CC BY
7DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-30-95-104 УДК 630.165:630.44
Л. В. Можаровская
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИОННОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРОРОСТКОВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В УСЛОВИЯХ
ХОЛОДОВОГО СТРЕССА
Государственное научное учреждение «Институт леса Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 246050, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: milamozh@yandex.by
На основе данных высокопроизводительного секвенирования транскриптомов проростков сосны обыкновенной идентифицированы гены, характеризующиеся индуцированной экспрессионной активностью в условиях холодового стресса: xthl, efla, sams, samdc, aqp, aaa+, crt, bi-1, act, a/b-tub, adf, ss/af иpr-3. Полученные данные могут быть использованы для формирования набора генов-кандидатов для диагностики как физиологического состояния, так и холодоустойчивых генотипов сосны обыкновенной на стадии проростков.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, высокопроизводительное секвенирование, транскриптом, холодовый стресс, гены устойчивости.
Введение
Смена суточных температур или длительное воздействие низких положительных температур негативно сказывается на выход и качество посадочного материала сосны обыкновенной при выращивании в условиях лесных питомников, что связано со снижением общей устойчивости растений [1-3].
Под действием холодового стресса низкоположительных температур у растений отмечается ингибирование биохимических и ферментных реакций, снижается мембранная активность, а в случае отрицательных температур происходит образование ледяных кристаллов, которые вызывают повреждение клеточных мембран [4]. Механизмы защиты растительных клеток от разрушения при холодовом стрессе основываются на физиологических изменениях, приводящих к перестройке в липидном составе клеточных мембран, накопления моно- или олигосахаридов, синтеза метаболитов с антиоксидантными свойствами и др. [5-8]. Индуцируемые холодовым стрессом гены подразделяются на две основные группы [9-11]: непосредственно активируемые холодом COR-гены (от англ. соЫ regulated) и белковые молекулы, участвующие в регуляции передачи сигнала и экспрессии COR-генов, в том числе их факторы транскрипции [12-14]. В литературе описано более 1000 COR-генов, индуци-
руемых холодовым стрессом в том числе белки теплового шока (шапероны), LEA-белки, осмо-тины, антифризные белки, мРНК-связывающие белки, ферменты для биосинтеза осмолитов, белки водных каналов, ферменты детоксикации, ферменты метаболизма жирных кислот, ингибиторы протеиназы, ферритин и др. [12, 13, 15-18].
С использованием инструментов молеку-лярно-генетического анализа, в том числе и транскриптомов, к настоящему времени в литературных источниках представлены результаты исследований о механизмах акклиматизации хвойных древесных растений, а также об изменениях профиля экспрессии генов как к низкоположительным, так и к отрицательным температурам. [19-21].
В предыдущем исследовании нами, на основе анализа относительного уровня прочтения, был установлен перечень EST-локусов превалирующих транскрипционных спектров среди ассемблированных прочтений. В данной работе, на основе анализа транскриптов групп функциональных и структурных полипептидов (CDD) GeneBank NCBI, проведен сравнительный анализ экспрессионной активности генов проростков сосны обыкновенной в условиях холодового стресса, что позволит сформировать набор генов-кандидатов для диагностики холодоустойчивых генотипов.
Материалы и методы
План проведения эксперимента включал в себя посев и выращивание семян сосны обыкновенной (n = 26) в лабораторных условиях при T = 22 °C и фотопериоде 10 ч. На седьмые сутки растения разделяли и выращивали при заданных температурных режимах: для контрольного варианта T = 22 °C, в условиях холодового стресса T = 4 °C, при отсуствии освещенности, в течение 7 суток. Препараты мРНК получали из тканей корня и гипокотиля проростков сосны обыкновенной. Высокопроизводительное секвенирование и анализ транс-криптомов выполняли на базе Ion PGM Torrent (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколам, изложенным в предыдущем исследовании [22]. Нормализацию уровней экспрессии генов исследуемых транскриптомов проводили относительно одного миллиона прочтений — рассчитывали величину RPM (от англ. reads per million, RPM — прочтений на миллион) [23].
Результаты и обсуждение
В результате сборки и обобщения результатов высокопроизводительного секвенирования транс-криптомов, получено 4502 и 28 611 ассемблированных последовательностей (контигов) для исследуемой и контрольной групп соответственно. После проведения аннотации транскриптомов в базе данных консервативных доменов (CDD) GeneBank NCBI установлено 3804 типов функциональных и структурных полипептидов для транскриптома группы проростков сосны обыкновенной, выращенной в условиях холодового стресса и 12445 — для контрольной группы.
В ходе последующего анализа для каждой из групп сеянцев, на основании значений экспрес-сионной активности RPM, было отобрано по 45 EST-локусов, характеризующихся наибольшим уровнем экспрессии в транскриптомах. Полученные данные представлены в таблице 1. Расположение EST-локусов соответствует порядку убывания их экспрессионной активности.
Таблица 1
Перечень EST-локусов функциональных и структурных полипептидов сравниваемых групп проростков сосны обыкновенной с наибольшим уровнем экспрессии относительно одного
миллиона прочтений (ЯРМ)
№ Холодовой стресс Контроль
EST-локус детерминируемый белок RPM EST-локус детерминируемый белок RPM
i xthl XTH1, ксилоглюкана эндо-трансгликозилаза 1 9757,22 cab2 CAB2, хлорофилл a/b-связы-вающий белок фотосистемы II 11042,11
2 aqp AQP, аквапорин 7S36,5i ub UB, убиквитин S626,32
3 efla EF1A, а-субъединица фактора элонгации 1 7606,02 psbc PSBC, белок реакционного центра CP43 фотосистемы II S1S9,47
4 hsp70 HSP70, белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа 7529,i9 aqp AQP, аквапорин 5S47,37
5 act ACT, актин 7452,37 ss/af SS/AF (EAP), белок, ассоциированный с реакциями на солевой стресс и грибную инфекцию 529i,4S
6 hsp90 HSP90, белок теплового шока с молекулярной массой 90 кДа 7375,54 psba/d PSBA/D, субъединицы D1, D2 фотосистемы II 5157,S9
7 ub UB, убиквитин 6376,77 xthl XTH1, ксилоглюкана эндотрансгликозилаза 1 5015,79
S cat CAT, каталаза 6223,11 pr-9 PR-9 (POX), секреторная пероксидаза растительного типа 477S,94
9 dhn DHN, дегидрин 6223,ii rps7 RPS7, рибосомный белок S7 хпДНК 4352,63
Продолжение таблицы 1
№ Холодовой стресс Контроль
EST-локус детерминируемый белок RPM EST-локус детерминируемый белок RPM
10 ss/af SS/AF (EAP), белок, ассоциированный с реакциями на солевой стресс и грибную инфекцию 6223,11 rubiscoss RuBisCOss, малая субъединица рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы 4368,42
11 samdc SAMDC, S-аденозилметионин декарбоксилаза 5531,65 cat CAT, каталаза 4300,00
12 acc ACC, ацетил-CoA-карбоксилаза 4686,54 rps16 RPS16, рибосомный белок S16 хпДНК 3852,63
13 psba PSBA, субъединица D1 фотосистемы II 4609,71 efla EF1A, а-субъединица фактора элонгации 1 3784,21
14 rps16 RPS16, рибосомный белок S16 хпДНК 4532,88 psacre защитный белок Avr9/cf-9 (ACRE) 3715,18
15 aaa+ AAA+, нуклеозидтрифосфатгидролаза 4456,05 ubc UBC, убиквитин-протеинлигаза 3694,74
16 mcp MCP, митохондриальный транспортный белок 4379,23 amp1 AMP1, антимикробный пептид 1 3279,98
17 sams SAMS, S-аденозилметионин синтаза 4379,23 aba/wds ABA/WDS, АБК-индуци-бельный белок водного стресса 3131,58
18 crt CRT, кальретикулин 4225,57 dhn DHN, дегидрин 3115,45
19 a-tub A-TUB,a-субъединица тубулина 4225,57 hsp70 HSP70, белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа 2929,69
20 asn ASN, аспарагин-синтаза 3995,08 psbh PSBH, субъединица H фотосистемы II 2910,53
21 pr-3 PR-3, хитиназа GH19 3687,77 sams SAMS, S-аденозилметионин синтаза 2884,21
22 pr-9 PR-9 (POX), секреторная пе-роксидаза растительного типа 3610,94 cyp CYP, цитохром P450 2842,11
23 tctp TCTP, трансляционно контролируемый опухолевый белок 3073,14 mcp MCP, митохондриальный транспортный белок 2778,95
24 14-3-3 регуляторный 14-3-3 белок 2842,66 psbk PSBK, субъединица K фотосистемы II 2636,84
25 ubc UBC, убиквитин-протеинли-газа 2842,66 tspa-tspf TSPA-TSPF, терпенциклаза 2589,47
26 rps7 RPS7, рибосомный белок S7 хпДНК 2612,17 cesa CESA, целлюлоза-синтаза 2557,89
27 cesa CESA, целлюлоза-синтаза 2458,51 samdc SAMDC, S-аденозилметионин декарбоксилаза 2552,63
28 b-tub B-TUB, в- субъединица тубулина 2458,51 ms MS, метионин синтаза 2442,11
29 rps2 RPS2, рибосомный белок S2 хпДНК 2304,86 pk PK, протеинкиназа 2431,58
30 ampl AMP1, антимикробный пептид 1 2151,20 acc ACC, ацетил-CoA-карбоксилаза 2378,95
Окончание таблицы 1
№ Холодовой стресс Контроль
EST-локус детерминируемый белок RPM EST-локус детерминируемый белок RPM
31 rps12 RPS12, рибосомный белок S12 хпДНК 2074,37 omt OMT, О-метилтрансфераза 2363,16
32 psacre защитный белок Avr9/cf-9 (ACRE) 2010,36 mtl MTL, металлотионеин 2342,11
33 had HAD-подобная гидролаза 1843,88 asn ASN, аспарагинсинтаза 2305,26
34 ms MS, метионин синтаза 1767,06 acol ACO1, 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатоксидаза 1 2268,42
35 rgP RGP, обратимо гликозилируемый полипептид 1690,23 tctp TCTP, трансляционно контролируемый опухолевый белок 2242,11
36 psbc PSBC, белок реакционного центра CP43 фотосистемы II 1459,74 pr-3 PR-3, хитиназа GH19 2197,27
37 clpp CLPP, АТФ-зависимая проте-олитическая субъединица Clp протеазы 1382,91 hsp90 HSP90, белок теплового шока с молекулярной массой 90 кДа 2176,04
38 hmg HMG, белок группы высокой мобильности 1382,91 act ACT, актин 2163,16
39 nadp-mel NADP-ME1, НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа 1382,91 a-tub A-TUB, а-субъединица тубулина 2110,53
40 aba/wds ABA/WDS, АБК-индуци-бельный белок водного стресса 1229,26 hsp40s HSP40S, кошаперон с молекулярной массой 40 кДа белка теплового шока HSP70 2096,42
41 bi-1 BI-1, BAXl-подобный про-апоптотический белок 1229,26 adf ADF, кофилин 2052,63
42 aai-ltss AAI-LTSS, многофункциональный белок с выраженной ингибирующей активностью альфа-амилазы 1229,26 14-3-3 регуляторный белок 14-3-3 2036,84
43 hsp40s HSP40S, кошаперон с молекулярной массой 40 кДа белка теплового шока HSP70 1159,82 elfl ELF1, фактор элонгации транскрипции 1 1968,42
44 drepp DREPP, плазмалемный регу-ляторный белок 1152,43 aai-ltss AAI-LTSS, многофункциональный белок с выраженной ингибирующей активностью альфа-амилазы 1968,42
45 elfl ELF1, фактор элонгации транскрипции 1 1075,59 lrr-rlk LRR-RLK, лейцин-насыщенная рецептор-подобная протеинкиназа 1900,05
Как следует из таблицы 1, в контрольной группе проростков P. sylvestris из общего количества EST-локусов как превалировали, так и характеризовались наибольшим значением RPM, транскрипты генов, детерминирующие биологические процессы, ассоциированные с функционированием
фотосинтетического аппарата клетки (саЬ2, psbC, psbA/D, psbH, psbK), первичного метаболизма, регуляцией роста и развития растений (иЬ, rubiscoss, иЬс, сур, tspa-tspf,mc, pk, тй, omt, тй, adf), а также защитными реакциями на стрессовые воздействия абиотической (aba/wds) и биотической природы,
в том числе и патогенов (pr-9 (pox), psacre, amp1, aai-ltss).
Для транскриптома проростков сосны обыкновенной, выращиваемых в условиях низкоположительных температур, был выявлен ряд отличий в уровне транскрипционной активности генов вовлеченных в процессы первичного метаболизма. Отмечено увеличение долевого участия в транскрипционном профиле генов xth1 и efla. Полученные результаты согласуются с литературными данными, так, в работе Д. Такахаши с соавторами [24] показано, что под воздействием пониженных температур для транскриптома листьев Arabidopsis thaliana на -блюдается повышение экспрессионной активности гена ксилоглюкана эндотрансгликози-лазы (xth), который приводит к качественным изменениям в клеточной стенке и влияет на развитие холодоустойчивости растения. Аналогичные данные относительно увеличения экспресии генов xth проростков красного перца (Capsicum annuum L.) при пониженной температуре (4 °C) отмечены и в другой работе [25]. Таким образом, повышенная экспрессия гена xth способствует укреплению клеточной стенки, секретируя ксилоглюканы, что потенциально является адаптацией к абиотическому стрессу пониженных температур.
Повышение уровеня экспрессии a-субъеди-ницы фактора элонгации 1 (efla) для исследуемого транскриптома проростков сосны обыкновенной в условиях пониженных температур находятся в соответствии с рядом исследований для различных растительных организмов. Так, при изучении холодовой акклиматизации травянистых растений Данном с соавторами было продемонстрировано участие фактора элонгации 1 в молекулярных механизмах адаптации к температурному стрессу [26]. В работе Фу с соавторами также отмечено увеличение транскрипцонной активности генов, детерминирующих факторы элонгации EF, в условиях абиотического стресса и показано участие EF-белков в ответных реакциях растений на воздействие негативных факторов [27].
В условиях низкоположительных температур для проростков сосны обыкновенной нами было отмечено повышение уровня транскрипции генов sams и samdc, детерминирующих процессы биосинтеза этилена (гормональная регуляция) и высших полиаминов (антиокси-
дантная система) соответственно. Аналогичные результаты были получены при изучении трансформации транскриптомных профилей различных растений в условиях абиотического и биотического стресса, что подтверждает регуляторную и защитную функции sams и samdc в ходе формирования адаптационных реакций [28, 29].
Увеличение долевого участия транскриптов в профиле выявлено и для гена aqp, детерминирующего аквапорин — мембранный белок, входящий в систему регуляции водного обмена клетки. Согласно литературным данным, аквапорины принимают непосредственное участие в формировании защитных реакций растений по отношению к различным типам абиотического стресса, в том числе и условиям холодового шока [30].
В условиях холодового стресса отмечена повышенная экспрессия EST-локусов aaa+, crt, bi-1, что согласуется с литературными данными об их участии в защитном ответе растений на низкоположительные и отрицательные температуры. Так, белки семейства AAA+ нуклеозидтрифосфатгидролаза являются шапероноподобными АТФазами и в исследовании холодоустойчивости ели сибирской Т. Челлсена с соавторами показано участие данных белков в акклиматизации к пониженным температурам [31]. Кальретикулин является Ca2+ -связывающим высококонсервативным белком эндоплазматического ретикулюма и играет важную роль во множестве клеточных процессов, в том числе кальций-опосредованном сигналинге и подобно молекулярному ша-перону участвует в сворачивании белков [32]. Согласно приведенным в литературе данным, CRT для растений является важным сигнальным компонентом для ответа на биотический и абиотический стресс, в том числе холодовой, что подтверждает индуцированную холодом экспрессионную активность кальретикулина в нашей работе [33-35]. Для супрессора запрограммированной клеточной гибели (PCD) BAX1-подобного проапоптотического белка (BI-1) в литературе описана повышенная экспрессия при холодовом стрессе, при которой BI-1, предположительно, способствует синтезу теплоизоляционных сфинголипидов тканей растений, а также участвует в сдерживании PCD [36-38].
Также в случае холодового стресса наблюдается повышение активности генов, кодирующих белки, участвующие в формировании цитоскелета растительных клеток: актина (ACT), формирующего микрофиламенты; тубулинов (A-TUB, B-TUB) — структурных компонентов микротрубочек цитоскелета; ак-тин-деполимеризующего фактора (ADF) — ко-филина. Повышение экспресионной активности структурных элементов цитоскелета клеток растений в условиях холодового шока отмечено и в литературных данных [39-41]. Предположительно, индуцирование генов act, a/b-tub, adf во время воздействия холодового стресса объясняется необходимостью перестройки ци-тоскелета во время акклиматизации.
Как следует из таблицы 1, различия в уровне транскрипционной активности также установлено между сравниваемыми группами проростков и по другим генам, кодирующим стресс-ассоциированные белки: деги-дрин и шапероны семейств Hsp70 и Hsp90. Согласно литературным данным, дегидри-ны не только представляют собой один из молекулярных факторов, обеспечивающих поддержание водного баланса клетки, но и определяют функционирование сигнальной системы растения, участвуя в регулировании биосинтеза абсцизовой кислоты (АБК) [31]. Основной ролью белков-шаперонов является осуществление фолдинга и стабилизации третичной структуры белковых молекул, что имеет существенное значение в случаях повреждений или денатурации белков, вызванных воздействием различных стрессовых факторов [42, 43].
Проведенное сравнительное изучение степени транскрипционной активности генов, относящихся к системе конститутивной устойчивости растений к фитопатогенным микроорганизмам, показало, что в условиях холодового стресса происходит снижение долевого участия мРНК генов, детерминирующих белки с антимикробным действием: pr-9, ampl, psacre, lrr-rlk, а для защитных ss/ af и pr-3 EST-локусов отмечается увеличение экспрессионной активности. Для белков PR-3 (хитиназ IV класса) проростков сосны обыкновенной ранее описывались антифриз-ные свойства и повышенная экспрессионная активность под воздействием холодового стресса [21].
Кроме EST-локусов, представленных в таблице 1, в исследуемых транскриптомах проростков сосны обыкновенной был идентифицирован дополнительный набор локусов, ассоциированных, согласно генной онтологии, с защитными механизмами растений по отношению к фитопатогенным микроорганизмам: pr-12, pr-10, cam, gst и grp. Результаты сравнительной оценки уровня транскрипционной активности по данным генам между исследованными группами сеянцев представлены в таблице 2.
Как следует из таблиц 1 и 2, экспресси-онная активность большинства защитных генов в транскриптоме проростков сосны обыкновенной, подверженных низкоположительным температурам, была значительно снижена по сравнению с контрольной группой. В то же время для гена, кодирующего PR-10-белок, наблюдалась сходная экспрес-
EST-локус Детерминируемый белок RPM
Холодовой стресс Контрольная группа
pr-12 PR-12, дефензин - 1767,37
pr-10 PR-10 927,86 1098,63
cam CAM, кальмодулин 921,94 1369,31
gst GST, глутатион^-трансфераза подсемейства класса Tau 154,64 1040,25
gyp GRP, глицин-насыщенные РНК-связывающие белки 154,64 520,13
Таблица 2
Значения уровня экспрессии EST-локусов, ассоциированных с защитными свойствами к фитопатогенным микроорганизмам исследуемых транскриптомов относительно одного
миллиона прочтений (ЯРМ)
сионная активность. В литературе описан индуцибильный характер экспресси генов pr-10 под воздействием негативных как биотических, так и абиотических факторов, в том числе и холода. Однако в исследовании Дж. Лю с соавторами было продемонстрировано незначительное повышение уровня экспрессии гена pr-10 сеянцев Pinus montícola, подверженных низкоположительным температурам (5 °C). Таким образом, полученные нами результаты согласуются с проведенными ранее исследованиями [44].
Исходя из полученных данных, одна из особенностей сравниваемых транскрип-томных профилей — разнонаправленный характер изменений активности для генов, представляющих один и тот же метаболический цикл или физиологический процесс, в том числе используемых в литературе как гены нормализаторы для видов рода Pinus: актин, а-тубулин, а-субъединица фактора элонгации 1, убиквитин [45, 46]. Таким образом, для выражения нормализации экспрессии генов при проведении количественной ПЦР проростков сосны обыкновенной, выращенных в различающихся условиях, необходимо использовать среднее геометрическое значение экспрессий комбинаций генов-нормализаторов.
Заключение
Согласно полученным результатам, установлено, что под воздействием холодового стресса происходят существенные изменения экспрессионной активности различных генов, в том числе ассоциированных с устойчивостью растений к фитопатогенным микроорганизмам. Полученные данные подтверждают то, что холодовой стресс является одним из факторов ослабления растительных организмов и может способствовать развитию болезней всходов сосны обыкновенной инфекционной природы.
Гены xth1, efla, sams, samdc, aqp, aaa+, crt, bi-1, act, a/b-tub, adf, ss/af и pr-3, характеризующиеся повышенной экспрессией индуцированной холодовым стрессом, могут быть использованы как маркеры физиологического состояния, так и для диагностики холодоустойчивых генотипов проростков сосны обыкновенной.
Список использованных источников
1. Воробьева, М. В. Лесная фитопатология. Лесная фитопатология : метод. указания / М. В. Воробьева. - Урал. гос. лесотехн. унт. - Екатеринбург : УГЛТУ, 2015. - C. 11.
2. Федоров, Н. И. Лесная фитопатология: Учеб. для студентов специальности «Лесное хозяйство» / Н. И. Федоров - Мн.: БГТУ, 2004. - C. 197.
3. Семенкова, И. Г., Соколова, Э. С. Фитопатология: учеб. для студ. вузов / И. Г. Семенкова, Э. С. Соколова - М.: Изд. центр «Академия, 2003. - C. 203.
4. Chinnusamy, V. Cold stress regulation of gene expression in plants / V. Chinnusamy, J. Zhu, J. K. Zhu // Trends in plant science. -2007. - Vol. 12, № 10. - P. 444-451.
5. Steponkus, P. L. A contrast of the cryostability of the plasma membrane of winter rye and spring oat-two species that widely differ in their freezing tolerance and plasma membrane lipid composition / P. L. Steponkus // Advances in low temperature biology. - 1993. - Vol. 3. - P. 211-312.
6. Strauss, G., Hauser H. Stabilization of lipid bilayer vesicles by sucrose during freezing / G. Strauss, H. Hauser // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1986. - Vol. 83, № 8. - P. 2422-2426.
7. Anchordoguy, T. J. Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospho-lipids during freezing. Cryobiology / T. J. Anchordoguy [et. al.]. - 1987. - Vol. 24, № 4. -P. 324-331.
8. Aroca, R. Drought enhances maize chilling tolerance. II. Photosynthetic traits and protective mechanisms against oxidative stress / R. Aroca, J. J. Irigoyen, M. Sánchez-Díaz // Physiologia Plantarum. - 2003. - Vol. 117, №
4. - P. 540-549.
9. Fowler, S. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway /
5. Fowler, M. F. Thomashow // The Plant Cell. -2002. - Vol. 14, № 8. - P. 1675-1690.
10. Kreps, J. A. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress / Kreps [et al.] // Plant physiology. -2002. - Vol. 130, № 4. - P. 2129-2141.
11. Seki, M. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought,
cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray / Seki [et al.] // The Plant Journa. - 2002. - V. 31, № 3. - P. 279-292.
12. Park, S. Regulation of the Arabidopsis CBF regulon by a complex low-temperature regulatory network / S. Park [et al.] // The Plant Journal. - 2015. - Vol. 82, № 2. - P. 193-207.
13. Lee, B. The Arabidopsis cold-responsive transcriptome and its regulation by ICE1 // The Plant Cell. - 2005. - Vol. 17, № 11. -P. 3155-3175.
14. Seki, M. Molecular responses to drought, salinity and frost: common and different paths for plant protection / M. Seki [et al.] // Current opinion in biotechnology. -2003. - Vol. 14, № 2. - P. 194-199.
15. Hong-Bo, S. LEA proteins in higher plants: structure, function, gene expression and regulation / S. Hong-Bo, L. Zong-Suo, S. Ming-An // Colloids and surfaces B: Biointerfaces. - 2005. -Vol. 45, № 3-4. - P. 131-135.
16. Guy, C. L. The organization and evolution of the spinach stress 70 molecular chaperone gene family / C. L. Guy, Q. B. Li // The Plant Cell. - 1998. - Vol. 10, № 4. - P. 539-556.
17. Kosova, K. The role of dehydrins in plant response to cold / K. Kosova, P.Vitamvas, I. T. Prasil //Biologia plantarum. - 2007. - Vol. 51, № 4. - P. 601-617.
18. Falavigna, V. D. S. Functional diversification of the dehydrin gene family in apple and its contribution to cold acclimation during dormancy / V. D. S. Falavigna [et al.] // Phys-iologia plantarum. - 2015. - Vol. 155, № 3. -P. 315-329.
19. Gusta, L. V. Plant cold hardiness: from the laboratory to the field / L. V. Gusta, M. Wis-niewski, K. K. Tanino // CABI, Oxfordshire, UK. - 2009. - 317 p.
20. Strimbeck, G. R. Cold in the common garden: comparative low-temperature tolerance of boreal and temperate conifer foliage / G. R. Strimbeck [et al.] // Trees Struct Funct. -
2005. - Vol. 21. - P. 557-567.
21. Joosen, R. V. L. Correlating gene expression to physiological parameters and environmental conditions during cold acclimation of Pinus sylvestris, identification of molecular markers using cDNA microarrays Correlating / R. V. L. Joosen [et al.] // Tree Physiology. -
2006. - Vol. 26, № 10. - P. 1297-1313.
22. Можаровская, Л. В. Функциональная аннотация генов Pinus sylvestris, ассоциированных с устойчивостью к фитопатогенным микромицетам / Л. В. Можаровская // Журнал Белорусского государственного университета. - Биология. - 2018. - № 2. - С. 78 -84.
23. Aanes, H. Normalization of RNA-se-quencing data from samples with varying mRNA levels / H. Aanes [et al.] // PloS one. - 2014. -Vol. 9, № 2. - P. e89158
24. Takahashi, D. Both cold and sub-zero acclimation induce cell wall modification and changes in the extracellular proteome in Arabidopsis thaliana / D. Takahashi // Scientific reports. - 2019. - Vol. 9, № 1. - P. 1-15
25. Cho, S. K. Constitutive expression of abiotic stress-inducible hot pepper CaXTH3, which encodes a xyloglucan endotransglucosyl-ase/hydrolase homolog, improves drought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis plants / S. K. Cho [et al.] // FEBS letters. - 2006. - Vol. 580, № 13. - P. 3136-3144.
26. Dunn, M. A. A low-temperature-responsive translation elongation factor 1а from barley (Hordeum vulgare L.) / M. A. Dunn [et al.] // Plant molecular biology. - Vol. 23, № 1. -1993. - P. 221-225.
27. Fu, J. Roles of protein synthesis elongation factor EF-Tu in heat tolerance in plants / J. Fu, I. Momcilovic, P. V. Prasad //Journal of Botany. - Vol. 2012. - 2012. - P. 1-8.
28. Kazan, K. Diverse roles of jasmonates and ethylene in abiotic stress tolerance / K. Kazan // Trends in plant science. - Vol. 20, № 4. - 2015. -P. 219-229.
29. Hu, W. W. The pivotal roles of the plant S-adenosylmethionine decarboxylase 5' untranslated leader sequence in regulation of gene expression at the transcriptional and posttranscrip-tional levels / W. W. Hu, H. Gong, E. C. Pua // Plant physiology. - Vol. 138, № 1. - 2005. -P. 276-286.
30. Wang, M. The Interactions of Aquapo-rins and Mineral Nutrients in Higher Plants / M. Wang [et al.] // International journal of molecular sciences. - Vol. 17, № 8. - 2016. -P. 1229.
31. Kjellsen, T. D. Proteomics of extreme freezing tolerance in Siberian spruce (Picea obo-vata) / T. D. Kjellsen [et al.] // Journal of proteomics. - 2010. - Vol. 73, № 5. - P. 965-975.
32. Jia, X. Y. Calreticulin: conserved protein and diverse functions in plants / X. Y. Jia [et al.] // Physiologia Plantarum. - 2009. - Vol. 136, № 2. - P. 127-138.
33. Joshi, R., Paul, M., Kumar, A., & Pan-dey, D. (2019. Role of calreticulin in biotic and abiotic stress signalling and tolerance mechanisms in plants. Gene, 714, 144004.
34. Komatsu, S. Over-expression of calcium-dependent protein kinase 13 and calreticulin interacting protein 1 confers cold tolerance on rice plants / S. Komatsu [et al.] // Molecular Genetics and Genomics. - 2007. - Vol., 277, № 6. - P. 713-723.
35. Qiu, Y., Xi, J., Du, L., & Poovaiah, B. W. (2012). The function of calreticulin in plant immunity: new discoveries for an old protein / Y. Qiu, J. Xi, L. Du, B. W. Poovaiah // Plant signaling & behavior. - 2012. - Vol. 7, № 8. - P. 907910.
36. Nagano, M. Arabidopsis Bax inhibitor-1 promotes sphingolipid synthesis during cold stress by interacting with ceramide-modifying enzymes / M. Nagano [et al.] // Planta. - 2014. -Vol. 240, № 1. - P. 77-89.
37. Ihara-Ohori, Y. (2007). Cell death suppressor Arabidopsis bax inhibitor-1 is associated with calmodulin binding and ion homeostasis / Y. Ihara-Ohori [et al.] //. Plant physiology. -2007. - Vol. 143, № 2. - P. 650-660.
38. Chen, X. H. Cucumber BAX inhibitor-1, a conserved cell death suppressor and a negative programmed cell death regulator under cold stress / X. H. Chen [et al.] // Biologia plantarum. - Vol. 57, № 4. - P. 684-690.
39. Ouellet, F. Regulation of a wheat actin-depolymerizing factor during cold acclimation /
F. Ouellet [et al.] // Plant Physiology. - 2001. -Vol. 125, № 1. - P. 360-368.
40. Orvar, B. L. Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity / B. L. Orvar [et al.]. - 2000. -The Plant Journal. - Vol. 23, № 6. - P. 785-794.
41. Ridha Farajalla, M. The a-tubulin gene family in wheat (Triticum aestivum L.) and differential gene expression during cold acclimation / M. Ridha Farajalla, P. Gulick // Genome. -2007. - Vol. 50, 5. - P. 502-510.
42. Renaut, J. Biochemical and physiological mechanisms related to cold acclimation and enhanced freezing tolerance in poplar plant-lets / J. Renaut, L. Hoffmann, J. F. Hausman // Physiologia Plantarum. - Vol. 125, 1. - 2005. -P. 82-94.
43. Breiman, A. Plant Hsp90 and its co-chaper-ones / A. Breiman // Current Protein and Peptide Science. - Vol. 15, № 3. - 2014. - P. 232-244.
44. Liu, J. J. Differential expression of multiple PR10 proteins in western white pine following wounding, fungal infection and cold-hardening / J. J. Liu, A. K. Ekramoddoullah, X. Yu // Physiologia Plantarum. - 2003. - Vol. 119, № 4. - P. 544-553.
45. Zhu, P. Selection of suitable reference genes in Pinus massoniana Lamb. under different abiotic stresses for qPCR normalization / P. Zhu [et al.] // Forests. - 2019. - Vol. 10, № 8. - P. 632.
46. De Vega-Bartol, J. J. Normalizing gene expression by quantitative PCR during somatic embryogenesis in two representative conifer species: Pinus pinaster and Picea abies / J. J. de Ve-ga-Bartol // Plant cell reports. - 2013. - Vol. 32, № 5. - P. 715-729.
L. V. Mozharovskaya
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE EXPRESSION ACTIVITY OF SCOTS PINE SEEDLING GENES IN COLD STRESS CONDITIONS
State Scientific Institution "Institute of Forest of the National Academy of Sciences of Belarus" 71 Proletarskaya St., 246050 Gomel, Republic of Belarus e-mail: milamozh@yandex.by
Based on the data of next generation sequencing of transcriptomes of Scots pine seedlings, the genes characterized by induced expression activity under cold stress conditions were identified: xthl, efla, sams, samdc, aqp, aaa+, crt, bi-1, act, a/b-tub, adf, ss/af andpr-3. The data obtained can be used to form a set of candidate genes for diagnosing both the physiological state and cold-tolerant genotypes of Scots pine at the seedling stage.
Keywords: Scots pine, next-generation sequencing, transcriptome, cold stress, resistance genes.
Дата поступления статьи: 22 февраля 2021 г.
