CC BY
33
УДК 616 - 006.43/442 + 616 - 002.7
Г.А. Ермаков
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ И ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗОМ
Амурская государственная медицинская академия, 675000, ул. Горького, 95, тел.: 8-(4162)-52-68-28, e-mail: agma@amur.ru, г. Благовещенск
Известно, что процессы кроветворения и иммуногенеза находятся в неразрывной связи от момента их возникновения у плода до момента биологической гибели организма. Начальные этапы иммунопоэза протекают в костном мозге.
Исследователи этой области отмечают ряд характерных иммунологических особенностей при онкогематоло-гических заболеваниях у детей. Выявлено, что Т-клетки памяти наименее подвержены лейкозной трансформации. Считается, что популяция Т-клеток памяти наиболее устойчива к действию химиопрепаратов во время полихимиотерапии в сравнении с остальными фракциями CD3+-лимфоцитов [6].
Иммунная система в норме достаточно эффективно защищает организм от инфекций или позволяет минимизировать их последствия и ускорить выздоровление. Вместе с тем, не все результаты иммунного ответа на экзогенных возбудителей полезны для организма, особенно при патологии системы кроветворения. Иммунный ответ часто ведет к невыигрышным для хозяина последствиям или оказывается неэффективным. Некоторые особенности взаимодействия иммунной системы и возбудителей могут способствовать развитию иммунопатологии: аутоиммунным и аллергическим болезням, а также иммуно-дефицитам.
W. Luczynski (2005) отмечено, что во время эпизодов лихорадки и/или инфекции у детей с ОЛЛ, в период индукции ремиссии, отмечается повышение уровня активированных СD3+-лимфоцитов ^4+ HLA DR+, CD8+ HLA DR+), увеличение абсолютных значений Т- хелпе-ров 1 типа (ТЫ) и отсутствие изменений в параметрах Т-хелперов 2 типа (№2) [9].
У основного числа пациентов с ОЛЛ отмечается глубокий дефицит CD4+- и CD8+-лимфоцитов, который не восстанавливается в течение двух лет после завершения терапии [6, 7]. Дифференцировка лимфоцитов в тимусе и количество естественных киллерных лимфоцитов значительно меньше, чем у здоровых детей. Тем не менее, оставшийся Т-клеточный компартмент перенасыщен ан-тиген-обученными клетками, Т-клетками памяти определенного фенотипа и определенной функции. Т-клетки памяти лежат в основе вышеназванной невосприимчивости к инфекции [7].
При ОЛЛ в периферической крови больных значительно чаще обнаруживаются активированные нейтрофи-лы (42,97%), в отличие от больных ОМЛ (10,64%) [33].
Динамика иммунных параметров в различные периоды заболевания и на этапах лечения представляет высокий исследовательский интерес. Функциональные характеристики CD3+-лимфоцитов у детей с ОЛЛ изме-
Резюме
Цель данного исследования — провести сравнительный анализ иммунологического профиля детей с острым лимфобластным лейкозом и лимфогранулематозом.
Ключевые слова: лейкоз, лимфогранулематоз, иммунологические показатели, CD-маркеры.
G.A. Yermakov
IMMUNOLOGICAL ANALYSIS OF CHILDREN WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA AND HODGKIN'S DISEASE
Amur state medical academy, Blagovechensk Summary
The aim of the study was immunological analysis of children with acute lymphoblastic leukemia and Hodgkin's disease.
Key words: leukemia, Hodgkin's disease, immunological analysis, CD-markers.
няются с течением заболевания и определяются уровнем экспрессии молекул костимуляции/активации.
По данным литературы, в момент диагностики ОЛЛ отмечался высокий лейкоцитоз, лимфопения и снижение абсолютных значений субпопуляций лимфоцитов (CD 19+; CD3+; CD4+; CD8+ и CD16+/56+) [8, 10]. Также в этот период отмечался высокий процент СD3+-лимфоцитов, экс-прессирующих ICAM-1. При ОЛЛ возможно развитие как изолированных клеточных или гуморальных нарушений, так и их комбинаций [2, 3].
W. Luczynski (2004) выявлено, что в период индукции ремиссии отмечается высокий уровень СD3+-лимфоци-тов, экспрессирующих на своей поверхности ICAM-1 и CD38+. По окончании индукции ремиссии было повышено относительное количество Т-хелперов с рецепторами к ]Ь-2. Кроме того, данный период характеризовался высоким уровнем №2 и Ш-4 [9]. После индукции ремиссии полностью исчезал лейкоцитоз и наблюдалась редукция абсолютного и относительного числа CD19+, повышение CD3+- и CD8+-лимфоцитов [10]. В период индукции и после индукции ремиссии отмечалось снижение CD38+-лимфоцитов, повышение Т-хелперов с рецепторами к Ш-2 на своей поверхности (IL-2R) и увеличение Т-хелперов, продуцирующих ИФН [9]. Через год после завершения курса химиотерапии у детей с ОЛЛ количество Т- и В-лимфоцитов, МК-клеток, а также пролиферативный ответ на митогены достигал нормальных значений [4, 5, 11]. У детей, имеющих в анамнезе частые инфекции, через
Таблица 1
Клеточные параметры иммунитета детей, страдающих гемобластозами, в зависимости от нозологической формы (ОЛЛ и ЛГМ)
Иммунологические показатели Контроль, n=30 (М±та) Группа ОЛЛ, n=71 (М±та) Группа ЛГМ, n=19
Лейкоциты, 109/л 6,0±0,32 7,90±2,1* 4,6±0,3*
Лимфоциты,% 39,50±1,4 25,3±3,4* 25,49±1,12*
СБ3+-лимфо-циты % 71,0±3,1 68,10±4,1 29,14±1,1*
абс., 109/л 1,70±0,05 2,80±0,09* 1,53±0,03*
ОБ19+-лим-фоциты % 12,50±0,9 15,50±2,1 7,62±1,0*
абс., 109/л 0,40±0,02 0,47±0,07 0,4±0,02
СБ4+-лимфо-циты % 37,0±1,9 36,10±4,1 17,65±1,1*
абс., 109/л 0,90±0,04 1,40±0,3* 0,73±0,03*
ОБ8+-лимфо-циты % 31,0±1,7 23,0±2,1* 10,69±0,9*
абс., 109/л 0,75±0,03 1,12±0,3* 0,62±0,03*
ОВ25+-лимфоцит^1, % 4,0±0,14 3,0±0,4* 3,60±0,4*
СПИ (CD4+/CD8+) 1,25 1,57* 1,17*
Примечания. * — р<0,05 по сравнению с контрольной группой; ОЛЛ
— острый лимфобластный лейкоз; ЛГМ — лимфогранулематоз; СПИ
— субпопуляционный индекс.
год после завершения лечения наблюдалось повышение CD4+- и СD8+-лимфоцитов. Также результаты исследований подтверждали отсутствие иммуносупресии у детей с ОЛЛ, имеющих в анамнезе частые инфекции, через год после лечения.
Целью нашего исследования являлось проведение сравнительной оценки иммунологических параметров детей Амурской области с двумя нозологическими формами: острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и лимфогранулематозом (ЛГМ).
Материалы и методы
Выполнена оценка состояния иммунитета 90 детей с острым лимфобластным лейкозом и лимфогранулематозом в возрасте от 3 до 17 лет, госпитализированных в гематологическое отделение АОДКБ.
Клинико-лабораторные данные детей в возрасте от 3 до 17 лет, отнесенных по результатам профилактического осмотра к условно здоровым, проживающих на территории Амурской области, были расценены как нормативные.
В исследуемую группу включены дети с гемобластоза-ми. Из них с острым лимфобластным лейкозом, В-линейным — 71 ребенок, с лимфогранулематозом (ЛГМ) — 19 чел.
Иммунологические исследования у детей с гемоблас-тозами проводились с учетом этапа лечения:
1 этап — период диагностики заболевания до начала терапии (46 детей);
2 этап — период полихимиотерапии (71 ребенок);
- подгруппа 1 — индукция ремиссии;
- подгруппа 2 — постиндукционные курсы химиотерапии;
3 этап — через 6 мес. после завершения курсов химиотерапии, стадия ремиссии (105 детей).
В 1 группу вошли дети с впервые выявленным гемоб-ластозом. Иммунологическое исследование этой группы проведено в комплексе диагностических мероприятий до начала полихимиотерапии.
Вторая группа включала детей на этапах полихимиотерапии (ПХТ) или комбинированной терапии (ПХТ + лучевая терапия). В нее вошли дети с впервые диагностированным гемобластозом, получающие курсы ПХТ или курсы комбинированной терапии (ПХТ + лучевая терапия), а также дети, бывшие в ремиссии, имеющие в анамнезе рецидив гемобластоза и получившие повторные курсы ПХТ.
Третья группа включала детей, получивших курсы ПХТ, имеющих клинико-гематологическую ремиссию и находящихся на ежегодном обследовании с целью ранней диагностики. Исследования в данной группе проводились через 6 мес. после завершения ПХТ.
Группу сравнения составили дети с диагнозом ОЛЛ, у которых в период пребывания в стационаре не наблюдалось инфекционных осложнений. Критерием исключения детей с ОЛЛ из исследуемой группы и группы сравнения являлось проведение протективного курса ан-тибиотикотерапии препаратами «Ванкомицин», «Ципро-флоксацин», «Вариконазол» и др. Контрольную группу составили условно здоровые дети от 3 до 17 лет (n=30).
Материалом для исследования служили: первичная медицинская документация, истории болезней, стационарные журналы гематологического отделения АОДКБ, амбулаторные карты пациентов, данные годовых отчетов по заболеваемости и смертности детей с гемобластозами в Амурской области, а также опубликованные данные в целом по России.
В качестве биологических материалов исследовали костный мозг, периферическую кровь, сыворотку крови.
Иммунологическое исследование включало определение параметров гемограммы на гемоанализаторе «Pentra-60», субпопуляций CD3+-, CD19+-, CD4+-, CD8+-, CD16+-, СD25+-лимфоцитов методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции. Состояние гуморальных параметров иммунитета определяли, оценивая концентрацию основных классов сывороточных А, М, G методом радиальной иммунодиффузии по G. Manchini и методом ИФА с применением диагностических тест-систем «Ig-ИФА Бест стрип 12x8 (ТМБ)» производства «Вектор-Бест». Исследование концентрации цитокинов в плазме крови (ФНОа и эритропоэтина) проводили методом твердофазного имму-ноферментного анализа с использованием реактивов производства «Biosource». Фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов оценивали в опсонофагоцитар-ной реакции и НСТ-тесте.
Статистический анализ работы выполнен на персональном компьютере с использованием разработанных для этого класса задач статистических программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
Известно, что острый лимфобластный лейкоз является опухолью центрального генеза, в отличие от лимфогранулематоза, субстратом которого являются клетки периферических лимфоузлов.
На диагностическом этапе, при исследовании клеточных параметров иммунитета у детей с ОЛЛ, было выявлено, что абсолютное содержание лейкоцитов достоверно превышало контрольные значения более чем в полтора раза и составило 7,90±2,1х109/л (табл. 1).
При ЛГМ абсолютные значения CD3+-лимфоцитов были существенно снижены и составили 1,53±0,03х109/л.
Таблица 2
Гуморальные параметры иммунитета детей с гемобластозами в зависимости от нозологической формы (ОЛЛ и ЛГМ)
Иммунологические показатели Контроль, п=30 (М±т) ОЛЛ, п=71 (М±т) ЛГМ, п=19 (М±т)
СБ19+-лимфоциты, % 12,50±0,9 15,50±2,1*,** 7,62±1,0*,**
СБ19+-лимфоциты, 109/л 0,40±0,02 0,47±0,07 0,4±0,02
^ А, г/л 0,91±0,03 0,67±0,03 0,73±0,05
^М, г/л 1,25±0,05 0,83±0,05* 1,50±0,1*
^О, г/л 10,22±0,8 10,49±0,6 12,26±1,6***
Примечания. * — р<0,05 — достоверность различий показателей исследуемых групп в сравнении с контролем; ** — р<0,05 — достоверность сравнений групп ОЛЛ и ЛГМ.
В группе детей с ОЛЛ СБ3+-лимфоциты составили 2,8±0,09х109/л, что достоверно выше, чем при ЛГМ. В контрольной группе СБ3+-лимфоциты были самой многочисленной популяцией и составили 71,0±3,1%. У детей с ОЛЛ относительное содержание СБ3+-лимфоцитов было равным 68,10±4,1%. У детей с ЛГМ отмечался относительный дефицит этих клеток (29,14±1,1%) по сравнению с контрольной группой.
СБ4+-лимфоциты в контрольной группе составили 0,9±0,04х109/л (37,0±1,9%). При ОЛЛ абсолютные значения СБ4+-лимфоцитов были достоверно повышены
— 1,4±0,3х109/л, но на фоне лейкоцитоза относительные значения СБ4+-лимфоцитов не отличались от данных контрольной группы (36,1±4,1%).
У детей с ЛГМ был выявлен дефицит СБ4+-лимфоцитов (0,73±0,03х109/л). Относительное содержание СБ4+-лимфоцитов было в два раза ниже значений контрольной группы и составило 17,65±1,1%.
У детей с ОЛЛ СБ8+-лимфоциты были достоверно, в 1,49 раза, выше значений контрольной группы и составили 1,12±0,3х109/л (23,0±2,1%). При ЛГМ СБ8+-лим-фоциты достигали лишь 0,62±0,03х109/л (10,69±0,9%), что было достоверно ниже, чем в контрольной группе,
— 0,75±0,03х109/л (31,0±1,7%).
Соотношение СБ4+ и СБ8+ субпопуляций лимфоцитов определялось как субпопуляционный индекс (СПИ). В группе контроля СПИ составил 1,25. При ОЛЛ этот показатель был достоверно повышен (1,57) за счет значительного увеличения СБ4+-лимфоцитов, а при ЛГМ снижен (1,17) за счет их уменьшения.
Содержание СБ19+-лимфоцитов при ОЛЛ было достоверно выше значений контрольной группы и составило 0,47±0,07х 109/л (15,50±2,1%). У детей с ЛГМ содержание СБ19+-лимфоцитов составило 0,41±0,02х109/л.
Относительное содержание СБ25+-лимфоцитов при ОЛЛ было повышенным — 3,0±0,4% и при ЛГМ — 3,60±0,4%, что достоверно ниже, чем в группе контроля,
— 4,0±0,14%.
При ОЛЛ абсолютные значения СБ16+-лимфоцитов составили 0,32±0,02х 109/л и не имели достоверных отличий от контрольной группы (0,30±0,01х109/л). Абсолютные значения СБ16+-лимфоцитов при ЛГМ были равны 0,75±0,02х 109/л, что в относительных величинах составило 49,02±6,1% и превышало контрольные значения более чем в 4 раза (р<0,05). Такое высокодостоверное увеличе-
Таблица 3
Параметры нейтрофильного фагоцитоза у детей с гемобластозами
Иммунологические показатели Контроль (М±т) ОЛЛ (М±т) ЛГМ (М±т)
СБ16+-лимфоциты - % 12,50±1,3 7,90±1,1* 49,02±6,1*
- абс., 109/л 0,30±0,01 0,32±0,02 0,75±0,02*
ФИ,% 63,50±2,1 36,7±3,6* 28,1±3,9*
ФЧ, м.т. 4,72±0,2 6,1±1,1* 5,43±0,8*
НСТ АСП-базал., % 14,13±1,1 17,4±3,3 23,3±6,93*
НСТ АСТ-стим., % 23,90±2,1 26,5±5,2 29,0±4,1
НСТ АСП/АСТ-рез.возможн. 1,67 1,47 1,21
Примечания. * — р<0,05 по сравнению с контрольной группой условно здоровых детей; ФИ — фагоцитарный индекс; ФЧ — фагоцитарное число.
ние СБ16+-лимфоцитов может являться важным критерием в диагностике лимфогранулематоза у детей.
Таким образом, на фоне лейкоцитоза при ОЛЛ и лейкопении при ЛГМ при обеих формах гемобластоза был выявлен дефицит клеточных параметров иммунитета с максимальной выраженностью при ОЛЛ. Количество СБ19+-лимфоцитов при ОЛЛ в 1,2 раза превышало значения в контрольной группе, а при ЛГМ было снижено в 1,64 раза. СБ16+-лимфоциты при ОЛЛ не имели достоверных отличий от контроля, а при ЛГМ наблюдалось их 4-кратное увеличение.
Проведена оценка гуморальных параметров иммунитета у 71 ребенка с ОЛЛ и 19 детей с ЛГМ, госпитализированных в гематологическое отделение АОДКБ.
При исследовании выявлено, что относительное количество СБ 19+-лимфоцитов достоверно отличалась у детей с ОЛЛ (15,50±2,1%) и ЛГМ (7,62±1,0%) от их содержания в контрольной группе (12,50±0,9%). Характерно, что при ОЛЛ относительное содержание СБ19+-лимфо-цитов было в 2 раза выше, чем при ЛГМ, что сопровождалось отличиями относительного содержания других субпопуляций и перераспределением их при ОЛЛ. Абсолютные значения СБ19+-лимфоцитов не имели достоверных отличий в исследуемых группах по сравнению с контрольной группой.
Концентрация сывороточных иммуноглобулинов и у детей при гемобластозах не имела достоверных отличий по сравнению с данными контрольной группы. Так, концентрация при ОЛЛ составила 0,67±0,03 г/л, а при ЛГМ — 0,73±0,05 г/л, что ниже значений контрольной группы (0,91 ±0,03 г/л) (табл. 2).
Концентрация ]^М, в свою очередь, была ниже значений контрольной группы у детей с ОЛЛ — 0,83±0,05 г/л (р<0,01), но при ЛГМ концентрация 1§М возрастала в среднем в 1,2 раза — 1,50±0,1 г/л. Концентрация не имела достоверных отличий в контрольной группе — 10,22±0,8 г/л и группе детей с ОЛЛ — 10,49±0,6 г/л (р>0,05), однако у детей с ЛГМ отмечалось увеличение концентрации (р>0,05).
Таким образом, гуморальные параметры иммунитета у детей с ОЛЛ и ЛГМ отличались от значений в контрольной группе. При ОЛЛ у детей были достоверно повышены относительные значения лимфоцитов с фенотипом
CD19+, а при ЛГМ на фоне относительного лимфоцитоза наблюдалась относительная СD19+ лимфопения.
Среди факторов врожденного иммунитета макроорганизма оценивались значения CD16+-лимфоцитов, фагоцитарный индекс (60'), фагоцитарное число, спонтанная и стимулированная активность нейтрофилов в НСТ-тесте.
Выявлено, что при ОЛЛ абсолютное содержание СD16+-лимфоцитов (0,32±0,02х109/л) не имело достоверных отличий от данных контрольной группы (0,30±0,01х109/л). Относительные значения СD16+-лимфоцитов были достоверно ниже контрольных и составили 7,90±1,1%. При ЛГМ абсолютное количество СD16+-лимфоцитов более чем в два раза превышало значения контрольной группы (0,75±0,02х109/л), что в относительных величинах составило 49,02±6,1% против 12,5±1,3% в контрольной группе. Таким образом, относительное содержание СD16+-лимфоцитов при ЛГМ более чем в четыре раза превышало значения контрольной группы (табл. 3).
При анализе фагоцитарной активности нейтрофилов отмечалось снижение фагоцитарного индекса (ФИ) при ЛГМ и ОЛЛ по сравнению с контрольной группой, где данный показатель составлял 63,50±2,1%. Были выявлены достоверные различия в показателях фагоцитарного индекса у детей с ОЛЛ и ЛГМ, где ФИ составил 36,7±3,6 и 28,1±3,9% соответственно. Фагоцитарное число (ФЧ) у детей с ОЛЛ составило 6,1±1,1 м.т., у детей с ЛГМ — 5,43±0,8 м.т., что достоверно выше значений контрольной группы (4,72±0,2 м.т.). Это может являться следствием компенсаторной функциональной активации фагоцитов при уменьшении количества фагоцитирующих клеток.
Проведение НСТ-теста позволило выявить тенденцию к повышению спонтанной активности нейтрофилов у детей с ОЛЛ (17,4±3,3%), а также зарегистрировать достоверное ее увеличение у детей с ЛГМ (23,3±6,93%).
Стимулированная активность нейтрофилов также имела тенденцию к увеличению как у детей с ОЛЛ (26,5±5,2%), так и у детей с ЛГМ (29,0±4,1%), по сравнению с данными контрольной группы (23,90±2,1%). Была выявлена тенденция к снижению резервных возможностей нейтрофилов как у детей с ЛГМ (1,47), так и у детей с ОЛЛ (1,21).
Выводы
1. У детей с В-линейным острым лимфобластным лейкозом, независимо от наличия инфекционного осложнения и выраженности нейтропении, достоверно снижено общее количество лейкоцитов, Т-лимфоцитов CD3+, их субпопуляций CD4+, CD8+, а также CD16+-, СD25+-лимфоцитов, активность фагоцитоза в НСТ-тесте
спонтанном и индуцированном; при возникновении инфекционных осложнений характерно увеличение относительного количества СБ19+-лимфоцитов и снижение концентрации сывороточного IgG.
2. Иммунный профиль у детей с ЛГМ отличался лейкоцитозом за счет увеличения числа CD3+, CD4+, CD8+ и СD16+ лимфоцитоза, а также CD19+ лимфопенией.
Литература
1. Павлова М.П. Гематологические болезни у детей.
- Минск, 1996. - 342 с.
2. Урмаева М.М., Митюшкина Т.А., Тимаков А.М. Инфекционные осложнения у детей с гемобластозами // Гематол. и трансфузиол. - 1999. - №1. - С. 73-76.
3. Athens J.W., Ward J.H. Imminological parameters during treatment of ALL // Ibid. - 1999. - Vol. 5. - P. 17921842.
4. Chang J.S. Parental smoking and childhood leukemia // Methods Mol Biol. - 2009. - № 472. - P. 103-137.
5. Cines D.B., Liebman H., Stasi R. Pathobiology of secondary immune thrombocytopenia // Semin Hematol. -2009. - №1. - P. 2-14.
6. Haining W.N., Neuberg D.S., Keczkemethy H.L. et al. Antigen-specific T-cell memory is preserved in children treated for acute lymphoblastic leukemia // Blood. - 2005. -№5. - P. 1749-1754.
7. Horiuchi A. Complications and management of hematopoietic malignancy therapy // Rinsho Ketsueki. - 2003.
- №3. - P.243-250.
8. Koskenvuo M., Milttinen M., Rahiala J. et al. Respiratory viral infections in children with leukemia // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2008. - №11. - P. 974-980.
9. Luczynski W., Stasiak-Barmuta A., Krawczuk-Rybak M. et al. Assessment of selected co-stimulatory, adhesion and activatory molecules and cytokines of Th1 / Th2 balance in acute lymphoblastic leukemia in children // Arch Immunol Ther Exp (Warsz). - 2005. - №4. - P. 357-363.
10. Luczynski W., Stasiak-Barmuta A., Krawczuk-Rybak M. et al. Is cellular immunity not impaired after remission induction in acute lymphoblastic leukemia in children // Pol Merkuriusz Lek. - 2004. - №91. - P. 17-21.
11. Mazur В., Wylezol I., Sonta-Jakimczyk D. Т lymphocyte alpha/beta and gamma/delta in peripheral blood of children with acute lymphoblastic leukemia // Wiad Lek.
- 2002. - №55. - P.282-287.
Координаты для связи с автором: Ермаков Георгий Александрович — канд. мед. наук, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии АГМА, тел.: 8-(4162)-52-69-35.
□□□
