CC BY
26
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 616.24-036.12:616-002
Л. Ю. Долинина, А. Н. Делиева, А. П. Каклюгин, Е. О. Богданова, О. В. Галкина, В. И. Трофимов
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ В МАТЕРИАЛЕ, ПОЛУЧЕННОМ ИЗ БРОНХИАЛЬНОГО ДЕРЕВА И СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одним из наиболее распространенных заболеваний. Особенностью ХОБЛ является неуклонно прогрессирующая обструкция дыхательных путей, связанная с патологическим воспалительным ответом на повреждающие частицы или газы [10]. На течение и прогноз ХОБЛ в значительной степени оказывают влияние состояние иммунной системы и уровень секреции гуморальных медиаторов воспаления, которые, в свою очередь, определяют развитие целого ряда системных проявлений при ХОБЛ. Тем не менее особенности течения хронических обструктивных процессов и механизмы системного воспаления на различных стадиях заболевания остаются недостаточно исследованными.
Целью работы явилась сравнительная оценка активности провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-б), интерлейкина 8 (ИЛ-8), гамма-интерферона (г-ИФ) - в материале, полученном из бронхиального дерева (мокрота, смывы из бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) и сыворотке крови больных ХОБЛ различной степени тяжести. Также проводился сравнительный анализ уровня изучаемых цитокинов с концентрацией маркера системного воспаления С-реактивным белком (СРБ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для решения поставленных задач в клинике госпитальной терапии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова были обследованы 98 больных ХОБЛ различной степени тяжести в фазе затихающего обострения, из них 75 мужчин и 23 женщины. В период обострения 89 человек получали внутривенную терапию глюкокортикостеро-идами, 67 - небулайзерную терапию муколитиками и ингаляционными глюкокорикостероидами, 59 человек
постоянно получали в среднем 1000 мкг бекламетазона дипропионата ингаляционно как базисную терапию. Диагноз ХОБЛ, степень тяжести и активность течения заболевания устанавливали в соответствии с критериями Глобальной инициативы по хронической обструк-тивной болезни легких, пересмотра 2009 г. [10]. Исходя из руководства, выделено 4 группы пациентов с различной степенью тяжести заболевания. Первую группу (n=11) составили пациенты с первой стадией ХОБЛ, у которых регистрировалось только изменение индекса Тиффно менее 70 % от должного. Вторую группу составили пациенты с ХОБЛ второй стадии (n=28), у которых регистрировалось снижение ОФВ1 менее 80 % от должного, 0ФВ1/ФЖЕЛ<70 %. В третью группу (n=34) вошли больные с 0ФВ1<50 %, но более 30 % от должного. К четвертой группе (n=25) отнесены пациенты с крайне тяжелым течением ХОБЛ (0ФВ1<30 %). Критериями исключения из исследования были дыхательные нарушения при рецидивирующих тромбоэмболиях легочной артерии, раке легкого, системных аутоиммунных заболеваниях, тяжелой эндокринной, печеночной и почечной патологии. Средний возраст обследованных составил 61,87±10,7 года. 76 человек были курильщики со средним стажем курения 25,9±1,8 пачка/лет. У 41 человека имел место контакт с вредностями на работе.
Всем пациентам после подписания информированного добровольного согласия на медицинское вмешательство проводилось комплексное клинико-инстру-ментальное и лабораторное обследование по плану пульмонологического больного. Дополнительно исследовался анализ крови на С-реактивный белок (СРБ), фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-a), интерлейкин 8 (ИЛ-8), гамма-интерферон (g-ИФ). Концентрация про-воспалительных цитокинов также исследовалась в мокроте, смывах из бронхов и бронхоальвеолярном лаваже. ФНО-a, ИЛ-8, g-ИФ определялись методом иммуноферментного анализа с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Статистическая обработка данных проводили с помощью программы SPSS for Windows, версия 13.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительный анализ клеточного состава мокроты и смывов из бронхов выявил, что и в той, и в другой биологической жидкости при первой и второй стадиях ХОБЛ преобладает макрофагальная реакция, при третьей и четвертой стадиях ХОБЛ - нейтрофильная реакция. При этом достоверной разницы между клеточным составом мокроты и смывов из бронхов не получено (табл. 1).
При сравнительном изучении концентрации провос-палительных цитокинов в мокроте, смывах из бронхов и бронхоальвеолярном лаваже наиболее высокие значения для ФНО-a (p<0,005 для ФНО-a мокроты) были выявлены у больных со второй стадией ХОБЛ (табл. 2, 3). Полученные данные соотносятся с результатами цитологического анализа мокроты и смывов
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
из бронхов. При первой и второй стадиях ХОБЛ преобладает макрофа-гальная реакция, регистрируется достоверно более высокий уровень ФНО-а, который оказывает прямое цитотоксическое действие и поддерживает альтерацию ткани бронхов и выраженность воспалительной реакции [7]. В третьей стадии уровень ФНО-а остается высоким за счет повышенной выработки макрофагами и, возможно, за счет эффекта накопления. Также в этой стадии наибольших значений достигает уровень ИЛ-8 в мокроте и смывах из бронхов. ИЛ-8 и ФНО-а способствуют активации нейтрофилов, что и было подтверждено в результате изучения цитологического состава биологических жидкостей, полученных из бронхов больных. Высокий уровень нейтрофилов, возрастающий от второй к третьей стадии ХОБЛ, свидетельствует о неаллергическом характере воспаления. Имеющая место высокая активность воспаления, которая увеличивается при второй и третьей стадиях болезни, подтверждает значение воспаления и противовоспалительной терапии в прогрессировании ХОБЛ [4].
Исходя из полученных результатов, можно сказать, что максимальная активность воспалительного процесса в бронхах регистрируется во второй и третьей стадиях заболевания. Основными клетками воспаления являются макрофаги и нейтрофилы, синтезирующие провоспалительные цитокины, прежде всего, ФНО-а, и именно этот цитокин описывается как основной в запуске и поддержании системного воспаления при ХОБЛ [6, 7, 9].
При изучении концентрации у-ИФ в мокроте, смывах из бронхов и бронхоальвеолярном лаваже (табл. 2) более высокое значение данного маркера выявлено в бронхоальвеолярном лаваже больных со второй стадией ХОБЛ (47,6±4,7 пг/мл). При анализе доступной литературы встречаются исследования, где максимальные значения уровня у-ИФ, а также ФНО-а мокроты выявляются при начальных стадиях заболевания. Это, вероятно, объясняется тем, что у-ИФ и ФНО-а являются основными провоспалительными цитокина-ми, продуцируемыми макрофагами, которые поддерживают повреждение клеток и активность воспалительной реакции на начальных стадиях заболевания [7].
Анализ изучаемых маркеров воспаления и клеточного состава мокроты, смывов из бронхов и бронхо-альвеолярного лаважа показал, что достоверных различий данных показателей в различных биологических жидкостях не выявлено, что позволяет сделать вывод о равноценности информативности мокроты, получаемой неинвазивным методом и смывов из бронхов и бронхоальвеолярного лаважа, для получения которых необходимо проведение бронхоскопии. Полученные данные также свидетельствуют об информативности исследования цитограммы спонтанно отделяе-
Т аб ли ца
Сравнительный анализ клеточного состава мокроты и смывов из бронхов у больных ХОБЛ различной степени тяжести
Степень тяжести ХОБЛ Макрофаги ( %) Нейтрофилы( %)
мокрота смыв из бронхов мокрота смыв из бронхов
1 стадия (п=11) 2 стадия (п=28) 3 стадия (п=34) 4 стадия (п=25) 24,1±2,23 26,2± 1,24 14,6±2,21 17,6±3,45 25,4±3,73 26,9± 1,44 21,62± 5,54 16,5± 1,53 36,28±3,61 3 8± 3,11 54,8±6,08 50,1±3,97 31,4±4,40 35±2,42 44,89±6,08 34,8±4,01
мой мокроты в количественной оценке характера воспалительного процесса в бронхах [1, 11].
При исследовании сыворотки крови у пациентов с ХОБЛ различной степени тяжести выявлено достоверное повышение (р<0,005) уровня ФНО-а у больных со второй стадией заболевания. Уровень у-ИФ был наиболее высоким в первой и во второй стадиях (табл. 2). Эти результаты соотносятся с уровнем цитокинов в мокроте и бронхоальвеолярном лаваже. При второй стадии ХОБЛ регистрируется самый высокий уровень ФНО-а в мокроте (37,39±3,14 пг/мл, р<0,005) и у-ИФ в бронхоальвеолярном лаваже (47,6±4,7, пг/мл, р<0,005).
В то же время у пациентов с четвертой стадией ХОБЛ наблюдались наименьшие значения ИЛ-8, ИФ-у и ФНО-а. Имеются данные литературы, объясняющие этот факт снижением синтеза цитокинов вследствие истощения белково-энергетических ресурсов и иммунологической недостаточности, снижением фагоцитарного индекса нейтрофилов при более тяжелом течении заболевания [3]. Б. А. Черняк, Ф. И. Петровский в своих работах описывают похожие результаты, подтверждая высокий уровень воспалительной реакции при первой и второй стадиях заболевания, а также системность воспалительного процесса [7].
Однако чаще описываются обратные результаты [1, 2, 8, 12]. Показано нарастание уровня у-ИФ и ИЛ-8 при тяжелой и крайне тяжелой степенях ХОБЛ, что объясняется более выраженной антигенной стимуляцией при тяжелом течении хронической обструктивной болезни легких. Таким образом, полученные к настоящему моменту данные нельзя считать однозначными. Выявленное снижение уровня активности провоспалительных цитокинов при четвертой стадии ХОБЛ можно объяснить тем, что эта группа пациентов получала не менее 4 лет ингаляционные глюкокортикостероиды как базисную терапию, им проводилась наиболее активная противовоспалительная терапия в период обострения в сочетании с антибактериальной терапией и холинолити-ками длительного действия.
При изучении концентрации С-реактивного белка в крови больных с различной степенью тяжести ХОБЛ выявлены более высокие значения у больных с первой (17,8 мг/л) и второй (10,24 мг/л) стадиями заболевания, в то время как у больных с третьей и четвертой стадиями регистрировалось практически нормальное значение уровня СРБ в крови (5,2 мг/л). С-реактивный белок является неспецифическим маркером системного воспаления
Таблица 2 Концентрация ФНО-а, ИЛ-8 и у-ИФ в сыворотке крови у пациентов ХОБЛ различной степени тяжести (пг/мл)
Стадия ХОБЛ Сыворотка крови
ФНО-a ИЛ-8 g -ИФ
1 стадия (n=11) 9,25± 2,63 26,70±2,58 694,06±51,7
2 стадия (n=28) 14,05±3,0* 19,48±3,43 308±28,68
3 стадия (n=34) 4,91±0,9 28,69±2,92 208,68±32,5
4 стадия (n=25) 3,03±01 16,2± 1,04 88,23±2,58
* - различия достоверны р<0,005 между значениями данного показателя у больных ХОБЛ 1, 2 и 3 стадиями.
и относится к острофазовым белкам, т. е. его концентрация, как правило, повышается либо в самом начале воспалительного процесса, либо в его острую фазу. Также СРБ усиливает продукцию провоспалительных цитоки-нов. Снижение уровня СРБ сыворотки крови у пациентов с тяжелым и крайне тяжелым течением ХОБЛ обусловлено, возможно, тем, что пациенты этих групп получали ингаляционные глюкокортикоиды как базисную терапию в сочетании с холинолитиками пролонгированного действия и системные глюкокортикостероиды в период обострения. Учитывая данные результаты, можно предположить, что назначение базисной противовоспалительной терапии рационально на более ранних стадиях ХОБЛ. С. А. Прибылов также описывает значительное снижение уровня СРБ сывортки крови у пациентов со стабильным течением ХОБЛ на фоне терапии ингал-ляционными глюкокортикостероидами, что, в свою очередь, влияет на системные проявления ХОБЛ [5].
ВЫВОДЫ
1. Полученные результаты свидетельствуют практически об одинаковой информативности мокроты, смывов из бронхов и бронхоальвеолярного лаважа при изучении активности местного воспалительного процесса, что позволяет рекомендовать реже прибегать к инвазивным методам получения биоматериала.
2. При первой и второй стадиях ХОБЛ наблюдается острая воспалительная реакция, которую характеризуют СРБ сыворотки крови, макрофагальная реакция мокроты и смывов из бронхов, достоверно высокий уровень ФНО-а и у-ИФ сыворотки крови, мокроты и смывов из бронхов, что может быть связано как с активностью самого воспалительного процесса, так и с недостаточной противовоспалительной терапией.
3. Третья стадия заболевания характеризуется достоверно более высоким содержанием нейтрофилов,
снижением содержания макрофагов в спонтанной мокроте, прогрессированием воспалительной реакции с достоверным повышением ИЛ-8 сыворотки и мокроты, что может доказывать влияние персистирующей бактериальной инфекции на течение и прогрессирова-ние заболевания в более поздних стадиях.
4. В четвертой стадии развития ХОБЛ активность местного и системного воспаления уменьшается. Вероятна связь снижения уровня активности цитокинов в этой стадии как с продолжительной базисной терапией ингаляционными глюкокортикостероидами, так и с парентеральным введением глюкокортикостерои-дов на этапе обострения заболевания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авдеев, С. Н. Применение метода индуцированной мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей / С. Н. Авдеев, Э. Анаев, А. Чучалин // Пульмонология. - 1997. - № 2. - С. 81-86.
2. Бабанов, С. А. Клинико-иммунологические особенности, факторы риска и прогнозирование течения ХОБЛ в крупном промышленном центре Среднего Поволжья: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / С. А. Бабанов. - 2008.
3. Бархатова, Д. А. Системное воспаление и состояние нут-ритивного статуса при хронической обструктивной болезни легких: автореф. дис. ... канд. мед. наук / Д. А. Бархатова. -
2009. - 26 с.
4. Букреева, Е. Б. Этиология инфекционного процесса и особенности воспаления при хронической обструктивной болезни легких: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Е. Б. Букреева. - Томск, 2004. - 56. с.
5. Прибылов, С. А. Провоспалительные цитокины при хронической обструктивной болезни легких / С. А. Прибылов // Вестник новых мед. технол. - 2007. - Т. 10. - № 1. - С. 3.
6. Цветкова, О. А. Роль макрофагов и цитокинов в формировании воспаления и прогрессировании хронической обструк-тивной болезни легких / О. А. Цветкова // Рос. мед. вести. -
2010. - № 3. - С. 21-25.
7. Черняк, Б. А. Воспаление при ХОБЛ и возможности фар-макотерапевтического контроля / Б. А. Черняк, Ф. И. Петровский // Пульмонол. и аллергол. - 2008. - № 1. - С. 23-24.
8. Agusti, A. Systemic effects of chronic obstructive pulmonary disease / A. Agusti [et al] // Eur. Respir. - 2003. - № 21. - P. 347-3 60.
9. Chung, K. F. Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease / K. F. Chung // Eur. Respir. - 2001. - № 18. - P. 50S-59S.
10. Global initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD), 2009.
11. Prieto, L. Non-invasive methods for diagnosing asthma / L. Prieto, V. Gutierres, C. Morales // Allerg. Clin. Immunol. - 1997. -Vol. 7. - P. 348-350.
12. Steven, M. Anti-Inflammatory Cytokines / M. Steven // CHEST. - 2000. - № 117. - P. 62-72, 436.
Таблица 3
Концентрация ФНО-а, ИЛ-8 и у-ИФ в материале из бронхов у пациентов ХОБЛ различной степени тяжести (пг/мл)
Стадия ХОБЛ Мокрота Смыв из бронхов Бронхоальвеолярный лаваж
ФНО-a ИЛ-8 g-ИФ ФНО-a ИЛ-8 g-ИФ ФНО-a ИЛ-8 g-ИФ
1 стадия (n=11) 2 стадия (n=28) 3 стадия (n=34) 4 стадия (n=25) 3,74±0,2 37,39±3,14* 22,56±3,37 16±3,2 430,93±31,0 2683,5±20,24 298 0,28±20,5 2618±20,36 1,8± 0,17 58,66±3,5 57,9±2,25 55,25±1,5 5,08±0,16 7,02± 0,62 10,48±1,8 7,02± 0,42 10,2±1,3 248,1± 11,3 606,8± 11,08* 503,1±1,44 1,75±0,47 5,26±0,12 88,26±6,7 5,3±0,42 1,4±0,1 7,92±2,7 0,7±0,05 3,08±0,05 2,4± 1,05 298,0±27,2 261,4± 10,7 185±20,02 5,9± 1,06 47,6±4,7 1,2±0,5 1,01±0,11
* - различия достоверны р<0,005 между значениями данного показателя у больных ХОБЛ 1, 2 и 3 стадиями.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
РЕЗЮМЕ
Л. Ю. Долинина, А. Н. Делиева, А. П. Каклюгин, Е. О. Богданова, О. В. Галкина, В. И. Трофимов
Сравнительный анализ маркеров воспаления в материале, полученном из бронхиального дерева и сыворотке крови у больных хронической обструктивной болезнью легких
Обследованы 98 больных ХОБЛ различной степени тяжести в фазе затихающего обострения. Изучены уровни ИЛ-8, у-ИФ, ФНО-а в мокроте, смывах из бронхов и сыворотке крови больных ХОБЛ. Подтверждена корреляция данных цитокинов с цитологическим составом мокроты и смывов из бронхов, С-реак-тивным белком сыворотки крови в зависимости от стадии заболевания.
Ключевые слова: ХОБЛ, воспаление, цитокины.
;п()ГМУ
SUMMARY
L. J. Dolinina, A. N. Delieva, A. P. Kakjugin, E. O. Bogdanova, O. V. Galkin, V. I. Trofimov
Comparative analysis of inflammatory markers in the material taken from the bronchial tree and the blood serum in patients with chronic obstructive pulmonary disease
We examined 98 patients with COPD of varying severity in the active phase of fading. The levels of IL-8, g-IF, TNF-a in the sputum, bronchial washings and in the serum of the patients were under study. The results obtained confirmed correlation of the cytokine data with cytological composition of the sputum and bronchial washings and with the serum C-reactive protein in accordance with the stage of the disease.
Key words: COPD, inflammation, cytokines.
© О. Н. Титова, Н. А. Кузубова, Е. А. Суркова, 2012 г. УДК 616.24-036.12:616.155.3+611.018.74
О. Н. Титова, Н. А. Кузубова, Е. А. Суркова
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ЭНДОТЕЛИАЛЬНО-ЛЕЙКОЦИ-ТАРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ
НИИ пульмонологии, Научно-методический центр по молекулярной медицине Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
В основе развития патофизиологических изменений при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) лежит формирование хронического воспаления в дыхательных путях, приводящее к деструктивным процессам в легочной паренхиме, ремоделирова-нию легочной ткани и, как следствие, к развитию необратимой бронхиальной обструкции и нарушению газообмена. Табачный дым, другие повреждающие агенты внешней среды индуцируют миграцию полиморфно-ядерных лейкоцитов в очаг воспаления, формируя хроническое воспаление в бронхолегочной системе.
Развивающийся воспалительный процесс характеризуется нарушением регуляции циркуляции лейкоцитов, эндотелиальной дисфункцией и сопровождается инфильтрацией и аккумуляцией иммунных клеток в легочной ткани. Увеличение числа активированных макрофагов, нейтрофилов, СВ8+Т-клеток в легочной паренхиме больных ХОБЛ обусловлено усилением притока лейкоцитов из кровяного русла и является следствием активации процессов адгезии и трансэндоте-лиальной миграции лейкоцитов в окружающие ткани.
Миграция лейкоцитов к месту воспаления включает следующие этапы: адгезию, проникновение через эндотелий, перемещение в направлении очага воспаления под влиянием химических факторов (хемотаксис), трансэпителиальную миграцию.
Адгезия (прилипание) лейкоцитов на эндотелии сосудов состоит из фазы роллинга, активации эндотелия и непосредственно адгезии. Начальная ступень лейкоцитарной адгезии (роллинг) представляет замедление перемещения клеток вдоль стенок кровеносных сосудов, захват лейкоцитов (capture), опосредованное взаимодействием между E-, P-селектинами на поверхности эндотелия и гликопротеиновыми лигандами PSGL1 и a4pi (VLA4) интегринами. P- и E-селектины появляются на активированных эндотелиальных клетках венозных сосудов в разное время. P-селектин начинает действовать на ранних этапах воспаления, он обеспечивает начальную стадию, быстрый роллинг лейкоцитов. Уровень Р-селектина у больных ХОБЛ достоверно превышает его концентрацию у здоровых людей и значительно возрастает в период обострения заболевания [16]. Одним из факторов, активирующих роллинг и адгезию нейтрофилов, является никотин [17]. С молекулами P-селектина связываются оказавшиеся рядом лейкоциты, имеющие на клеточной мембране комплементарные структуры (рецепторы): нейтрофи-лы, моноциты, лимфоциты. Первичное взаимодействие лейкоцитов с селектинами осуществляется через P-селектин гликопротеиновый лиганд-1 (PSGL-1), экспрессируемый на лейкоцитах. Синтез PSGL-1 на лейкоцитах (нейтрофилах, эозинофилах, моноцитах и лимфоцитах) больных ХОБЛ значительно превышает его экспрессию как у здоровых курящих, так и некурящих волонтерах [18].
E-селектин синтезируется в эндотелиальных клетках позднее. Индукция экспрессии E-селектина на поверхности эндотелия осуществляется провоспалитель-ными цитокинами, в частности, TNF-a, IL-1. Высокие концентрации этих цитокинов в крови больных ХОБЛ
