CC BY
93УДК 57.085:634.73
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВЫСОТЫ И КОЭФФИЦИЕНТА РАЗМНОЖЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ VACCINIUM CORYMBOSUM L. IN VITRO ПРИ РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ ОСВЕЩЕНИЯ
О.А. КУДРЯШОВА, Т.В. ГЕРАСИМОВИЧ, А.А. ВОЛОТОВИЧ, Т.А. СЕНЬКОВЕЦ
Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь
Введение. Современная биотехнология - это наука и отрасль производства, основу которой составляют ДНК- и клеточные технологии. Клеточные технологии в растениеводстве, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, применяются для создания генетического разнообразия растительного мира (сомаклональная изменчивость, соматическая гибридизация, мутагенез на клеточном уровне, генетическая трансформация растений), в частности, для ускоренного создания новых сортов и видов растений; а также для ускоренного, вегетативного размножения растительных форм с желаемыми признаками, основанного на использовании техники клонального микроразмножения растений in vitro [1-8].
Голубика высокая Vaccinium corymbosum L. - перспективный вид для культивирования в Республике Беларусь, особенно в условиях ее южной агроклиматической зоны [9]. Клональное микроразмножение видов рода Vaccinium является экономически выгодным и рассматривается как один из основных промежуточных этапов современной технологии ускоренного производства качественного посадочного материала [1, 7, 8, 10].
Важнейшим процессом, влияющим на продуктивность растений, является фотосинтез. Воздействие излучения различного спектрального состава и интенсивности фотосинтетически активной радиации (ФАР) на фотосинтез, фотоморфогенез, рост и развитие, другие процессы, определяющие продуктивность растений, достаточно хорошо изучены в 20-м веке [11, 12]. Создание новых источников света для выращивания растений в условиях искусственного освещения осложняется тем, что на фоне различного соотношения синих и зеленых лучей должно быть повышенным содержание красных лучей в спектре ФАР. Эта проблема исчезает с появлением светодиодов. Све-тодиод - это полупроводниковый прибор с электронно-дырочным p-n переходом или контактом «металл-полупроводник», преобразующий электрический ток непосредственно в световое излучение в относительно узкой полосе спектра, ширина которой составляет 20-30 нм [13]. Узкая ширина спектра излучения позволяет использовать светодиоды для формирования светильников со специальным спектром активации фотофизиологических процессов у растений.
В статье приведены результаты испытаний созданного опытного образца светодиодной лампы и сравнительного анализа эффективности использования световых установок с разным типом ламп для стимуляции роста и развития регенерантов разных сортов голубики высокой Vaccinium corymbosum L. in vitro.
Методика и объекты исследования. В качестве объекта исследований использовали регене-ранты двух сортов (Brigitta blue и Bl^jay) голубики высокой Vaccinium corymbosum L., введенные в культуру in vitro и размножаемые микроклонально in vitro с 2009 года на базе сектора микрокло-нального размножения растений ПолесГУ.
В качестве экспланта для формирования регенеранта использовали фрагмент побега, состоящий из двух метамеров. Регенеранты в колбах объемом по 100 мл, содержащими по 20 мл агари-зованной питательной среды для размножения [2], размещали на стеллажах световой установки биотехнологической лаборатории, при освещении либо оригинальными светодиодными лампами (4000 лк) [8], либо люминесцентными лампами OSRAM L36W/76 Natura (6000 лк) при фотопериоде 16/8 ч (свет/темнота) и при температуре 24±10С. Продолжительность эксперимента охватила весенний период с 01 марта по 07 июня 2010 г. Пассаж регенерантов исследуемых сортов и учет количественных признаков проводили через 6 недель культивирования in vitro. Общее количество пассажей регенерантов каждого исследуемого сорта (включая повторности) за указанный период
составило 5. Анализировали изменчивость следующих признаков: «высота регенерантов», «коэффициент размножения/побеги» (как количество развившихся побегов из одного экспланта) и «коэффициент размножения/экспланты» (как количество полноценных эксплантов для последующего размножения, получаемое после черенкования побегов, развившихся у одного регенеранта). Высоту регенерантов измеряли с помощью миллиметровой бумаги.
Количество анализируемых регенерантов сорта Brigitta blue при освещении светодиодными лампами и люминесцентными лампами составило 553 и 502, соответственно; для сорта Bl^jay -165 и 94 соответственно (табл. 1).
Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики [14] с использованием программы статистического анализа данных STATISTICA 6.0 [15]. Дисперсионный анализ данных и расчет доли влияния факторов на изменчивость исследуемых признаков проводили в программе AB-Stat, разработанной в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси.
Результаты и их обсуждение. Результаты биометрического анализа изменчивости признака «высота регенерантов» приведены в таблице 1. Согласно полученным данным, средняя высота регенерантов двух исследуемых сортов голубики высокой, культивируемых in vitro при освещении светодиодными лампами достоверно (при ^<0,01) превышала таковую у регенерантов, культивируемых in vitro при освещении люминесцентными лампами указанного выше типа на 3,5711,40 мм и на 2,93-11,02 мм для сортов Brigitta blue и Bl^jay, соответственно. Максимальная высота регенерантов Brigitta blue при освещении светодиодными лампами достигала 31,00-33,00 мм, в то время как у регенерантов, освещаемых люминесцентными лампами, в четырех случаях из пяти не превышала 17,00 мм (табл. 1). В целом высота регенерантов Brigitta blue для вариантов опыта со светодиодной и люминесцентной подсветкой варьировала в пределах 7,00-33,00 мм и 4,5032,00 мм соответственно.
Таблица 1 - Биометрические показатели изменчивости высоты регенерантов голубики высокой in vitro при освещении разными типами ламп
Сорт Тип лампы Номер колбы Количество анализируемых регенерантов, шт Высота ре-генерантов, см Минимальная высота реге-неранта, см Максимальная высота реге-неранта, см
1 81 1,874±0,027 1,000 2,500
Лампа светодиодная 2 139 1,539±0,039 1,000 3,100
3 157 1,360±0,023 0,700 3,300
4 107 1,623±0,026 1,250 2,300
Brigitta 5 69 1,669±0,042 1,150 3,200
blue 1 130 0,952±0,016 0,700 1,550
OSRAM L 2 72 0,923±0,020 0,700 1,300
36W/76 3 89 0,924±0,020 0,600 1,500
Natura 4 90 1,003±0,037 0,700 3,200
5 121 0,734±0,018 0,450 1,700
1 14 1,186±0,271 0,300 3,200
Лампа светодиодная 2 24 1,292±0,182 0,200 3,200
3 14 0,993±0,231 0,200 3,000
4 79 1,727±0,058 0,850 3,300
Bl^jay 5 34 1,488±0,107 1,000 2,850
1 12 0,625±0,120 0,200 1,500
OSRAM L 2 29 0,962±0,088 0,200 2,100
36W/76 3 27 0,956±0,122 0,100 2,400
Natura 4 4 1,000±0,187 0,500 1,400
5 22 1,195±0,099 0,550 2,000
НСР05 - 0,196 - -
НСР01 - 0,274 - -
«-» - отсутствие данных.
Высота регенерантов приводится как «среднее арифметическое ± стандартная ошибка».
В случае Bl^jay максимальная высота регенерантов при освещении светодиодными лампами в четырех случаях из пяти находилась в пределах 30,00-33,00 мм, в то время как у регенерантов, освещаемых люминесцентными лампами не превышала 24,00 мм (табл. 1). В целом высота регенерантов Bl^jay для вариантов опыта со светодиодной и люминесцентной подсветкой варьировала в пределах 2,00-33,00 мм и 1,00-24,00 мм соответственно.
Результаты анализа изменчивости исследуемых признаков приведены в таблице 2. Согласно полученным данным, высота регенерантов под светодиодной лампой достоверно (при /"<0,01) превышала высоту регенерантов под люминесцентной на 7,06 мм у сорта Brigitta blue и на 3,89 мм у сорта Bl^jay.
Коэффициенты размножения (по количеству формируемых побегов и по количеству полноценных эксплантов соответственно) у регенерантов Bl^jay под светодиодной лампой достоверно (при /<0,05 и при /<0,01) превышали таковые у регенерантов под люминесцентной лампой в 1,94 и 3,54 раз соответственно (табл. 2). Та же тенденция сохранялась у сорта Brigitta blue. В данном случае, несмотря на превышение в 1,13 и 1,31 раз (соответственно указанным коэффициентам размножения) не удалось выявить достоверности превышения по данным признакам у Brigitta blue. Тем не менее, установленные тенденции и закономерности свидетельствуют о возможности за один и тот же промежуток времени при использовании светодиодных ламп производить большее количество качественного материала и существенно сокращать сроки производства in vitro необходимого количества регенерантов для их последующего укоренения и адаптации.
Таблица 2 - Изменчивость количественных признаков (среднее арифметическое ± стандартная ошибка) у регенерантов голубики высокой in vitro при освещении разными типами ламп
Сорт Тип лампы Высота регене-рантов, см Коэффициент размножения /побеги, шт Коэффициент размноже-ния/экспланты, шт
Brigitta blue OSRAM L 36W/76 Natura 0,907±0,046 3,974±0,264 4,526±0,325
Лампа светодиодная 1,613±0,084** 4,498±0,375 5,918±0,533
НСР05 0,196 1,239 1,991
НСР01 0,274 1,738 2,793
Сорт Тип лампы Высота регене-рантов, см Коэффициент размножения/побеги, шт. Коэффициент размноже-ния/экспланты, шт.
Bl^jay OSRAM L 36W/76 Natura 0,948±0,092 1,430±0,125 1,090±0,315
Лампа светодиодная 1,337±0,126** 2,780±1,016* 3,860±1,633*
НСР05 0,196 1,239 1,991
НСР01 0,274 1,738 2,793
* - различия достоверны при /<0,05.
** - при /<0,01.
Для регенерантов сорта Bl^jay был установлен необычный эффект уменьшения количества полноценных эксплантов по отношению к количеству формируемых in vitro побегов при освещении люминесцентными лампами, в то время как при освещении светодиодными лампами соотношение экспланты/побеги по величине было стандартно больше 1 (табл. 3). В целом, отношение экспланты/побеги у регенерантов Bl^jay под люминесцентными лампами по величине варьировало в пределах 0,36-0,82 в четырех случаях из пяти. В работе использовали одинаковые по составу среды для размножения in vitro регенерантов двух разных сортов голубики высокой. Указанный эффект, возможно, связан с разной, определяемой генотипом, отзывчивостью растений того или иного сорта на разные условия освещения. Для того чтобы установить достоверность влияния разных факторов на изменчивость трех анализируемых признаков и подтвердить достоверность
влияния генотипа на изменчивость признаков, был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, результаты которого приведены в таблице 4.
Согласно полученным данным, тип ламп оказывал существенное, высоко достоверное (при /*<0,01) влияние на изменчивость признаков «высота регенерантов» и «коэффициент размноже-ния/экспланты». При этом доля влияния фактора составила 63,5 % и 17,3 % соответственно (табл. 4). Фактор «генотип», как и ожидалось, оказывал существенное, достоверное (при ^<0,01 и при ^<0,05 соответственно) влияние на изменчивость признаков «коэффициент размножения/побеги» и «коэффициент размножения/экспланты». При этом доля влияния фактора составила 42,7 % и 30,2 % соответственно. Необходимо отметить достаточно высокий уровень доли влияния неучтенных факторов (случайные отклонения) на изменчивость анализируемых признаков - 20,5 %, 36,5 % и 40,1 % соответственно признакам «высота регенерантов», «коэффициент размножения/побеги» и «коэффициент размножения/экспланты».
Таблица 3 - Изменчивость коэффициента размножения у регенерантов сорта Bl^jay голубики высокой in vitro при освещении разными типами ламп
Тип лампы Номер колбы Коэффициент размножения/побеги, шт Коэффициент размножения/экспланты, шт Отношение КРэ/КРП
Лампа светодиодная 1* 5,64 8,93 1,58
2* 4,86 6,57 1,35
3 1,24 1,52 1,23
4 1,11 1,17 1,05
5 1,05 1,11 1,06
OSRAM L 36W/76 Natura 1* 1,56 1,28 0,82
2* 1,76 2,24 1,27
3 1,45 0,75 0,52
4 1,00 0,68 0,68
5 1,38 0,50 0,36
* - отмечены колбы, из которых регенеранты для пассажа были взяты 27 апреля. КРП - коэффициент размножения/побеги. КРЭ - коэффициент размножения/экспланты.
Таблица 4 - Двухфакторный дисперсионный анализ изменчивости количественных признаков у регенерантов голубики высокой in vitro при освещении разными типами ламп
Источник варьирования Степень свободы Высота регенерантов Коэффициент размножения/побеги Коэффициент раз-множения/экспланты
Средние квадраты Доля влияния, % Средние квадраты Доля влияния, % Средние квадраты Доля влияния, %
Общее 19 0,124 - 2,796 - 6,571 -
Фактор А (тип лампы) 1 1,500** 63,472 4,390 8,262 21,653* 17,342
Фактор В (генотип) 1 0,069 2,931 22,706** 42,735 37,730* 30,219
АЧВ 1 0,125 5,289 0,853 1,605 2,374 1,901
Повторности 4 0,046 7,856 1,449 10,909 3,258 10,436
Случайные отклонения 12 0,040 20,451 1,616 36,488 4,172 40,102
«-» - отсутствие данных. * - значимо при Р<0,05. ** - при Р<0,01.
В работах отечественных исследователей для регенерантов голубики высокой Vaccinium corymbosum L. и брусники садовой Vaccinium vitis-idaea L. in vitro были установлены эффекты замедления роста, которые носили исключительно сезонный характер [1]. При этом установлено, что наиболее успешным периодом для введения сортов указанных видов в культуру in vitro является промежуток времени со второй половины апреля до конца мая. Продолжительность нашего эксперимента, анализ результатов которого приводится в данной статье, охватывала период с марта по июнь. За указанный период было осуществлено по пять пассажей регенерантов каждого сорта (Brigitta blue и Bl^jay) голубики высокой in vitro под каждым из двух анализируемых типов ламп. Необходимо отметить тот факт, что наиболее высокие значения признаков «коэффициент размножения/побеги» и «коэффициент размножения/экспланты», приведенные в таблице 3, были получены на регенерантах, расчеренкованных 27 апреля. Для того чтобы установить достоверность и долю влияния сезонности проведения эксперимента на изменчивость коэффициентов размножения у регенерантов голубики высокой in vitro, необходимо ввести в дисперсионный анализ соответствующий третий фактор. В нашей работе это не выполнимо, поскольку в фиксированный день содержимое каждой из колб, каждого варианта опыта бралось для пассажа в полном объеме. Тем не менее, результаты исследований подтверждают факт изменчивости анализируемых признаков в зависимости от сезонного времени проведения эксперимента.
Выводы.
При освещении светодиодными лампами высота регенерантов двух исследуемых сортов голубики высокой (Brigitta blue и Bluеjay), культивируемых in vitro, достоверно (при /<0,01) на 3,5711,40 мм и на 2,93-11,02 мм соответственно для каждого из приведенных сортов превышала высоту регенерантов, культивируемых in vitro при освещении люминесцентными лампами OSRAM L36W/76 Natura.
Максимальная высота регенерантов двух исследуемых сортов голубики высокой при освещении светодиодными лампами превышала соответствующие показатели у регенерантов, освещаемых люминесцентными лампами: для регенерантов сорта Brigitta blue - 33,00 мм и 17,00 мм, в соответствии с используемыми для освещения типами ламп; для регенерантов Bl^jay данные показатели составили 33,00 мм и 24,00 мм соответственно.
Анализ изменчивости исследуемых признаков показал, что высота регенерантов под светодиодной лампой достоверно (при Р<0,01) превышала высоту регенерантов под люминесцентной лампой на 7,06 мм у сорта Brigitta blue и на 3,89 мм у сорта Bl^jay. Оба анализируемых коэффициента размножения у регенерантов Bl^jay под светодиодной лампой достоверно (при Р<0,05 и при Р<0,01) в 1,94 и 3,54 раз превышали таковые у регенерантов под люминесцентной лампой.
Для регенерантов сорта Bl^jay установлен эффект уменьшения количества полноценных экс-плантов по отношению к количеству формируемых in vitro побегов при освещении люминесцентными лампами, в то время как при освещении светодиодными лампами соотношение эксплан-ты/побеги по величине было стандартно больше единицы. Данный эффект, вероятно, связан с различной, определяемой генотипом, реакцией растений разных сортов на разные условия освещения.
Двухфакторный дисперсионный анализ установил существенное, высоко достоверное (при Р<0,01) влияние типа ламп на изменчивость признаков «высота регенерантов» и «коэффициент размножения/экспланты», с долей влияния фактора 63,5 % и 17,3 % соответственно; а также существенное, достоверное (при Р<0,01 и при Р<0,05 соответственно) влияние генотипа на изменчивость признаков «коэффициент размножения/побеги» и «коэффициент размножения/экспланты», с долей влияния фактора 42,7 % и 30,2 %, соответственно.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сидорович, Е.А. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений / Е.А. Сидорович, Е.Н. Кутас. - Минск, 1996. - 246 с.
2. Trigiano, R.N. Plant tissue culture concepts and laboratory exercises / R.N. Trigiano, D.J. Gray. - US/MA, CRC Press LLC., 1999 - 2000. - 454 p.
3. Pijut, P.M. Technological advances in temperate hardwood tree improvement including breeding and molecular marker applications / P.M. Pijut, K.E. Woeste, G. Vengadesan, C.H. Michler // In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. - Vol. 43, Issue 4. - 2007. - P. 283 - 303.
4. Merkle, S.A. Hardwood tree biotechnology / S.A. Merkle, C.J. Nairn // In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. - Vol. 41, Issue 5. - 2005. - P. 602 - 619.
5. Maximova, S.N. Field performance of Theobroma cacao L. plants propagated via somatic embryogenesis / S.N. Maximova, A. Young, Sh. Pishak, M.J. Guiltinan // In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. -Vol. 44, Issue 6. - 2008. - P. 487-493.
6. Pereira, M.J. Conservation of Vaccinium cylindraceum Smith (Ericaceae) by micropropagation using seedling nodal explants / M.J. Pereira // In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. - Vol. 42, Issue 1. - 2006. - P. 65 - 68.
7. Вечернина, Н.А. Ускоренное размножение голубики топяной in vitro / Н.А. Вечернина, О.К. Тавартки-ладзе, А.А. Эрст, А.Б. Горбунов // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - Т. 44. -№ 6. - 2008. - С. 21 - 25.
8. Волотович, А.А. Разработка и внедрение инновационной технологии ускоренного производства посадочного материала растений семейств Vacciniaceae и Ericaceae на базе УО «Полесский государственный университет»: материалы IV межд. науч.-практ. конференции «Устойчивое развитие экономики: состояние, проблемы, перспективы», Пинск, 20-22 мая 2010 г. / А.А. Волотович [ и др.] - Пинск, 2010. - Ч. II. - С. 163 -165.
9. Рупасова, Ж.А. Голубика высокорослая: оценка адаптационного потенциала при интродукции в условиях Беларуси / Ж.А. Рупасова [и др.]. - Минск: Белорус. Наука, 2007. - 442 с.
10. Решетников, В.Н. Некоторые аспекты микроклонального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной / В.Н. Решетников [и др.] // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - C. 209 - 216.
11. Тихомиров, А.А. Спектральный состав света и продуктивность растений / А.А. Тихомиров, Г.М. Лисовский, Ф.Я. Сидько. - Нс.: Наука. Сиб. отделение, 1991. - 168 с.
12. Шульгин, И.А. Растение и солнце / И.А. Шульгин. - Л.: Гидрометеоиздат, 1973. - 251 с.
13. Юнович, А.Э. Современное состояние и тенденции развития светодиодов и светодиодного освещения / А.Э. Юнович // Светотехника. - 2007.- № 6. - С. 13-17.
14. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
15. Боровиков, В.П. STATISTICA: Искусство анализа данных на компьютере / В.П. Боровиков. - Спб: Питер, 2001. - 650 с.
COMPARATIVE ANALYSIS OF HEIGHT AND REPRODUCTION FACTOR VARIABILITIES OF VACCINIUM CORYMBOSUM L. SHOOTS IN VITRO UNDER DIFFERENT CONDITIONS OF ILLUMINATION
O.A. KUDRYASHOVA, T. V. GERASIMOVICH, A.A. VOLOTOVICH, T.A. SENKOVETC
Summary
The results of trials of the created pre-production model of a light-emitting diode lamp as well as comparative analysis of efficiency of use of light installations with different type of lamps for growth and development stimulation of shoots of two Vaccinium corymbosum L. varieties in vitro are presented in this article. Authentic (at Р<0.01) influence of used lamps type on variability of traits «shoot height» and «reproduction factor by explants» is established. Essential, authentic (at Р<0.01 and at Р<0.05 accordingly) influence of genotype on variability of traits «reproduction factor by shoots» and «reproduction factor by explants» is also established.
© Кудряшова О.А., Герасимович Т.В., Волотович А.А., Сенковец Т.А.
Поступила в редакцию 5 октября 2010г.
