CC BY
21
A.L.Biilantsev, V:V.Yelizarov, V.N.Andrus, A.V.Lipnitsky
Novel Conceptions of the Ecology of Bacterial Populations . j Possessing the Communicative Alarm System
j Volgograd Anti-Plague Research Institute "
Publications describing bacterial populations that possess the communicative alarm system are reviewed. Symbiotic relationships between the agents of particularly dangerous infections and a ubiquitous saprophyte,
Myxococcus xanthus, are also discussed. Social behavior of the microorganisms is considered from the standpoint of novel concepts and in connection with the introduction of the new term, "sociomicrobiology".
Key words: ecology, ecologic system (microbiocenosis), quorum-sensing, sensoring, symbiosis, sociobiology.
- Поступила 17.05.05.
УДК 616.932:576.345
Е.В.Монахова, Р.В.Писанов
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ И КОМПЬЮТЕРНЫХ ДАННЫХ
о свойствах цитотоксического Фактора ыгюсу и гемагглютинин/протеазы
ХОЛЕННЫХ ВИБРИОНОВ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
В обзоре приведен сравнительный анализ литературных данных о свойствах и биологическом действии цитотоксина ИМЮСУ (поп-тетЬгапе-ёагг^т^суКЯохт) и гемагглютинин/протеазы (НА/Р) холерных вибрионов, который вместе с собственными результатами компьютерного изучения продукта гена ЬарА приводит авторов к предположению о том, что оба фактора могут являться одним и тем же белком.
Ключевые слова: УЛпо с1го1егае, ГЧМОСУ, гемагглютинин/протеаза.
В 1996 г. группой индийских исследователей P.K.Saha et al. [32] был впервые описан новый;цито-токсический фактор холерных вибрионов, обозначенный авторами NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin). Вначале он был выявлен у трех ctx'zot” ace"st0-hlyA+-nrraMM0B Vibrio cholerae не01 группы (серогруппы 05, 026 и нетипируемого), выделенных от больных с клиникой холёроподобной диареи (Калькутта, 1989-1991 гг.) Очищенный препарат этого секретируемого токсина представлял ¿обой белок с молекулярной массой (ММ) приблизительно 35 кДа, не имеющий генетического и иммунологического родства с холерным токсином (СТ), термолабильным токсином кишечной палочки ! (LT), гемолизином эльтор (Н1уА) и шигаподобными токсинами I и II, причем этот (один и тот же) белок вызывал накопление жидкости в петлях кишечника кроликов и округление клеток линий СНО, HeLa и Vero, т.е. обладал одновременно энтеротоксической и цитотоксической активностями. Токсин был термолабилен и чувствителен к трипсину.
В дальнейшем авторы сообщили о способности к продукции этого токсина штаммами и других се-рогрупп V. cholerae non OI, вызвавшими крайне тяжелые заболевания людей [35], и о выделении NMDCY из клинического нехолерогенного штамма V. cholerae 01 Инаба (W05) [28]. ММ денатурированной молекулы составляла 35 кДа, а по иммунологическим и биологическим свойствам препарат был идентичен полученному ранее из штамма'не 01 (026) группы.
Генетические детерминанты NMDCY неизвестны, хотя авторы в одной из работ [33] упоминали о проводимых ими попытках их клонирования и сек-венирования, но до настоящего времени результаты этой работы не опубликованы. Однако обращает на
себя внимание тот факт, что 15И-концевая аминокислотная последовательность очищенного токсина оказалась полностью гомологичной N-концу гемагглютинин/протеазы (НА/Р) V. cholerae. Поскольку эти данные опубликованы в 1997 г., когда в Gen-Bank еще не были представлены полные последовательности геномов и продуктов всех генов холерного вибриона, в 2005 г. мы провели дополнительный поиск аминокислотных последовательностей, гомологичных 15N-K0Huy NMDCY, с использованием обновленных баз данных GenBank CDS translations, NCBI, PDB, SwissProt, PIR и PRF. Из всех белков V. cholerae полное совпадение выявлено только с N-концом зрелой формы НА/Р. Кроме того, 14 из 15 аминокислотных остатков совпадали с вероятным N-концом зрелой формы металлопротеазы V. (Lis-tonella) anguillarum (AAL03940), имеющей высокий процент гомологий с НА/Р. Это и другие обстоятельства, о которых будет сказано ниже, навели нас на мысль о том, что NMDCY, описанный как новый самостоятельный цитотоксин, может представлять собой не что иное, как НА/Р холерных вибрионов.
Известно, что НА/Р принято отводить ведущую роль [29, 37] среди целого ряда протеолитиче-ских ферментов, продуцируемых холерными вибрионами [6,43].
НА/Р V. cholerae 01 была впервые описана в 1982 г. R.A.Finkelstein, L.F.Hanne [18] как растворимый гемагглютинин (холерный лектин), выделенный из культуральной жидкости штамма СА401 и представляющий собой термолабильный белок с ММ 32 кДа, обладающий протеолитической активностью и способностью вызывать агглютинацию куриных эритроцитов. Однако оба эти свойства ранее были обнаружены отдельно, и только затем было установлено, что речь идет об одном и том же
белке. В предшествующих работах [15, 20] авторами при изучении гемагглютининов (ГА) V. cholerae наряду с тремя видами связанных с клетками ГА (маннозочувствительный, фукозочувствительный и устойчивый к сахарам) был выявлен растворимый ГА, который не ингибировался никакими сахарами и присутствовал у всех исследованных штаммов независимо от биовара и серовара, а в следующей [17] отмечали, что приоритет открытия этого фактора принадлежит F.M.Bumet, который еще в 1947 г. описал его как муциназу, и полагали, что последняя идентична НА/Р. Кроме того, в 1982 г. и другие авторы [34] выделили из культуральной жидкости того же самого штамма СА401 фактор, охарактеризованный ими как муциназа. 32 кДа форма НА/Р выявлялась с помощью SDS-электро-фореза только после прогревания препарата в растворе SDS, тогда как без нагревания имела большую ММ, а при изоэлектрофокусировании обнаруживалась в виде трех форм с pi 6,3, 5,3 и 4,7. Под электронным микроскопом молекулы выглядели как длинные нити [18]. Возможно, они представляли собой ассоциации нековалетно связанных субъединиц с ММ 32 кДа. По этому поводу авторы высказали предположение, что НА/Р функционирует как леьстин, образуя димеры или мультимеры, либо «заякорена» в бактериальной мембране. Однако в последующих работах этих и других авторов упоминания о лектиновой природе НА/Р отсутствуют, и нами при компьютерном анализе с помощью программы Vector NTI Suit 9 лектиновый домен в ее молекуле не обнаружен.
В дальнейшем из культуральной жидкости Vibrio cholerae non 01 ТН81 была выделена НА/Р, полностью идентичная таковой холерных вибрионов 01 группы [23, 25]. Идентичной обоим белкам оказалась и НА/Р вибрионов 0139 серогруппы [30]. Протеаза V. mimicus также неотличима от НА/Р V. cholerae [13]. T.Honda et al. [24] в опытах по нейтрализации активности НА/Р специфическими антителами подтвердили идентичность НА/Р вибрионов 01 и не01 серогрупп и установили, что за про-теолитическую и гемагглютинирующую активность отвечают разные эпитопы.
На сегодняшний день установлено, что НА/Р представляет собой растворимую цинк-зависимую металлопротеазу (муциназу) [10]. Зрелая форма белка гидрофобна, термолабильна, не является гликопротеином и имеет ММ 32 кДА [18]. Однако согласно данным компьютерного анализа, первичный продукт гена представляет собой белок из 609 аминокислотных остатков с ММ 69,3 кДа, который, вероятно, проходит через несколько этапов процессинга: отщепление сигнального пептида, процессинг оставшегося пропротеина по сайту Ala-196 с образованием N-конца зрелого белка (46,7 кДа) и, наконец, дальнейший протеолитический процессинг С-конца, приводящий к формированию конечного продукта с ММ 32 кДа [22]. Ген hapA, кодирующий синтез НА/Р, имеет два возможных старт-кодона, и оба, вероятно, могут быть использованы при экспрессии. A.Naka et al. [31] сообщают о двух формах НА/Р: 34 и 32 кДа с одинаковыми N-концами, причем вторая образовалась из первой в результате са-
мопроцессинга С-конца. Этот процессинг приводил к повышению протеазной активности и понижению гемагглютинирующей, что указывало на связь последней с С-концом молекулы.
К сожалению, авторы, описавшие NMDCY, не проводили исследований протеолитической и ге-магтлютинирующей активности полученного ими препарата, а в работах о НА/Р практически отсутствуют данные о ее способности вызывать накопление жидкости в изолированных петлях кишечника кролика. Имеется лишь одно сообщение о таком эксперименте, в котором был получен отрицательный результат после введения в петли препарата НА/Р в дозе 50 мкг, а более высокие дозы не были использованы [21]. Что же касается NMDCY, то он вызывал накопление негеморрагической жидкости в дозе не менее 100 мкг [32], поэтому вопрос об энтеротоксичности НА/Р и ее соответствии таковой NMDCY требует дополнительного изучения.
Тем не менее дальнейший анализ литературных данных позволил выделить следующие положения, свидетельствующие в пользу нашего предположения.
1. ММ NMDCY, по представленным данным, составляла 35 кДа [32], НА/Р - 32 и 34 кДа [17, 18, 31]. Некоторое несовпадение ММ могло быть связано с различными условиями электрофореза. Более того, мы определили ММ NMDCY по фотографии, представленной в работе P.K.Saha et al. [32], с помощью программы Quantity One и получили результат 32,4 кДа (рис. 1). Поэтому нам представляется наиболее вероятным, что ММ NMDCY соответствует ММ зрелой формы НА/Р.
2. При изучении динамики продукции NMDCY установлено, что токсин начинал появляться в среде культивирования в поздней логарифмической фазе, а в стационарной его количество продолжало увеличиваться и достигало максимума [32]. В лизатах клеток он не обнаруживался ни на какой стадии роста культуры. С другой стороны, известно, что и экспрессия гена hapA у холерных вибрионов происходит на стадии замедления роста культуры и в стационарной
Рис. 1. Определение ММ NMDCY по фотографии иммуноблота, представленной в работе P.K.Saha et al. [32], с помощью программы Quantity One
фазе, поскольку индуцируется при истощении питательных веществ [9, 36, 37]. В условиях in vitro НА/Р так же, как и NMDCY, является исключительно внеклеточным (секретируемым) белком, и только in vivo отчасти ¡сохраняет связь с клеткой [17].
3. Установлено, что нетоксигенные (СТХ~) штаммы продуцировали больше NMDCY, чем СТХ+ [33]. Это же было показано и для НА/Р: штаммы с делецией коровой области СТХ-элемента продуцировали больше НА/Р, чем их холерогенные предшественники [26]. Поскольку СТ и НА/Р секретируются из клеток посредством одного и того же механизма, не исключено, что элиминация первого косвенно приводит к повышению секреции последней [27].
4. При исследовании в камерах Юссинга
NMDCY увеличивал ток короткого замыкания (Isc) и проводимость ткани кишечника кролика [28]. Аналогичные результаты были получены для НА/Р на модели культуры поляризованных клеток кишечника Т84 и СаСо-2 [27]. ,
Из-за неполноты сведений о свойствах обоих факторов перечисленными пунктами ограничивается их явное сходство. Тем не менее, дальнейший анализ позволяет выявить еще несколько положений, нуждающихся в экспериментальном подтверждении.
В частности, в литературе, как ни странно1, не имеется ни одного сообщения о способности НА/Р вызывать округление клеток СНО, HeLa и Yero. Однако эта способность характерна для множества различных протеаз [4], и вряд ли НА/Р является исключением. Кроме того, показано округление клеток MDSK-I под действием НА/Р [41, 42]! Тем не менее, необходимо получить соответствующие экспериментальные данные.
Ген hapA был обнаружен практически у всех представителей вида V. cholerae и является, очевидно, видоспецифичным [1, 3, 5]. В то же время имеются существенные штаммовые различия в уровнях продукции НА/Р. Так, H.H.Kimsey, M.K.Waldor|[26] с помощью вестерн-блотов показали, что штаммы биовара эльтор, как правило, обладали высокими уровнями экспрессии, тогда как два классических штамма и один штамм 0139 серогруппы (М045) совершенно не экспрессировали ген, а еще ¡два штамма Бенгал экспрессировали его очень слабо. Что касается NMDCY, то с помощью моноклональных антител показано, что к продукции этого фактора в той или иной степени способны только 55,6 % изученных штаммов V. cholerae [33]. При этом среди вибрионов 01 группы оказалось 82,3-100% синтезирующих NMDCY, не 01/не 0139 -49,6-83,8 %, а среди токсигенных штаммов Бенгал -только 26,4 %. Эти данные позволяют думать,!1 что присутствие NMDCY в культуральных жидкостях далеко не всех штаммов холерных вибрионов не противоречит нашему предположению о его ¡возможной идентичности НА/Р, как и обнаружение его у 39,7 % изученных штаммов Aeromonas spp. [33]. Рядом авторов установлена высокая степень сходства зрелой формы НА/Р V. cholerae с протеазой A. punctata (76 %), металлопротеазой A. hydrophila (75 %) [19] и иммунологическое родство с металлопротеазой A. caviae [39]. Нами также обнаружено
74 % сходства и 63 % гомологии с протеазой A. ve-ronii bv. sobria (BAD22597).
Более серьезный аргумент против нашей гипотезы состоит в том, что P.K.Saha, G.B.Nair [33] продукция NMDCY выявлена также у 76 % штаммов V. parahaemolyticus, тогда как T.Honda et al. [24] с помощью моноклональных антител к НА/Р V. cholerae non 01 получили данные, свидетельствующие об отсутствии иммунологического родства между НА/Р холерных вибрионов и протеазой V. parahaemolyticus. Тем не менее, проведенный нами компьютерный анализ позволил обнаружить 67 % сходства и 47 % идентичности НА/Р с предполагаемой металлопротеиназой этого вида (NP_800265).
В этих же экспериментах [33] к продукции NMDCY оказались способны 15,6 % изученных авторами штаммов Shigella spp. Однако, по нашим данным, из 40 представленных в GenBank протео-литических ферментов разных видов шигелл ни одна не обладала выраженным сходством с НА/Р. Вместе с тем, на сегодняшний день геномы всех видов этого рода не расшифрованы полностью и, кроме того, необходимы дальнейшие экспериментальные исследования.
Мы не исключаем, что перекрестные реакции с антителами к НА/Р на самом деле могут быть выявлены у гораздо большего числа протеолитических ферментов самых разнообразных бактерий. В пользу данного предположения свидетельствуют не только экспериментальные данные, но и результаты компьютерного анализа, как опубликованные рядом авторов, так и проведенного нами в рамках настоящей работы.
Гемагглютинин, идентичный НА/Р, был выявлен и у нескольких холерогенных штаммов V. mimi-cus [13]. Очевидно, он активирует продуцируемый этими штаммами СТ посредством того же механизма, что и у V. cholerae.
Кроме вышеупомянутого сходства с протеаза-ми Aeromonas spp., разными авторами показано, что белок НА/Р структурно, функционально и иммунологически сходен с эластазой Pseudomonas aeruginosa, которая также является цинк-зависимой металлопротеазой, причем зрелые белки имеют 70 % гомологии, а их предшественники - только 35 % [21]. Установлена высокая степень гомологии зрелой формы НА/Р V. cholerae таковой нейтральной протеазы V. proteolyticus (91%), металлопротеазам V. anguillarum (88 %) и V. vulnificus (88 %) [19].
Мы провели более подробный сравнительный анализ сходства НА/Р с различными протеазами с помощью программ Blast Search и AlignX. Результаты представлены в таблице, из которой видно, что наиболее высоким уровнем сходства с НА/Р V. cholerae обладают протеазы представителей родов Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, а также ряда отдаленных родов, причем наиболее родственной оказалась НА/Р Helicobacter pilori, описанная в 1994 г. A.W.Smith et al. [38], которые впервые и установили это родство. Однако при сравнении аминокислотных последовательностей с помощью программы AlignX Blocks не только у этих протеаз, но и у намного менее гомологичных выявлен каталитический участок, ответственный за связывание с ионом
Результаты определения сходства зрелой формы НА/Р V. сНо1егае с протеазами других видов бактерий
Вид микроорганизма
Наименование фермента
ID No GenBank
Процент
сходства
идентичн.
Vibrio (Listonella) anguillarum Металлопротеаза AAL03940 81 67
V. fluvialis Металлопротеаза ВАВ86344 80 69
V. vulnificus Zn-металлопротеаза NP_937521 79 66
V. parahaemolyticus Предпол. металлопротеиназа NP_800265 67 47
V. harveyi Протеаза А AAT68711 61 47
Zn-металлопротеаза Рарб ААМ34261 56 41
Vibrio sp. T-1800 Металлопротеаза ВАС87681 78 65
Aeromonas punctata Аминопептидаза ВАА82875 69 55
A. hydrophila Эластаза AAF07184 65 51
A. veronii bv. sobria BAD22597
Pseudomonas aeruginosa Эластаза Las В NP_252413 69 54
" Эластаза Chain А 1EZM 75 62
Pseudomonas sp. A28 Металлопротеаза BAB85124 60 47
Alteromonas sp. 0-7 Металлопротеаза I BAB79615 64 55
Antarctic bacterium 643 Металлопротеаза AAF78076 63 49
Chromobacterium violaceum Металлопротеаза класса 4 AAQ57737 68 53
Helicobacter pylori Г емагглютинин/протеаза (Zn-металлопротеаза) CAA81753 92 92
Legionella pneumophila Г емагглютинин/протеаза (Zn-металлопротеаза) YP 122870 YP_096969 53 39
L longbeachae Металлопротеаза CAA58144 54 40
Bacillus caldolyticus Нейтральная протеаза (термолизин) AAB18652 45 31
B. megaterium-MA Бациллолизин BAD60997 31 22
B. cereus Бациллолизин NP_834706 29 18
B. anthracis str. A2012 Zn-металлопротеаза (эластаза) ZP_003990982 33 22
Bacillus sp. Нейтральная протеаза AAC43402 45 31
Bacillus sp. EAl Термолизин Q59193 38 26
Shewanella amasonensis Пептидаза М4 (термолизин) ZP_00586641 47 38
Shewanella denitrificans Пептидаза М4 (термолизин) ZP_00633347 49 39
Myxococcus xantus Zn-металлопротеаза FibA AAL60237 31 20
металла и субстратом, который имел наибольшее сходство с таковым НА/Р (рис. 2). При этом среди 14 продуктов генов известных и предполагаемых протеаз, выявленных нами на обеих хромосомах V. cholerae, ни один не обладал значительным сходством с НА/Р.
До сих пор не были изучены ультраструктур-ные изменения в эукариотических клетках под действием НА/Р, тогда как для изучения возможного механизма действия NMDCY такие исследования проводились с использованием модели клеточных культур линий Int407 (клетки кишечника) и HeLa. При электронно-микроскопическом исследовании этих культур, обработанных токсином, наблюдалась ретракция клеток, образование пузырей на их поверхности, набухание и просветление матрикса митохондрий и более интенсивное развитие аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума и лизо-сом по сравнению с нормальными клетками. Имму-нофлуоресцентный анализ показал наличие реструктуризации сети микрофиламентов, представленной актином, филамином и винкулином, а также компонентов микротрубочек тубулина и промежуточных филаментов - виментина. Токсин проникал даже в ядро. Более того, повышение внутриклеточного содержания кальция в обработанных NMDCY клетках позволило авторам предположить, что данный каскад событий в конце концов приводит к нарушению жизнедеятельности клеток [7]. Естественно, что для дальнейшего изучения вопроса об идентичности двух факторов необходимо проведение таких же исследований НА/Р. В настоящее время известно лишь то, что НА/Р может, подобно zonula
occludens toxin (Zot), нарушать барьерную функцию эпителия, воздействуя на межклеточные плотные контакты (tj) [41]. Мишенью ее действия, в отличие от Zot [14], является белок окклюдин (компонент tj), который она расщепляет на две части. Данное событие, вероятно, является сигналом для расположенного на внутренней поверхности мембраны белка ZO-1, что нарушает его организацию и структуру F-актинового цитоскелета [42]. Возможно, что этим объясняется выявленное другими авторами [27] повышение проницаемости кишечной ткани, хотя эти группы исследователей работали с разными культурами клеток (соответственно MDSK-I и Т84).
Авторы, описавшие NMDCY, рассматривают его как возможный фактор вирулентности холерных вибрионов. То же самое относится и к НА/Р, хотя имеющиеся в литературе сведения о ее роли в патогенезе противоречивы. Одни исследователи не придают ей особого значения на том основании, что Чей модели кроликов-сосунков штаммы, не способный^ продукции НА/Р, сохраняли вирулентные свойстая [16]; другие называют ее «малоизученным цитотоксином» [41]. Показано, что ЬарА'-мутантные вакцинные штаммы менее реактогенны, чем hapA+ [8]; что моноклональные антитела к НА/Р на этой же модели значительно снижали развитие инфекции при заражении штаммами, продуцирующими НА/Р [40]; что антитела к НА/Р ингибировали адгезию холерных вибрионов к эпителию тонкой кишки кроликов-сосунков [18].
В то время, как непосредственная роль НА/Р в патогенезе требует дальнейшего подтверждения, очевидно ее косвенное влияние как на развитие
süT . -зі'« .ns ¡го гі'ь' m*:" ■'■'«ї» !í''«sí''-''i;sVr^'-ii»5'
ул 7Í3
' i teza
ААГО718І ААП8076 AAL03940 ! ААИЗС61
Г AAQ57737
¡- АА7ШИ
¡ ' SAAB2575
í BAB79615
9AÍ8S12*
виши
BAC8?«8t BA022S97 / CAA58H4 СААВП53 HP.2S21U №.800266 Hf .8317 06 HP_W?S2I VClJtA/P AAP96763
AAB18662 AACÍ3J02 AAL60237 BA060997 Q59I93 YP_096969 YP_I22«0
zp.orósoses
ZP_005866»1
ZPJJ06333G
УйІ.Н«РААР9в763
Рис. 2. Сходные блоки в аминокислотных последовательностях активных центров протеаз различных видов бактерий, имеющих высокий (вверху) и низкий (внизу) процент гомологии с НА/Р холерного вибриона
патологического процесса при холере, так и на жизнеспособность возбудителя. В частности, НА/Р способна активировать СТ за счет протеолитического расщепления его А-субъединицы [11] и цитолизин/гемолизин (Н1уА) вибрионов эльтор, переводя рго-Н1уА (ММ 79 кДа) в зрелую форму (65 кДа) [29], вызывать отлипание вибрионов от клеток культуры кишечной ткани [16]. Как известно, адгезии вибрионов к энтероцитам препятствует слой слизи толщиной примерно 150 мкм, что в 50 ¡раз превышает размеры клеток холерных вибрионов. В связи с этим A.J.Silva et al. [37] ожидали, что НА/Р облегчает проникновение возбудителя сквозь муци-новый слой на начальных стадиях инфекции. Однако результаты изучения механизмов регуляции гена hapA несколько изменили данную гипотезу. Оказалось, что индукция промотора hapA, обычно осуществляемая продуктом гена hapR, в присутствии муцина и желчи при 37 °С происходит независимо от последнего [37]. Суммируя эти и полученные ранее данные, авторы сочли наиболее вероятным, что при низкой концентрации вибрионов и в отсутствие продукции НА/Р сразу после заражения главная роль принадлежит токсин-корегулируемым пилям TCP, которые способствуют аутоагглютинации и образованию микроколоний. Затем, по мере нарастания плотности бактериальных клеток и истощения питательных веществ в слизистой среде, содержащей муцин и желчные соли, синтез НА/Р достигает максимума. На этой стадии деградация муцина
позволяет подвижным вибрионам либо открепляться, либо перемещаться к клеткам-мишеням.
Интересной особенностью НА/Р является ее способность инактивировать СТХф [26]. Механизм инактивации неизвестен, возможно, НА/Р лизирует продукт гена огШ. Авторы полагают, что НА/Р защищает клетку от инфицирования СТХф и таким способом ограничивает возникновение новых патогенных штаммов холерных вибрионов. Однако биологический смысл этого явления неясен.
Некоторые специалисты относят ген ЬарА к генам жизнеобеспечения [2]. В этом отношении определенный интерес представляют работы М.На1-рет ег а1. [12, 19], в которых показана способность НА/Р разрушать кладки яиц двукрылых насекомых рода СЫгопотиз в воде открытых водоемов. Самки обычно откладывают до нескольких тысяч яиц, заключенных в желатиноподобный материал. Иногда они образуют слой толщиной в несколько сантиметров. Ранее было высказано предположение о том, что такие кладки яиц могут служить промежуточным резервуаром холерных вибрионов в природе, т.к. из них был выделен V. сИокгае 09, который, будучи засеян в свежие кладки, разрушил их и использовал в качестве питательного субстрата [12]. Затем из таких кладок были выделены представители других серогрупп холерных вибрионов и доказано, что агентом, ответственным за разрушение желатинового матрикса, является НА/Р, в связи с чем авторы пришли к заключению, что данный фактор
может играть существенную роль в выживаемости возбудителя во внешней среде [19].
К сожалению, проведение сравнительного изучения свойств НА/Р и NMDCY ограничено отсутствием в нашем распоряжении препаратов последнего и штаммов, из которых он был выделен, а исследования зарубежных авторов, представленные всего в 5 опубликованных работах в 1990-х годах [7, 28, 32, 33, 35], до настоящего времени не продолжены. Тем не менее, можно надеяться, что тестирование биологической активности НА/Р на разных моделях, включая воздействие на ультраструктуру клеток и уровень ее экспрессии разными штаммами холерных вибрионов in vitro и in vivo, позволит получить ответ на поставленный здесь вопрос о возможной идентичности обоих факторов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ерошенко Г. А. Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. - Саратов, 2004. - 42 с. - 2. Костромитина Е. А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2004. - 22 с. - 3. Осин A.B., Ерошенко Г.А., Лазовский Ю.В., Смирнова Н.И. // Пробл. особо опасных инф. - 2003. - Вып.85. - С.97-103. - 4. Сальникова О.И., Лобанов В.В., Шиманюк Н.Я. // Микробиол. журн. - 1991. - № 6. - С. 94-99. - 5. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 01 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Саратов, 2002. - 24с. - 6.Челядинова A.B. Изучение биологических свойств холерных вибрионов 0139 серогруппы: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Ростов, 2000. -22 с. - 7. Basu I., Mitra R., Saha P.К. et al. Il FEMS Microbiol. Lett. - 1999. - Vol. 179, N2. - P. 255-263. - 8. Benitez J.A., Garcia L., Silva A. et al. Il Infect. Immun. - 1999. -Vol. 67. - P. 539-545. - 9. Benitez J.A., Silva A.J., Finkeistein R. A. // Infect. Immun. - 2001. - Vol. 69, N 10. - P. 6549-6553. - 10.Booth В.A., Boesman-Finkelstein M., Fin-kelstein R. A. // Infect. Immun. - 1983. - Vol. 45. - P. 558-560. - 11. Booth В.A., Boesman-Finkelstein M., Finkeistein R.A. // Infect. Immun. - 1984. - Vol. 42. - P. 639-644. -
12. Broza M., Halpern M.//Nature - 2001. - N 412. - P. 40. -
13.Dotevall H., Jonson-Strömberg G., Sanyal S., Holmgren J. // FEMS Micribiol. Letters. - 1985. - Vol. 27. -P. 17-22. - 14. Fasano A. // Gut. - 2001. - Vol. 49. - P. 159-162. - 15. Finkeistein R. A.,. Arita J.R., Clements J,D., Nelzon E.T. // Proc. of the 13й1 Joint Conference on Cholera, U.S.-Japan Cooperative Medical Science Program, DHEW Publ. no 78-1590. National Institutes of Health, Bethesda, Md. - 1978. -P. 137-151. - 16. Finkeistein R. A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y., Häse C.C. // Infect. Immun. - 1992. -Vol. 60. - P. 472-478. - 17. Finkeistein R. A., Boesman-Finkelstein M., Holt P. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1983.-Vol. 80. -P. 1092-1095.- 18. Finkeistein R. A., Hanne L.F. // Infect. Immun. - 1982. - Vol. 36, N 3. - P. 1999-
1208. - 19. Halpern M., Gancz H., Broza M., Kashi Y.// Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69, N 7. - P. 4200-4204. -20. Hanne L.R., Finkeistein R. A.//Infect. Immun. - 1982. -Vol. 36, N1. - P. 209-214. - 21. Häse C.C., Finkeistein R. A. // Infect. Immun. - 1990. - Vol. 58. - P. 3311-3317. -22. Häse C.C., Finkeistein R. A. // J. Bacteriol. - 1991. -Vol. 173, N 11. - P. 3331-3317. - 23. Honda T., Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkeistein R. // Infect. Immun.- 1987. - Vol. 55. - P. 451—454. - 24. Honda T., Hata-Naka A., Lertpocasombat K., Miwatani T. II FEMS Microbiol. Lett. - 1991. - Vol. 62, N 2-3. - P. 227-230. - 25. Honda T., Lertpocasombat K., Hata A. et al. II Infect. Immun. -1989. - Vol. 57, N9. - P. 2799-2803. - 26. Kimsey H.H., Waldor M.K. // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66, N11. -P. 4025-4029. - 27. Mel S.F., Fullner K.J., Wimer-Mackin S. et al. II Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, N 11. -P. 6487-6492. - 28. Mitra R., Saha P. K., Basu I. et al. II FEMS Microbiol. Lett. - 1998. - Vol. 169, N 2. - P. 331-333. -29. Nagamune K., Yamamoto K., Naka A. etal.ll Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64, N 11. - P. 4655-4658. - 30. Naka A., Yamamoto K., Albert M.J., Honda T. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1995. - Vol. 11, N2. - P. 87-90. - 31. Naka A., Yamamoto K., Miwatani T., Honda T. // FEMS Microbiol. Lett. - 1992. - Vol. 77, N 1-3. - P. 197-200. - 32. Saha P.K., Koley H., Nair G.B.//Infect. Immun. - 1996.-Vol. 64, N8.-P. 3101-3108.- 33. Saha P.K., Nair G. B.//Infect. Immun. - 1997. - Vol. 65, N2. - P. 801-805. - 34. Schneider D.R., Parker C.D. // J. Infect. Dis. - 1982. - Vol. 145, N4. -P. 474-482. - 35. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. II J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 3. - P. 756-763. -36. Silva A.J., Benitez J.A.//J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186, N19. - P. 6374-6382. - 37. Silva A.J., Pham K., Benitez J.A. // Microbiology. - 2003. - Vol. 1149. - P. 1883-1891. -38. Smith A.W., Charal B., French G.L. // Mol. Microbiol.- 1994. - Vol. 13, N 1. - P. 153-160. - 39.Toma C.A., Icshinose Y.B., Iwanaga M.A. // FEMS Microbiol. Lett. -1999. - Vol. 170. - P. 237-242. - 40. Wikstrom M., Jonsson G., Svennerholm A.M. // APMIS. - 1991. - Vol. 99, N 3. -P. 249-256. - 41. Wu Z., Milton D., Nybon A. et al. II Mi-crob. Pathog. - 1996. - Vol. 21. - P. 11-123. - 42. Wu Z., Ny-bon A., Magnusson K.E.//Cell Microbiol. - 2000. - Vol. 2. -P. 11-17. - 43. Young B.D., Bradbent D. A.//Infect. Immun. - 1982. - Vol. 37, N 3. - P. 875-883.
E.V.Monakhova, R.V.Pisanov
A Comparative Analysis of Literature and Computer-Based Data About the Properties of Cholera Vibrio Cytotoxic Factor, NMDCY, and Hemagglutjnin/Protease
Rostov-on Don Anti-Plague Research Institute
Analysis of literature data about the properties and biological effects of Vibrio cholerae NMDCY cytotoxin (non-membrane-damaging cytotoxin), as compared to hemagglutinin/protease (HA/P), together with the authors' results of the computerized study of the hapA gene product brings them to an inference that these two factors may represent nothing but the same protein.
Key words'. Vibrio cholerae, NMDCY, hemagglutinin/protease.
Поступила 01.12.05.
