CC BY
96
Силс Е.А.
Институт экологии растений и животных УрО РАН, г Екатеринбург
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОСТРОМОРДОЙ (RANA ARVALIS, NILSSON, 1842) И ОЗЕРНОЙ (RANA RIDIBUNDA, PALLAS, 1771) ЛЯГУШЕК ГОРОДСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ
Проанализированы изменения ряда гематологических показателей периферической крови сеголеток остромордой и озерной лягушек в градиенте урбанизации. Для животных с городской территории отмечено повышение защитной функции крови. Особенности параметров красной крови изучаемых видов бесхвостых амфибий определяются их функциональным состоянием, а также спецификой среды обитания.
Изменение естественных ландшафтов в результате деятельности человека приводит к возникновению особых условий, в которых происходит формирование новых биоценозов. Одним из примеров антропогенных ландшафтов являются городские территории со специфическим растительным и животным населением. Одним из важных компонентов урбанизированных биогеоценозов являются земноводные, нередко они оказываются в данных условиях единственными представителями фауны несинантропных позвоночных животных. При этом видовой состав батрахофауны городской среды и близлежащих естественных местообитаний принципиально не отличается. Вследствие особенностей жизненного цикла со сменой среды обитания, повышенной проницаемости голой кожи земноводные подвергаются более длительному и более интенсивному воздействию негативных факторов окружающей среды [6]. Довольно продолжительная индивидуальная жизнь амфибий (5-8 лет), высокая численность (особенно в нарушенных экосистемах) и привязанность к водным местам обитания делает эту группу животных одним из самых удобных объектов среди позвоночных животных в исследованиях по изучению механизмов адаптации животного населения к постоянно меняющимся условиям окружающей среды, в частности к условиям урбанизированных ландшафтов [2].
Система крови, являясь внутренней средой организма, представляет собой совокупность специализированных клеток, активно участвующих в физиологических функциях организма, чутко реагирующих на внешние раздражители и защищающих его от воздействия негативных факторов окружающей среды [12]. Это, в свою очередь, позволяет оценить не только
физиологическое состояние организма в конкретный период развития, но и его адаптивный потенциал. Поскольку земноводные, в частности представители рода Rana, характеризуются вполне развитой кроветворной и иммунной системами [15, 18], различные параметры этих систем могут отражать любые функциональные изменения, происходящие в процессе жизнедеятельности животного.
В задачи исследования входил анализ некоторых гематологических показателей периферической крови сеголеток двух видов бесхвостых амфибий рода Rana в градиенте урбанизации, а именно: остромордой лягушки (Rana arvalis Nilss., 1842), широко распространенного представителя местной батрахо-фауны, и озерной лягушки (Rana ridibunda Pall., 1771), способной обитать не только в водоемах, загрязненных бытовыми отходами или удобрениями, но и в окрестностях крупных металлургических и химических предприятий, где другие виды земноводных не способны существовать [8].
Материалы и методы
На территории г. Екатеринбурга за период с июля по сентябрь 2000-2007 гг. был проведен отлов сеголеток остромордой и озерной лягушек из популяций, в разной степени подверженных действию урбанизации и загрязнения. Отлов сеголеток производился в первые две недели наземной жизни в непосредственной близости от водоемов, где протекало развитие личинок. В пределах города выделены четыре зоны, к которым приурочены места обитания земноводных:
I зона - в большей мере центральная часть города с многоэтажной застройкой, массивными асфальтовыми покрытиями,
водоемами с сильным промышленным загрязнением и лишенная амфибий;
II зона - районы многоэтажной застройки с пустырями, участками с открытыми почвами, малыми водоемами с высоким уровнем загрязненности;
III зона - малоэтажная застройка, в основном районы, занятые домами частного сектора, пустыри, парки. Нередко биотопы этой зоны примыкают к лесопаркам;
IV зона - лесопарки города; местообитания этой зоны находятся в основном под действием рекреационной нагрузки.
В качестве контрольного для остромордой лягушки был выбран участок в 23 км от г. Екатеринбурга, местообитания озерной лягушки располагаются только на городской территории. Зональная принадлежность местообитания определяется не столько его топографическим положением, сколько степенью суммарной антропогенной трансформированности территории [1]. Приемлемость настоящей типизации была подтверждена гидрохимическими анализами основных нерестовых водоемов по следующим показателям: pH, сульфаты, хлориды, свинец, ПАВ, БПК5, нефтепродукты.
С каждого животного приготавливался мазок периферической крови по общепринятым методикам (окраска по Романовскому -Гимзе) с последующим подсчетом процентного соотношения различных видов лейкоцитов по унифицированному методу морфоло-
гического изучения форменных элементов крови (лейкоцитарная формула). Определение количества эритроцитов и лейкоцитов производилось по стандартному методу в счетной камере Г оряева. Содержание гемоглобина определялось с помощью фотоэлектроколориметра гемиглобинцианидным методом [4]. Всего в ходе работы было исследовано 1188 сеголеток R. arvalis и 270 сеголеток R. ridibunda. Полученные результаты обработаны с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в статистическом пакете Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
Анализ гематологических показателей сеголеток изучаемых видов земноводных выявил ряд различий, обусловленных как видовыми, так и популяционными особенностями. Видовые статистически значимые различия обнаружены по всем рассматриваемым показателям периферической крови сеголеток озерной и остромордой лягушек (табл. 1).
Как видно из таблицы, у R. ridibunda по сравнению с R. arvalis почти в два раза выше процентное содержание общих нейтрофилов за счет палочкоядерных и, главным образом, сегментоядерных форм. Доля малодифференцированных форм нейтрофилов у сеголеток озерной лягушки также выше. Кроме того, для лейкограммы R. ridibunda отмечено достаточно высокое содержание базофилов -
Таблица 1. Межвидовые различия гематологических показателей
Показатель Rana arvalis Rana ridibunda Уpoвень знaчимocти
Нейтрофилы общие, % 14.69±0.24 27.57i0.77 F=437.08, p=0.0000
миелоциты, % 0.74±0.03 1.12i0.08 F=23.47, p=0.0000
юные, % 1.78±0.04 2.65i0.12 F=69.26, p=0.0000
палочкоядерные, % 3.58±0.07 5.18i0.19 F=93.15, p=0.0000
сементоядерные, % 8.60±0.15 18.62i0.56 F=578.35, p=0.0000
Эозинофилы, % 7.02±0.29 5.45i0.38 F=7.09, p=0.008
Базофилы, % 7.83±0.15 14.46i0.50 F=293.34, p=0.0000
Гранулоциты, % 29.54±0.37 47.48i0.77 F=488.74, p=0.0000
Моноциты, % 2.42±0.06 3.85i0.20 F=88.68, p=0.0000
Лимфоциты, % 68.04±0.38 48.70i0.79 F=534.06, p=0.0000
Эритроциты, тыс./мкл 103.83±5.14 177.17i6.48 F=56.95, p=0.0000
Лейкоциты, тыс./мкл 23.12±0.65 36.50i1.30 F=93.00, p=0.0000
Предшественники эритроцитов, тыс./мкл 7.61±0.29 10.42i0.50 F=22.00, p=0.00000
Гемоглобин, г/л 16.61±0.65 56.57i2.10 F=591.28, p=0.0000
Таблица 2. Межзональные различия лейкоцитарной формулы сеголеток озерной и остромордой лягушек, %
Пoкaзaтель 3orn II 3orn III 3oнa IV Koнтpoль
Rana arvalis
Hейтpoфилы oбщие 15.32i0.54 16.40i0.64 13.79i0.39 13.97i0.43
Сегментоядерные 8.95i0.32 10.01i0.40 8.06i0.25 7.86i0.29
Эoзинoфилы 6.3i0.41 6.02i0.51 8.44i0.68 6.87i0.50
Rana ridibunda
Hейтpoфильные миелoциты 1.36i0.14 0.74i0.15 1.05i0.12 -
Эoзинoфилы 7.25i0.65 6.22i1.04 3.37i0.41 -
Гpaнyлoциты 50.45i1.12 46.14i1.96 45.23i1.19 -
Лимфoциты 45.09i1.15 51.22i2.03 51.02i1.17 -
клеток, выделяющих биологически активные вещества [12] и, возможно, участвующих в процессах нейтрализации токсических явлений [13]. Однако необходимо отметить, что информации о цитохимических свойствах и функциональной роли клеток этого типа у амфибий до сих пор очень мало и во многом она является спорной. Вероятно, исходно высокий уровень клеток гранулоцитарного ряда, моноцитов (выполняющих фагоцитарную функцию), общего количества лейкоцитов, эритроидных предшественников, эритроцитов и гемоглобина у озерной лягушки обусловливает высокий адаптивный потенциал особей данного вида и его устойчивость к условиям среды с высокой антропогенной нагрузкой, а также способствует успешному освоению новых местообитаний за пределами естественного ареала.
На основании анализа лейкоцитарной формулы периферической крови сеголеток R. arvalis и R. ridibunda с антропогенно трансформированной территории обнаружены изменения, касающиеся отдельных рядов дифференцировки лейкоцитов (табл. 2). У остромордой лягушки с ростом антропогенной нагрузки увеличивается доля нейтро-фильных гранулоцитов (F = 5.47, p = 0.001), главным образом за счет увеличения доли сегментоядерных форм (F = 8.29, p = 0.0000). Доля малодифференцированных форм ней-трофилов на городской территории также незначительно возрастает по сравнению с контролем. У озерной лягушки с ростом урбанизации достоверно возрастает доля ней-трофильных миелоцитов (F = 4.10, p = 0.0176) и наблюдается тенденция к увеличению ос-
тальных форм нейтрофильных гранулоцитов. Обычно увеличение нейтрофилов наблюдается при различных интоксикациях и в стрессовых состояниях, что, возможно, справедливо и в данном случае. Таким образом, подобную стимуляцию нейтрофильно-го гранулоцитопоэза (без выраженного сдвига влево и лейкоцитоза) можно рассматривать и в качестве адаптационного механизма, повышающего защитную функцию крови. Известно, что нейтрофилы - активные ферментообразователи; они являются главным функциональным элементом клеточного иммунитета, участвуют в фагоцитозе бактерий и продуктов распада тканей и наиболее активно реагируют на изменения физиологического состояния организма [17].
Для сеголеток остромордой лягушки из загородной и лесопарковой популяций отмечено повышение в периферической крови доли эозинофилов по сравнению с городскими популяциями (Б = 4.2118, р = 0.0057). Такая реакция, как правило, вызвана паразитарными инвазиями (чаще всего гельминтозами) [16], которые в большей степени характерны для естественных популяций, нежели городских [5].
У сеголеток озерной лягушки картина противоположная: увеличение эозинофильных лейкоцитов происходит в зоне мало- и многоэтажной застройки (Б = 11.91, р = 0.0000) в два раза относительно наиболее благоприятной лесопарковой зоны. В данном случае стимуляцию эозинофильного гранулоцитопоэза можно рассматривать и как признаки своеобразной защитной (антитоксической и антимикробной) реакции организма, поскольку аналогичные изменения со стороны этих гранулоцитов
у земноводных, населяющих территории с антропогенными загрязнениями различного происхождения были отмечены и другими исследователями [3, 13]. По своим цитохимическим свойствам у холоднокровных позвоночных среди гранулоцитов нейтрофилы и эозинофи-лы являются наиболее функционально активными элементами крови [7].
В лейкограмме сеголеток озерной лягушки из зоны многоэтажной застройки наблюдается достоверное увеличение доли грану-лоцитов (Б = 5.15, р = 0.0064) и уменьшение доли лимфоцитов (Б = 7.30, р = 0.0008) по сравнению с зоной малоэтажной застройки и лесопарками. Изменения общего количества лейкоцитов - показателя, характеризующегося у земноводных вариабельностью в
300
250
200
□ Я. arvalis
□ Я. ridibunda
150
к
я
о
Л
н
к
Л
100
50
III
IV
Рисунок 1. Межзональные различия количества эритроцитов
70
60
50
3 40
ю
I 30
з
20
10
□ К. arvalis
□ К. ridibunda
III
IV
Рисунок 2. Межзональные различия количества гемоглобина
широких приделах, - при этом незначительны (34.10±2.08 тыс./мкл, 40.98±3.50 тыс./мкл и 37.11±1.85 тыс./мкл соответственно) и не отличаются от данных, приведенных в литературе для животных этого вида в естественных условиях обитания [9]. Таким образом, изменения соотношения разных форм лейкоцитов у Я. пйШыийа свидетельствуют о развитии защитных процессов в организме, а выраженность этих изменений в значительной мере зависит от степени антропогенного воздействия. Значительных изменений в лейкоцитарной формуле сеголеток Я. агчаШ с ростом урбанизации (за исключением увеличения нейтрофильных гранулоцитов) не отмечено. Наблюдается тенденция к увеличению общего количества лейкоцитов от 20.33±1.07 тыс./мкл у животных загородной популяции до 23.51±1.12 тыс./мкл у животных зоны многоэтажной застройки. Таким образом, отсутствие выраженных колебаний как в относительных, так и в абсолютных значениях гематологических показателей, вероятно, может быть обусловлено тем, что этот вид амфибий уже адаптирован к специфическим условиям городских экосистем.
На межзональном уровне обнаружены различия и в гематологических параметрах красной крови. У сеголеток остромордой лягушки в градиенте урбанизации происходят разноплановые изменения количества эритроцитов и уровня гемоглобина. Так, в зонах II и
IV содержание эритроцитов увеличивается по сравнению с контролем, а в зоне III, напротив, уменьшается (Б = 5.85, р = 0.0006) (рис. 1). Количество гемоглобина с ростом антропогенной трансформации среды достоверно снижается (Б = 8.33, р = 0.0000) (рис. 2). Однако с ростом урбанизации наблюдается некоторый рост числа эритроидных предшественников с 6.56±0.47 тыс./мкл у животных загородной популяции до 8.15±0.49 тыс./мкл у животных из популяции многоэтажной застройки. Известно, что в условиях резких изменений среды у земноводных отмечается выброс в периферическую кровь незрелых форм эритроцитов, свидетельствующий об активации процессов кроветворения [10].
Возможно, характер изменений изучаемых параметров может быть обусловлен
разной скоростью интенсификации процесса эритропоэза и темпов созревания эритроцитов в период метаморфоза и постметаморфоза, на протекание которых, в свою очередь, влияет специфика средовой компоненты.
У озерной лягушки с ростом урбанизации количество эритроцитов в III зоне увеличивается относительно наиболее благополучной лесопарковой зоны, а в зоне II уменьшается (Б = 22.47, р = 0.0000) (рис. 1). Содержание гемоглобина определено только у сеголеток III и IV зон и также значительно увеличивается с ростом антропогенной нагрузки (Б = 20.79, р = 0.0000) (рис. 2). Количество эритроидных предшественников резко снижается в зоне II относительно зоны III и IV (Б = 5.51, р = 0.0047) и составляет 8.49±0.71 тыс./мкл, 11.74±1.65 тыс./мкл и 11.81±0.67 тыс./мкл соответственно. Не исключено, что угнетение процесса эритропоэза и, как следствие, уменьшение кислородной емкости крови у сеголеток зоны многоэтажной застройки связано с патологическими процессами, нередко наблюдаемыми в печени животных (до 38-45% в выборке) из популяций данного участка, поскольку краевая зона печени на личиночной стадии и в период метаморфоза принимает активное участие в эритро- и гранулоцитопоэзе. Это предположение подтверждает тот факт, что органы кроветворения чувствительны к негативному воздействию токсикантов и аккумулируют некоторые из них (например, тяжелые металлы) [14]. В то же время увеличение кислородной емкости у животных зоны малоэтажной застройки может носить компенсаторный характер в ответ на неблагоприятные кислородные условия водоемов при меньшем повреждающем воздействии средовой компо-
ненты на функциональное состояние развивающегося организма в целом.
В ряде работ, проведенных на половозрелых земноводных, обитающих в зонах промышленного загрязнения (сточные воды хим-предприятия) [11], а также в водоемах с высоким содержанием пестицидов [3], установлена тенденция к повышению содержания гемоглобина и эритроцитов в крови. Таким образом, увеличение кислородной емкости у амфибий в условиях антропогенной нагрузки можно считать адаптивным. Не исключено, что у земноводных городских популяций с возрастом изменения параметров красной крови будут носить аналогичный характер.
В результате проведенных исследований установлены видовые и популяционные особенности изучаемых показателей периферической крови сеголеток Я. агчаШ и Я. п&Ъыпйа из популяций, населяющих территории с различной степенью урбанизации и загрязнения. Исходно высокий уровень клеток миелоид-ного и эритроидного ряда у озерной лягушки обусловливает высокий адаптивный потенциал особей этого вида и его устойчивость к условиям антропогенных ландшафтов, что способствует освоению новых местообитаний за пределами естественного ареала. Для животных с городской территории отмечено развитие иммунных процессов и повышение защитной функции крови. Показанные выше особенности лейкоцитарного профиля и особенно параметров красной крови изучаемых видов бесхвостых амфибий во многом определяются их онтогенетическими особенностями постметаморфического периода, а также спецификой среды обитания, накладывающей отпечаток на физиологическое состояние животных.
Список использованной литературы:
1. Вершинин В.Л. Распределение и видовой состав амфибий городской черты Свердловска // Информационные материалы Института экологии растений и животных. Свердловск, 1980. С. 5-6.
2. Вершинин В.Л. Экологические особенности популяций амфибий урбанизированных территорий / Автореф. ... дис. докт. биол. наук. Екатеринбург, 1997. 47 с.
3. Жукова Т.И., Пескова Т.Ю. Реакция крови бесхвостых амфибий на пестицидное загрязнение // Экология. 1999. № 4. С. 288-292.
4. Кост Е.А. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования. М.: Медицина, 1975. 383 с.
5. Лебединский А.А., Рыжкова Н.А. Гельминтоинвазия как биологический фактор, влияющий на состояние лягушек в условиях антропогенного воздействия // Экология и охрана окружающей среды. Рязань, 1994. С. 95-96.
6. Леонтьева О.А., Семенов Д.В. Земноводные как биоиндикаторы антропогенных изменений среды // Успехи современной биологии. 1997. Т. 117. № 6. С. 726-737.
7. Лобода Е.И. Морфологические и цитохимические особенности клеток белой крови у представителей некоторых видов холоднокровных позвоночных // Вестник зоологии. 1998. Т. 32. № 3. С. 54-57.
8. Мисюра А.Н. Экология фонового вида амфибий центрального степного Приднепровья в условиях промышленного загрязнения водоемов / Автореф. ... дис. канд. биол. наук. М., 1989. 16 с.
9. Романова Е.Б., Романова О.Ю. Особенности лейкоцитарной формулы периферической крови зеленых лягушек в условиях антропогенной нагрузки // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2003. Т. 39. № 4. С. 384-387.
10. Сюзюмова Л.М., Гребенникова С.И. Особенности эритропоэза у личинок бесхвостых амфибий в зависимости от условий развития // Экспериментальная экология низших позвоночных. Свердловск, 1978. С. 32-47.
11. Тарасенко С.Н. Гематологические аспекты адаптаций озерной лягушки к экстремальным условиям промышленного загрязнения среды // Вопросы герпетологии. Л., 1981. С. 129-130.
12. Хамидов Д.Х., Акилов А.Т., Турдыев А.А. Кровь и кроветворение у позвоночных животных. Ташкент: Изд-во «Фан» УзССР, 1978. 168 с.
13. Чернышева Э.В., Старостин В.И. Периферическая кровь лягушек рода Rana как тест-система для оценки загрязнения окружающей среды // Известия РАН. Серия биологическая. 1994. № 4. С. 656-660.
14. Giiesa M.E., Rosenberg C.E., Fink N.E., Salibian A. Serum protein profile and blood cell counts in adult toads Bufo arenarum (Amphibia: Anura: Bufonidae): effects of sublethal lead acetate // Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 2006. V. 50. № 3. P. 384-391.
15. Cooper E.L. Immunity mechanisms // Physiology of the amphibian / Ed Lofts B. Academic Press, Inc, 1976. V. 3. P. 163-272.
16. Elkan E. Pathology in the amphibia // Physiology of the amphibian / Ed B. Lofts. Academic Press, Inc, 1976. V. 3. P. 273-312.
17. Fournier M., Robert J., Salo H.M., Dautremepuits C., Brousseau P. Immunotoxicology of amphibians // Applied herpetology. 2005. № 2. P. 297-309.
18. Manning M.J., Horton J.D. RES structure and function of the Amphibia // The Reticuloendothelial System: a Comprehensive Treatise / Eds Cohen N., Siegel M.M. N.Y.-L.: Plenum Press, 1982. V. 3. P. 393.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ-Урал, проект № 07-04-96107
