CC BY
53УДК 57.085:634.73
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТОВ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ ОСВЕЩЕНИЯ НА ИЗМЕНЧИВОСТЬ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ У РЕГЕНЕРАНТОВ СОРТОВОЙ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ VACCINIUM CORYMBOSUM L. IN VITRO
A.A. ВОЛОТОВИЧ, O.A. КУДРЯШОВА, A.C. КОХНЮК, Л. С. ЦВИРКО
Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь
Введение. Голубика высокая (Vaccinium corymbosum L.) - перспективный вид для промышленного культивирования в условиях Республики Беларусь, особенно в южной агроклиматической зоне страны [1].
Процесс клонального микроразмножения растений in vitro начинается с этапа введения растений в культуру in vitro путем изолирования и стерилизации первичного экспланта с последующим его размещением на стерильной, питательной среде для инициации побегообразования in vitro [2].
Основным источником энергии для фотосинтетической и биопродукционной активности высших растений является световая энергия естественного (Солнце), либо искусственных источников освещения. Для физиологических процессов в организме растений наибольшее значение имеет коротковолновая радиация, диапазон которой условно подразделяется на ультрафиолетовую ("/. = 0,3 - 0,4 мкм), видимую (/. = 0,40 - 0,75 мкм) и близкую инфракрасную (А,бикр1 = 0,75 - 1,20 мкм; ^бикр2 = 1,20 - 4,00 мкм) области [3].
Область физиологической радиации, поглощаемой пигментами листьев зеленых растений, находится в диапазоне 0,35 - 0,75 мкм и составляет более половины всего излучения Солнца. В пределах физиологической радиации выделяется область фотосинтетически активной радиации (0,38 - 0,71 мкм), имеющая два основных максимума поглощения пигментами листьев зеленых растений в областях 650-670 и 430-480 нм. Воздействие излучения различного спектрального состава и интенсивности фотосинтетически активной радиации (ФАР) на фотосинтез, фотоморфогенез, рост и развитие, другие процессы, определяющие продуктивность растений, достаточно хорошо изучены [3, 4]. Создание новых источников света, для выращивания растений в условиях искусственного освещения усложняется тем, что на фоне различного соотношения синих и зеленых лучей должно быть повышенным содержание красных лучей в спектре ФАР. Эта проблема исчезает с появлением светодиодов, которые открывают неограниченные возможности в области светокультуры растений.
Светодиод (light emitting diode, или LED) - полупроводниковый прибор, преобразующий электрический ток непосредственно в световое излучение практически без потерь и в относительно узкой полосе спектра, ширина которой составляет 20-30 нм [5]. Узкая ширина спектра излучения позволяет использовать светодиоды для формирования светильников со специальным составом спектра, позволяющего активировать фотофизиологические и биопродукционные процессы у растений.
В настоящей статье приведены результаты испытаний созданной нами установки освещения на основе светодиодов, и анализ изменчивости биопродукционных параметров у регенерантов сортов Northland и Brigitta голубики высокой, размножаемых in vitro.
Методика и объекты исследования. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО «Полесский государственный университет» в январе-феврале 2011 года.
В качестве объекта исследований использовали размножаемые in vitro регенераты (экспланты) сортов Northland и Brigitta голубики высокой V. corymbosum L., в количестве не менее 120 регенерантов для каждого варианта опыта (из расчета по 40 регенерантов в колбе), в двухкратной по-вторности. Регенераты получали в результате культивирования эксплантов (состоящих из двух метамеров) в колбах конических (объемом по 100 мл) с 25 мл стерильной агаризованной, питательной среды на микро-, макро- солевой основе WPM [6], содержащей 5 мг/л 6-(у,у-диметилаллиламино)пурина, 1,0 мг/л индолилуксусной кислоты, иные органические соединения -трилон Б, тиамина хлорид, пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезо-инозитол, аденина сульфат, сахарозу - и агар-агар.
Учет анализируемых признаков - высота регенерантов, сырой вес регенерантов, коэффициенты размножения (как количество побегов, формируемых из одного экспланта, и как количество экс-плантов, каждый из которых представлен двумя метамерами, полученных из сформированного регенеранта), сырой вес побегов регенеранта (без каллюса), содержание хлорофилла a, b и кароти-ноидов - проводили через 8 недель культивирования на стеллажах световой установки культу-рального помещения биотехнологической лаборатории при температуре +25°С, фотопериоде день/ночь - 16ч/8ч, относительной влажности воздуха 70%.
В качестве источников освещения использовали люминесцентные лампы OSRAM L36W/76 Natura (4 лампы - 6000 лк, потребляемая мощность одной лампы - 36 Вт, ССТ = 6200-6500 К), либо оригинальные установки освещения на основе светодиодов, представляющие собой надеваемый на колбу пластиковый колпачок со встроенными с внутренней стороны пятью светодиодами (ARL-5213-UVS-M00 нм; ARL-3014-UWS-/.400 нм; ARL-/.630 нм). Опытные образцы светодиодной установки освещения, сконструированные сотрудниками НИЛ клеточных технологий в растениеводстве в декабре 2010 года, представлены на рисунке. Освещенность из расчета на один опытный образец (5 светодиодов указанной выше маркировки) - около 20000 лк. Предложенный образец установки освещения на основе светодиодов отличается тем, что предназначен для прямого (без потерь) освещения растительного материала in vitro. Для сохранения стерильности содержимого колбы, внутренняя часть колпачка со светодиодами перед применением протирается 70%-ным раствором спирта этилового и выдерживается на протяжении 1 часа под ультрафиолетовыми лампами.
Рисунок - Опытный образец установки освещения на основе светодиодов в действии, слева регенеранты сорта Northland, справа - сорта Brigitta
Содержание фотосинтетических пигментов хлорофилла a, b и каротиноидов в мг на г сырого веса определяли при помощи спектрофотометра Сагу 50 (Varían, США) по расчетным формулам
[7].
Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики [8], с использованием программы статистического анализа данных STATISTICA 6.0 [9]. Двухфакторный дисперсионный анализ данных и расчет доли влияния факторов на изменчивость исследуемых признаков проводили в программе статистического анализа AB-Stat 1.0, разработанной в Институте генетики и цитологии HAH Беларуси [10].
Результаты и их обсуждение. В таблице 1 приведены результаты изменчивости анализируемых количественных признаков у регенерантов сортов Brigitta и Northland голубики высокой in vitro. Для каждого анализируемого сорта, по каждому анализируемому признаку выделены значения, достоверно (при /'<0.05 и /"<0,01) превышающие соответствующий наименьший показатель по вариантам опыта.
Анализ изменчивости высоты регенерантов указывает на то, что освещение растительного материала обоих исследуемых сортов светодиодами приводит к достоверному (при /'<0.05 и /'<0.01) увеличению показателей признака в 1,3 раза, по сравнению с показателями данного признака при люминесцентном освещении (табл. 1).
Таблица 1 - Изменчивость количественных признаков у регенерантов сортовой голубики высокой при разных условиях освещения in vitro
Сорт Источник освещения КРп BP, см КРэ СВР, г СВб/к, г Хл а, мг/г сырого веса Хл Ь, мг/г сырого веса КРН, мг/г сырого веса
Brigitta ЛЛ 5,32±0,43 1,20±0,05 9,88 0,0413±0,0027 0,0216±0,0018 0,440±0,001 0,120±0,005 0,210±0,005
С 5,64±0,48 1,60±0,99* 10,30 0,0443±0,0045 0,0243±0,0025 0,720±0,001 * * 0,230±0,008** 0,290±0,006**
Northland ЛЛ 1,68±0,13 1,91±0,18 3,36 0,0673±0,0113 0,0452±0,0077 0,150±0,001 0,040±0,001 0,080±0,004
с 1,76±0,12 2,37±0,13** 4,00 0,0533±0,0062 0,0257±0,0024 0,380±0,001 * * 0,110±0,002** 0,170±0,004**
НСР0,05 (по факторам) 1,27 0,25 - 0,0280 0,0234 0,000 0,001 0,032
HCPo oi (по факторам) 2,33 0,46 - 0,0516 0,0431 0,000 0,003 0,059
НСР0,05 (частные средние) 1,79 0,35 - 0,0396 0,0331 0,000 0,002 0,045
HCPo.oi (частные средние) 3,29 0,65 - 0,0729 0,0609 0,000 0,005 0,083
Примечание - Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка средней; прочерк «-» означает отсутствие данных; * - значимо при Р<0,05; ** - значимо при I'<().() 1: JTJ1 - лампа люминесцентная OSRAM L 36W/76 Natura; С - светодиоды; ВР - высота регенерантов; КРп - коэффициент размножения, побеги; КРэ - коэффициент размножения, экспланты; СВР - сырой вес регенеранта; СВб/к - сырой вес регенеранта без каллюса; Хл а - хлорофилл а; Хл b - хлорофилл b; КРН - каротиноиды; то же для таблицы 2
Таблица 2 - Двухфакторный дисперсионный анализ изменчивости количественных признаков сортовой голубики высокой при разных условиях
освещения in vitro
ИВ ф КРп BP СВР СВб/к Хл а Хл b KP] н
CK ДВ,% CK ДВ,% CK ДВ,% CK ДВ,% CK ДВ,% CK ДВ,% CK ДВ,%
Общее 1 4,174 - 0,265 - 0,000 - 0,000 - 0,047 - 0,005 - 0,007 -
Фактор А 1 28,163** 96,4 1,535** 82,7 0,001 37,8 0,000 25,1 0,198** 60,0 0,020** 52,9 0,031** 67,1
Фактор В 1 0,074 0,3 0,173* 9,3 0,000 3,7 0,000 11,0 0,130** 39,3 0,016** 42,8 0,014** 31,0
АхВ 1 0,025 0,1 0,024 1,3 0,000 8,9 0,000 19,3 0,001** 0,4 0,001** 2Д 0,001 0,1
Повторности 1 0,006 0,1 0,087 4,7 0,000 21,2 0,000 19,1 0,001 0,2 0,001 2Д 0,001 0,5
Случайные отклонения 3 0,316 3,1 0,012 2,0 0,000 28,4 0,000 25,5 0,001 ОД 0,001 ОД 0,001 1,3
Примечание - Прочерк «-» означает отсутствие данных; ИВ - источник варьирования; CK - средний квадрат; ДВ - доля влияния фактора; фактор А - сорта голубики высокой (Brigitta, Northland); фактор В - тип освещения (люминесцентное, светодиодное)
Установлена также тенденция к увеличению коэффициентов размножения для каждого из исследуемых сортов при освещении светодиодами. При этом количество эксплантов, полученных из сформированного регенеранта у сорта Northland, в 1,2 раза превышало таковое под люминесцентными лампами (табл. 1).
Анализ изменчивости показателей сырого веса у регенерантов не выявил достоверных различий между вариантами опыта. Тем не менее, следует отметить, что в случае сорта Brigitta под светодиодами формировались регенераты с большей массой (как с каллюсом, так и без него), в то время как в случае сорта Northland регенераты с большей массой формировались под люминесцентными лампами (табл. 1).
Наиболее существенные, высоко достоверные при /"<0,01 различия между вариантами опыта были установлены по содержанию фотосинтетических пигментов - хлорофилла а, хлорофилла b и каротиноидов (табл. 1). Следует отметить, что во всех исследуемых случаях содержание фотосинтетических пигментов у регенерантов, сформированных под светодиодами существенно (для сорта Northland - более чем в 2 раза) превышало таковое у регенерантов под люминесцентными лампами. Так, у сортов Brigitta и Northland превышение по содержанию хлорофилла а составило - 1,64 и 2,53 раза, соответственно; хлорофилла b - в 1,92 и 2,75 раза; каротиноидов - в 1,38 и 2,13 раза, соответственно.
В таблице 2 приведены результаты двухфакторного дисперсионного анализа изменчивости анализируемых признаков.
Установлено, что фактор «сорт» оказывает высоко достоверное (при /"<0,01) влияние на изменчивость всех исследуемых признаков, за исключением сырого веса регенерантов, при доле влияния 52,9-96,4 %. Тип освещения (источник света - люминесцентная лампа, либо светодиоды), как фактор, оказывал достоверное влияние на изменчивость высоты регенерантов и содержания фотосинтетических пигментов. Комбинация двух исследуемых факторов оказывала достоверное (при /"<0,01) влияние только на изменчивость содержания хлорофиллов а и b (табл. 2).
Выводы. Высота регенерантов обоих исследуемых сортов под светодиодами была достоверно (при /'<0.05 и /'<0.01) в 1,3 раза выше, по сравнению с высотой регенерантов под люминесцентными лампами.
Установлена тенденция к увеличению коэффициентов размножения для каждого из исследуемых сортов, при освещении регенерантов in vitro оригинальной установкой освещения на основе светодиодов.
Анализ изменчивости показателей сырого веса у регенерантов не выявил достоверных различий между вариантами опыта. При этом масса регенерантов сорта Brigitta под светодиодами была выше, а сорта Northland - ниже, по сравнению с массой регенерантов, формируемых при люминесцентном освещении.
У регенерантов исследуемых сортов (Brigitta и Northland) под светодиодами in vitro наблюдалось достоверное при ,Р<0,01 превышение по содержанию хлорофиллаа - в 1,64 и 2,53 раза; хлорофилла b - в 1,92 и 2,75 раза; каротиноидов - в 1,38 и 2,13 раза соответственно.
Двухфакторный дисперсионный анализ установил высоко достоверное (при /'<().() 1) влияние фактора «сорт голубики высокой» на изменчивость всех исследуемых признаков, за исключением сырого веса регенерантов, и фактора «тип освещения» - на изменчивость содержания фотосинтетических пигментов.
Сконструированнный и испытанный на базе НИЛ КТР ПолесГУ образец установки освещения на основе светодиодов предлагается для регистрации в качестве полезной модели в Национальном центре интеллектуальной собственности Республики Беларусь.
Авторы выражают благодарность начальнику конструкторского отдела ОАО Пеленг» Кудря-шову Александру Алексеевичу за научную идею и помощь в реализации проекта.
ЛИТЕРАТУРА
1. Рупасова, Ж.А. Голубика высокорослая: оценка адаптационного потенциала при интродукции в условиях Беларуси / Ж. А. Рупасова. - Минск : Белорус, наука, 2007. - 442 с.
2. Сидорович, Е.А. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений / Е.А. Сидорович, E.H. Кутас. - Минск, 1996. - 246 с.
3. Шульгин, И.А. Растение и солнце /И.А. Шульгин. - Л.: Гидрометиоиздат, 1973. -251 с.
4. Тихомиров, A.A. Спектральный состав света и продуктивность растений / A.A. Тихомиров, Г.М. Лисовский, Ф.Я. Сидько. - Не.: Наука Сиб. Отделение, 1991. - 168 с.
5. Юнович, А.Э. Современное состояние и тенденции развития светодиодов и светодиодного освещения / А.Э. Юнович // Светотехника. - 2007. - №6. - С. 13 - 17.
6. Trigiano, R.N. Plant tissue culture concepts and laboratory exercises / R.N. Trigiano, D.J. Gray. - US/MA, CRC Press LLC., 1999-2000. - 454 p.
7. Гавриленко, В.Ф. Большой практикум по фотосинтезу / В.Ф. Гавриленко, Т.В. Жигалова. - М.: Акаде-ма, 2003.-256 с.
8. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. - М.: Агропромиздат, 1985. - 350 с.
9. Боровиков, В.П. STATISTICA : Искусство анализа данных на компьютере / В.П. Боровиков. - Спб : Питер, 2001.-688 с.
10. Аношенко, Б.Ю. Программы анализа и оптимизации селекционного процесса растений / Б.Ю. Ано-шенко // Генетика. - М.: Наука, 1994. - Т.30. - Приложение. - С. 8-9.
ANALYSIS OF VARIABILITY OF QUANTITATIVE TRAITS AT REGENERANTS OF HIGH-BUSH BLUEBERRY VARIETIES IN VITRO UNDER DIFFERENT MODE OF LIGHTING
A.A. VOLOTOVICH, O.A. KUDRYASHOVA, A.S. KAKHNIVK, L.S. TSVIRKO
Summary
There are presented the results of comparative analysis of variability of eight bio-production parameters in vitro at Brigitta and Northland high-bush blueberry regenerates under conditions of illumination by luminescent lamps and original device, based on light-emitting diodes. It were observed excess by chlorophyll 'a' maintenance in 1.64 and 2.53 times; by chlorophyll b maintenance - in 1.92 and 2.75 times; by carotenoids - in 1.38 and 2.13 times, accordingly to varieties investigated. The tendency to increase in reproduction factors for each of analyzed varieties is established.
© Волотович A.A., Кудряшова O.A., Кохнюк А.С., Цвирко Л.С.
Поступила е редакцию 14 октября 2011г.
