECIFIC IMMUNITY IN INDIVIDUALS IMMUNIZED WITH A LIVE TULAREMIA VACCINE
Rostov-on-Don Institute of Plague Control, Russia
Aim. Comparative analysis of parameters of humoral and cell immunity in individuals vaccinated against tularemia. Materials and methods. Sera and blood samples of 258 immunized individuals were studied by indirect hemagglutination and leukocytolis with tularin reaction. Results. 73% of the examined individuals had both specific antibodies and positive values of cell immunity The presence of anti-tularemia immunity was registered in 26 of 30 individuals immunized 10 — 20 years ago. However in 76 individuals (26%) we have detected discrepancies of the results of the 2 methods that complicate the evaluation of specific immunity status. As such, the use of only 1 method characterizing either humoral or cell immunity does not give objective information. Conclusion. The use of 2 methods directed on detection of both specific antibodies and delayed-type hypersensitivity reaction is reasonable for the increase of validity of results of anti-tularemia immunity status evaluation. Only positive immunologic parameters of both tests confirm the presence of immunity against Francisella tularensis and the possibility of revaccination period delay.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 5, P. 32-37
Key words: vaccinal immunity, anti-tularemia immunity in humans, specific antibodies, delayed-type hypersensitivity reaction
ВВЕДЕНИЕ
Туляремия является тяжелой токсико-аллергической инфекцией человека и животных. В связи с широким распространением природных очагов на территории бывшего СССР и крупными эпидемическими вспышками эта инфекция в прошлом представляла серьезную проблему здравоохранения [5]. Разработка живой туляремий-ной вакцины (ЖТВ) и внедрение в практику массовой иммунизации населения позволило резко снизить заболеваемость, и сегодня туляремия в РФ относится к контролируемым инфекциям. Однако стабильность эндемичных очагов и снижение иммунной прослойки населения в последние годы определяет неблагополучие по туляремии в отдельных регионах страны. Например, по данным Роспотребнадзора, крупная вспышка туляремии в 2013 г. в Ханты-Мансийском автономном округе обусловлена не только активизацией природного очага, но и резким сокращением объема вакцинации населения в предшествующие годы. Поэтому вопросы специфической профилактики инфекции сохраняют свою актуальность.
Установлено, что даже однократная иммунизация человека ЖТВ обеспечивает длительный и напряженный поствакцинальный иммунитет [1, 5, 7, 13]. Вместе с тем, при высокой эффективности ЖТВ обладает реактогенностью и может вызывать у некоторых людей поствакцинальные осложнения — аллергическую реакцию, повышение температуры, местное воспаление, увеличение регионарных лимфоузлов. Кроме того, в современных условиях совершенствование системы вакцинопрофи-лактики инфекционных заболеваний должно быть больше ориентировано на индивидуализацию подхода для каждого защищаемого человека [2]. Поэтому для решения вопроса о необходимости повторной иммунизации в действующих нормативных документах регламентировано определение напряженности противотуляремийного иммунитета через 5 лет после первичной вакцинации [4]. При сохранении положительных показателей специфического иммунитета срок ревакцинации переносится.
В настоящее время для оценки состояния противотуляремийного иммунитета у людей рекомендовано использование одного из иммунологических методов исследования, направленных на выявление либо специфических антител (гуморальное звено), либо аллергической реакции гиперчувствительности замедленного типа (клеточное звено) [4]. При этом известно, что ведущая роль в защите человека от туляремийной инфекции принадлежит клеточному звену, тогда как антительный ответ имеет подчиненное значение [1, 18]. Однако опыт показывает, что наиболее широко в практике применяются именно серологические методы, характеризующие гуморальный ответ организма на F.tularensis [3]. Вопрос о том, насколько данный показатель отражает степень защиты человека от возбудителя и коррелирует с клеточным иммунитетом, остается открытым. Целью настоящей работы явился сравнительный анализ результатов оценки гуморального и клеточного противотуляремийного иммунитета у людей, вакцинированных ЖТВ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использована коллекция образцов крови и сывороток от 258 сотрудников противочумного института после их иммунизации живой туляремийной вакциной (через 21 день — 22 года). В качестве контроля были обследованы 15 человек, не имевших в анамнезе вакцинацию ЖТВ.
Для оценки напряженности гуморального противотуляремийного иммунитета определяли титр противотуляремийных антител в сыворотках крови с помощью ре-
3. ЖМЭИ 5 № 33
33
акции непрямой гемагглютинации (РНГА) с коммерческим эритроцитарным диа-гностикумом производства Ставропольского НИПЧИ. Исследуемые сыворотки инактивировали при 56°C 30 минут и адсорбировали контрольными эритроцитами барана в соответствии с рекомендациями производителя. Контроль специфичности выявленных антител проводили в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Все реакции ставили микрометодом согласно [4]. Титры специфических антител 1/10 — 1/20 оценивали как отрицательные или сомнительные, 1/40 — слабоположительные, 1/80 и выше — четко положительные.
Определение показателей клеточного звена противотуляремийного иммунитета проводили с помощью аллергических методов: пробы с тулярином и реакции лейко-цитолиза (РЛ) [4]. Аллергическую пробу выполняли накожным методом с соответствующим тулярином производства НПО «Микроген», Омск. Учет и оценку реакции производили через 24 — 48 часов [4].
В качестве антигена для выполнении реакции лейкоцитолиза использовали накожный тулярин. Средние значения коэффициента лейкоцитолиза (КЛ) в трех независимых пробах рассчитывали по рекомендованной формуле [4]. Результаты реакции лизиса иммунных лейкоцитов учитывали следующим образом: КЛ<15% — отрицательный результат; КЛ=15 — 20% — сомнительный или слабоположительный результат; КЛ>20% — четко положительный результат.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Для реализации поставленных целей были использованы иммунологические методы, характеризующие гуморальное (РНГА) и клеточное (РЛ) звенья противотуля-ремийного иммунитета. При постановке экспериментов для подтверждения достоверности и специфичности результатов первоначально были изучены 15 нормальных (неиммунных) сывороток и образцов крови от неиммунизированных людей. Ни в одном случае нам не удалось выявить взаимодействия туляремийного диагностикума с сывороткой или повреждающего действия тулярина на лейкоциты людей контрольной группы.
При исследовании коллекции 258 сывороток от иммунизированных ЖТВ людей в РНГА установлено, что подавляющее большинство проб (95,7%) содержали специфические антитела в титрах 1/40 — 1/1280. Доля сывороток с сомнительными или отрицательными титрами антител (<1/20) составляла лишь 4,3%. Наиболее высокие титры 1/640 — 1/1280 были зарегистрированы через 1 — 3 месяца после первичной иммунизации людей, но в дальнейшем они имели тенденцию к снижению (срок наблюдения 5 лет). Дополнительно было проанализировано состояние специфического иммунитета у 30 человек, привитых против туляремии 10 — 22 года назад. У 28 из 30 обследованных (93%) были выявлены в сыворотках противотуляремийные антитела в титрах 1/40 — 1/160. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что иммунизация человека живой туляремийной вакциной вызывает выраженную продукцию специфических иммуноглобулинов, которые могут сохраняться в сыворотках вакцинированных людей в течение длительного времени.
Для оценки аллергической перестройки организма у привитых, характеризующей индукцию клеточного звена иммунитета, использовали реакцию лизиса иммунных лейкоцитов (in vitro) или пробу с тулярином (in vivo). Предварительно для корректности сравнения результатов этих двух методов и их интерпретации мы провели параллельное изучение реакции аллергии у 10 вакцинированных людей с помощью РЛ и пробы с тулярином. Полученные данные показали, что у всех исследуемых положительный коэффициент лейкоцитолиза подтверждался позитивными результатами реакции с тулярином. В связи с тем, что проба с тулярином, требующая проведение манипуляций с людьми, связана с определенным риском, а учет результатов возможен только через 24 — 48 часов, для выполнения дальнейших исследований мы предпочли использовать реакцию лейкоцитолиза, выполняемую in vitro в течение 2 — 3 часов.
При изучении клеточного звена иммунитета у 258 вакцинированных людей с помощью РЛ выявлено, что у большинства (76,7%) регистрируется положительная реакция гиперчувствительности замедленного типа. Более того, в специальной группе людей (30 человек), последняя вакцинация которых была проведена 10 — 22 года назад, нам удалось подтвердить сохранение показателей клеточного иммунитета у 26 человек (87%).
В то же время, сравнительное исследование показателей клеточного и гуморального звеньев противотуляремийного иммунитета у общего числа обследованных выявило частичное несоответствие результатов двух методов — РЛ и РНГА. В частности, обращает на себя внимание тот факт, что если наличие специфических антител было обнаружено у 95,7% вакцинированных, то положительные показатели клеточного иммунитета зарегистрированы только у 76,7%. При анализе индивидуальных проб оказалось, что позитивные результаты совпадали в обоих тестах у 73,2% привитых людей, а отрицательные — в 0,8% случаев.
Таким образом, у 26% исследованных людей результаты одного метода не подтверждались данными другого, что существенно затрудняло оценку состояния их противотуляремийного иммунитета. Например, у 22,5% людей, имеющих специфические антитела, отсутствовал антиген-индуцируемый лизис иммунных лейкоцитов, а в 3,5% случаев при наличии выраженной реакции лейкоцитов на туляремийный антиген специфические иммуноглобулины в сыворотках не регистрировали. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что оценка показателей с использованием только одного из рекомендуемых методов (серологического или аллергического) не всегда дает возможность достоверно определить состояние противо-туляремийного иммунитета у человека.
Известно, что целью изучения напряженности специфического иммунитета после вакцинации человека ЖТВ является как оценка эффективности первичной иммунизации, так и вопрос о сроках и необходимости проведения ревакцинации. На наш взгляд, только положительные показатели двух звеньев противотуляремийного иммунитета позволяют более обоснованно судить о сохранении иммунитета и сроках проведения ревакцинации. В случае отрицательных результатов или их расхождения представляется целесообразным проведение повторной иммунизации. Учитывая данные о высоком риске внутрилабораторного заражения F.tularensis, особое значение это приобретает для сотрудников, непосредственно работающих с возбудителем туляремии [17, 19].
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время изучению иммуногенеза при туляремии посвящены многочисленные исследования, однако большинство современных работ выполнено на модели лабораторных животных или культур клеток [12, 16]. Наиболее подробное изучение индукции протективного поствакцинального иммунитета против туляремии у человека относится ко времени создания советскими исследователями живой туля-ремийной вакцины и внедрения ее в практику [1, 6, 8]. Так, по мнению разработчиков вакцины, длительный поствакцинальный иммунитет обусловлен нестерильным характером, т.е. персистенцией бактерий вакцинного штамма в организме человека (Элберт Б.Я., Гайский Н.А., 1941). Вместе с тем, в последние годы появляются данные о возможности сохранения специфического иммунитета в течение многих лет без персистенции возбудителя. Так, найдены уникальные субпопуляции долгоживущих В-лимфоцитов, ответственных за синтез специфических антител и антиген-специфических Т-клеток иммунологической памяти, поддержание популяции которых не требует постоянного присутствия антигена [10, 11]. Таким образом, вопрос о механизмах формирования стойкого длительного противотуляремийного иммунитета нуждается в дальнейшем уточнении.
Сегодня не вызывает сомнения тот факт, что эффективная защита против туляре-
мии определяется сложным взаимодействием клеточного и гуморального звеньев иммунитета [14, 15]. Однако, по мнению большинства исследователей, протективное действие вакцины обусловлено индукцией клеточного звена иммунитета. Целью настоящей работы явился сравнительный анализ результатов оценки гуморального и клеточного противотуляремийного иммунитета у людей, вакцинированных ЖТВ
При обследовании 258 вакцинированных установлено, что положительные показатели двух звеньев иммунитета зарегистрированы у большинства людей (73,2%). Более того, нам удалось подтвердить наличие противотуляремийных иммуноглобулинов и специфического клеточного ответа на туляремийный антиген у людей, привитых 10 — 22 года назад. Наши результаты согласуются с данными Савельевой Р.А. и др. [7] и Eneslätt K. et al. [13] о сохранении поствакцинального иммунитета у людей более 20 лет и подтверждают высокую эффективность живой туляремийной вакцины, обеспечивающей долговременную защиту организма хозяина от инфекции.
В то же время, следует отметить, что у 26% иммунизированных людей нам удалось выявить расхождение показателей в РНГА и РЛ. В таких случаях сделать однозначное заключение о состоянии их противотуляремийного иммунитета и соответственно о необходимости проведения ревакцинации представляется затруднительным. Необходимо иметь ввиду, что при высокой эффективности ЖТВ против голарктических штаммов иммунизация в значительно меньшей степени защищает человека против респираторного заражения штаммами F.tularensis subsp. tularensis [16]. В данной связи, особую актуальность приобретает вопрос об иммунизации (ревакцинации) против туляремии сотрудников лабораторий особо опасных инфекций, ведущих исследования с возбудителем туляремии этого подвида.
Результаты проведенного нами исследования предполагают, что для повышения достоверности и информативности оценки специфического иммунного статуса вакцинированного человека целесообразно одновременное использование двух методов, отражающих как гуморальное, так и клеточное звенья противотуляремийного иммунитета. На наш взгляд, только положительные иммунологические показатели в обоих тестах могут являться основанием для проведения повторной иммунизации.
Л ИТЕРАТУРА
1. Майский И.Н. Иммунология туляремии. М., 1953.
2. Медуницын Н.В., Покровский В.И. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционный болезней. М., 2005.
3. Мещерякова И.С. Туляремия: современная эпидемиология и вакцинопрофилактика. Эпидемиол. вакцинопроф. 2010, 2 (51): 17-22.
4. МУ 3.1.2007-05. Эпидемиологический надзор за туляремией: Методические указания. М., Роспотребнадзор, 2005.
5. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М., Медицина, 1975.
6. Олсуфьев Н.Г. Туляремия. М., Медгиз, 1960.
7. Савельева Р.А., Ананова Е.В., Пронин А.В. и др. Определение продолжительности поствакцинального иммунитета против туляремии. Журн. микробиол. 1995, 6: 51-52.
8. Сильченко В.С. К вопросу ревакцинации при прививках против туляремии. Журн. микробиол. 1953, 6: 47-50.
9. Barry E.M., Cole L.E., Santiago A.E. Vaccines against tularemia. Hum. Vaccin. 2009, 5 (12): 832-838.
10. Boyman O., Létourneau S., Krieg C. et al. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. Eur. J. Immunol. 2009, 39 (8): 2088-2094.
11. Cole L.E., Yang Y., Elkins K.L. et al. Antigen-specific B-1a antibodies induced by Francisella tularensis LPS provide long-term protection against F. tularensis LVS challenge. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106 (11): 4343-4348.
12. Ellis J., Oyston C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15 (4): 631-646.
13. Eneslätt K., Rietz C., Ryden P. et al. Persistence of cell-mediated immunity three decades after vaccination with the live vaccine strain of Francisella tularensis. Eur. J. Immunol. 2011, 41 (4): 974-980.
14. Isherwood K.E., Titball R.W., Davies D.H. et al. Vaccination strategies for Francisella tularensis. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2005, 57 (9): 1403-1414.
15. Kirimanjeswara G.S., Olmos S., Bakshi C.S. et al. Humoral and cell-mediated immunity to the intracellular pathogen Francisella tularensis. Immunol. Rev. 2008, 225: 244-255.
16. Pechous R. D., McCarthy T. R., Zahrt T. C. Working toward the future: insights into Francisella tularensis pathogenesis and vaccine development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2009, 73 (4): 684-711.
17. Pike R. M. Laboratory-associated infections: summary and analysis of3921 cases. Health Lab. Sci. 1976, 13: 105-114.
18. Tärnvik A., Ericsson M., Golovliov I. et al. Orchestration of the protective immune response to intracellular bacteria: Francisella tularensis as a model organism. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996, 13: 221-225.
19. Shapiro D. S., Schwartz D. R. Exposure of laboratory workers to Francisella tularensis despite a bioterrorism procedure. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (6): 2278-2281.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Аронова Надежда Валентиновна,
344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Т.М.Соколова2, А.Н.Шувалов1, В.В.Полосков1, И.М.Шаповал1, М.П.Костинов3
ВАКЦИНЫ «ГРИППОЛ», «ВАКСИГРИП» И «ИНФЛЮВАК» - ИНДУКТОРЫ ГЕНОВ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА В КЛЕТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, 2НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, 3НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Изучение действия инактивированных гриппозных вакцин на активность генов врожденного и адаптивного иммунитета (TLR3, TLR4 и В2М) и Dicer1 гена РНК-интерференции и продукцию цитокинов (антивирусных ИФН типа I и II, регуляторных ИЛ10, ИЛ17) и провоспалительных факторов ИЛ1-бета, ФНО-альфа. Материалы и методы. В клетках крови человека, обработанных различными дозами вакцин, генная экспрессии определена методом ОТ-ПЦР в реальном времени с авторскими праймерами. В культуральной жидкости измерена концентрация цитокинов иммуноферментным методом с использованием наборов «Вектор-бест». Результаты. Исследованные вакцины имеют характерные эффекты на генном уровне. Вакцина «Гриппол» преимущественно стимулирует ген TLR4, активирует гены TLR3, В2М и Dicer1. Вакцина «Инфлювак» в большей степени индуцирует TLR3 ген и в меньшей степени TLR4 ген, не влияет на экспрессию гена В2М и ингибирует Dicer1 ген. Сплит-вакцина «Ваксигрип» — самый сильный стимулятор генной активности в низких дозах. Ее основными мишенями являются гены TLR3 и В2М. Все инактивированные вакцины — индукторы высокого уровня гамма-ИФН, низкого уровня ФНО-альфа и не индуцируют ИЛ17. Дополнительно «Гриппол» стимулирует секрецию ИЛ1-бета, а «Ваксигрип» — ИФН-альфа. Субъединичные вакцины «Гриппол» и «Инфлювак», содержащие очищенные гемагглютинины вируса гриппа, индуцируют в клетках крови синтез ИЛ10. Заключение. Получены иммуногенетические характеристики применяемых сегодня инактивированных гриппозных вакцин.
Журн. микробиол., 2014, № 5, С. 37—43
Ключевые слова: гриппозные вакцины, клетки крови человека, экспрессия генов иммунитета, продукция интерферонов и цитокинов
