CC BY
19
УДК 577.151 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-1-103-116
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЯМОГО ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ ЛАККАЗЫ CATENULOPLANES JAPONICUS AC-875 И УГОЛЬНО-ПАСТОВОГО ЭЛЕКТРОДА, МОДИФИЦИРОВАННОГО МНОГОСТЕННЫМИ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ
Е.В. Шувалова, А.В. Абдуллатыпов, Л.И. Трубицына, Е.Е. Бабкина, С.В. Алферов, К.А. Егоров, О.Н. Понаморева
Иммобилизация оксидоредуктаз на поверхности электродов является перспективным методом для создания биосенсоров и биотопливных элементов. Для наибольшей эффективности переноса электронов фермент должен быть ориентирован на поверхности электрода строго определённым образом. В данной работе с использованием амперометрического метода было проведено сравнение доли молекул лакказ Catenuloplanes japonicus Ac-875, ориентированных к графитовому электроду центром T1, на двух различных системах модификации электродов многостенными углеродными нанотрубками (МУНТ). Доля прямого переноса электронов в системе с использованием МУНТ (10 часов окисления в азотной кислоте) оказалась больше по сравнению с системой, в которой модификация электродов была осуществлена МУНТ (окисленные в парах перекиси). Также была исследована возможность оценки потенциала активного центра данным методом. Потенциал активного центра исследуемой лакказы составил +450 мВ.
Ключевые слова: бактериальные двухдоменныелакказы, электрохимия, прямой перенос электронов, потенциал активного центра.
Введение
Лакказы (КФ 1.10.3.2, пара-дифенол : кислородоксидоредуктаза) -это универсальные фенолокисляющие ферменты, катализирующие ряд реакций окисления ароматических и неароматических соединений. Конечным акцептором электронов в данных реакциях является кислород, который восстанавливается до воды [1, 2]. Эти медьсодержащие белки относятся к семейству «голубых» оксидаз (ферментов, катализирующих реакцию окисления), содержащих в активном центре четыре атома меди, координированных имидазольными группами остатков гистидина (рис. 1).
В настоящее время лакказу относят к семейству многокомпонентных медных оксидаз - группе ферментов, включающих множество белков с различной субстратной специфичностью и разнообразными биологическими функциями. На основе количества купредоксиноподобных доменов медьсодержщие оксидазы классифицируются как ферменты с двумя (2d), тремя (3d) и шестью доменами (6d). Чаще всего лакказа, найденная у грибов, растений, насекомых, содержит три домена - Т1, Т2 и Т3 [3, 4].
С1и225С f /ГМ ШуТГцТИМбЗС
Аэр194С
Рис. 1. Структура Т2/Т3 металлоцентров и субстратных каналовлакказыдвухдоменнойлакказы 3. viridochromogenes Ас-629 (РВЕ Ю: 4п8и). Траектория субстратных каналов выделена жёлтым цветом, медь-связывающие гистидины выделены зелёным цветом, ионы меди - коричневые сферы [2]
Отдельного обсуждения заслуживает применение лакказ в биоэлектрохимии. Кроме классических методов, таких как адсорбция и ковалентная сшивка, для иммобилизации может быть использован особый вариант инкапсулирования, когда электрод покрывают полупроницаемой мембраной, пропускающей кислород к лакказе, но не дающей ей диффундировать от электрода. Благодаря способности лакказ восстанавливать кислород, получая электроны непосредственно от электрода, их можно эффективно иммобилизовать на катодах для создания биотопливных элементов.
Фермент лакказа способен осуществлять одноэлектронное окисление широкого спектра ароматических и некоторых неорганических субстратов. Применение медьсодержащего белка для иммобилизации на поверхность модифицированного электрода позволяет добиться прямого переноса электронов (ППЭ) между электродом, активным центром фермента и субстратом (рис. 2). Данное свойство может найти применение для создания биокатодов на основе лакказ и многостенных углеродных нанотрубок [5].
Рис. 2. Схема прямого переноса электронов лакказой с катода на
субстрат
Реакция прямого переноса электронов проходит через следующие стадии: восстановление Т1 центра (электрод отдает электрон), внутримолекулярный перенос электрона с Т1 на Т2/Т3 кластер, восстановление молекулы кислорода до воды в Т2/Т3 кластере.
Многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) играют важную роль при сопряжении ферментов с электродами. Наличие наноструктур на поверхности графитовых стержней не только увеличивает площадь поверхности электрода, но и обеспечивает отличную матрицу для иммобилизации молекул, что позволяет использовать их в биосенсорах и биотопливных элементах [7].
В данной работе амперометрическим методом исследован процесс прямого переноса электронов для лакказы,иммобилизованной на поверхности угольно-пастового электрода, модифицированного двумя видами МУНТ: 10 часов окисления (МУНТ-10) и окисленные в парах перекиси (МУНТ-Н2О2).
Материалы и методы
Объект исследования - бактериальная двухдоменная лакказа из коллекции лаборатории микробной энзимологии ИБФМ РАН: лакказа Catenuloplanes japonicus Ас-875.
Характеристики МУНТ. Внешний диаметр отдельных нанотрубок составляет 10-30 нм, внутренний - 5-15 нм, длина - 2 мкм, удельная поверхность - более 270 м2/г. МУНТ (10 часов окисления) получены посредством обработки УНТ «Таунит-М» кипящей азотной кислотой (квалификации «х.ч.») 10 часов. После окисления УНТ отделялись от избытка кислоты, промывались на фильтре до нейтрального рН, полученная водная паста продукта высушивалась посредством
лиофильной сушки на установке Scientz-10N. МУНТ (окисленные в парах Н2О2) получали путем окисления УНТ «Таунит-М» в парах 35% перекиси водорода при 120 °С в течение 10 часов.
Модификация угольно-пастового электрода (УПЭ). Модификацию электродов проводили по следующей методике. Шприц наполняли графитовой пастой (0,1 г графитовой пудры ( Fluka, Германия) на 40 мкл минерального масла (Fluka, Германия)). Для модификации УПЭ с помощью МУНТ-10 (10 часов окисления) многостенные углеродные нанотрубки (10 часов окисления) диспергировали в деионизированной воде (10 мг нанотрубок на 5 мл воды) ультразвуком в течение 10 мин. Приготовленные МУНТ-10 наносили по 10 мкл на рабочий электрод и подсушивали при комнатной температуре.
Модификацию УПЭ с помощью МУНТ-Н2О2 проводили следующим образом: 10 мг МУНТ-Н2О2 диспергировали в 10 мл смеси деионизированной воды с ДМФА (1:1) ультразвуком в течение 40 мин. Приготовленные МУНТ наносили по 10 мкл на рабочий электрод и подсушивали при комнатной температуре.
Иммобилизация лакказы на поверхности электрода. Иммобилизацию лакказы на поверхности графитово-пастовых электродов осуществляли методом инкапсулирования: раствор фермента наносили по 15 мкл на модифицированный УПЭ и подсушивали при комнатной температуре. На поверхности электрода закрепляли диализную мембрану с помощью пластикового кольца (рис. 3) и оставляли на 12 часов в натрий-ацетатном буфере pH 5.0.
ä И 71 Н
чв
g
j диализная мембрана МУНТ | бактериальная
Рис. 3. Схема иммобилизации бактериальной лакказы методом
инкапсулирования
Амперометрические измерения. Измерения проводили при помощи электрохимической станции CS Studio («Corr Test Insruments», Ухань, КНР), интегрированной с ПК (рис. 4).
Рис. 4. Схема амперометрической установки
Для измерений электроды (рабочий электрод и хлорсеребряный электрод сравнения) погружали в электролитическую ячейку объемом 10 мл, содержащую раствор Ка-ацетатного буфера (рН=5,0). Зависимость силы тока электрода от времени регистрировали при постоянных потенциалах (0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 мВ) и далее до значения потенциала, при котором прямой перенос электронов будет минимален или равен нулю. Сначала ячейку продували аргоном для удаления кислорода, затем при достижении постоянного тока насыщали буфер кислородом путем включения мешалки - прямой перенос электронов. После насыщения системы кислородом, добавляли 50 мкл 1 мМ 2,2л-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС) - медиаторный перенос электронов. Долю лакказы, способную к ППЭ, рассчитывали по формуле:
ш = /ППЭ 100%, (1)
^ППЭ+^МПЭ
где 1ппэ - сила тока прямого переноса электронов, мкА; 1мпэ - сила тока медиаторного переноса электронов, мкА.
Обсуждение результатов
На амперограммах модифицированных нанотрубками МУНТ-10 и МУНТ-Н2О2 угольно-пастовых электродов без лакказы не наблюдается изменение значений тока в ходе продувки ячейки аргоном, подачи кислорода и добавлении медиатора (рис. 5).
Тюте/*
МУНТ-10
1300 -1
Но1г-11(ю^к||и: (1-1 ПЛУС)
ж"'"
одача кислорода
продувка аргоном
/
добавление 50 мкл 1мМ АБТС
200 400 600 800 1004 1200
МУНТ-Н2О2
Рис. 5. Амперометрическая характеристика УПЭ+МУНТ при
потенциале +100 мВ
В случае когда на пастовые электроды нанесена лакказа Ас-875 (рис. 6), не наблюдается изменения значения силы тока после начала подачи кислорода в ячейку, что свидетельствует об отсутствии прямого переноса электронов (ППЭ). При добавлении в ячейку 50 мкл 1 мМ АБТС значения тока уменьшаются, что говорит о медиаторном переносе электронов (МПЭ) с участием фермента.
Рис. 6. Амперометрическая характеристика УПЭ + бактериальная лакказа Ас-875 при потенциале +100 мВ
Амперометрические измерения для угольно-пастовых электродов, модифицированных МУНТ-10, с иммобилизованной бактериальной лакказой, получали при постоянных потенциалах 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 мВ, в зависимости от регистрируемых токов восстановления кислорода. На рис. 7 приведены амперограммыбиоэлектрокаталитических
процессов, протекающих в системе системе УПЭ+МУНТ (10 часов окисления) + бактериальная лакказа Ас-875.
Потенциал 0 мВ Потенциал 100 мВ
о ел I г г» з э.э *
ТшмиТюиг
Потенциал 250 мВ
-а ое-е-■-'---"---'---1-<-'-■-
О 1000 2Н0 3000 4000 5000 6000
Рис. 7. Амперограммы биоэлектрохимических процессов в системе на основе УПЭ, модифицированных МУНТ-10 и лакказой СМвнШорШнвз ]арон1ст Ас-875 при заданном потенциале (мВ)
Аналогичные, представленным выше, зависимости были получены в биоэлектрохимической системе с другим видом нанотрубок - МУНТ-Н2О2. На рис. 8 приведены амперограммы биоэлектрокаталитических процессов, протекающих в системе УПЭ+МУНТ-Н2О2 + бактериальная лакказа Ас-875.
-I
1прод} |аргом
Потенциал 0 мВ
_Рс> ||т!ю ь 1а1к? (|-1 сигур>_
по дама кислорода
-добавление 50 мкл 1мМ АБТС
I родуска |аргоном
Потенциал 100 мВ
РоЬ?п1ига1нЬс (14 сип/г)
-подача кислорода
продувка аргоном
добавление 50 мкл 1мМ АБТС
Потенциал 250 мВ
РОИЯ1|1СИЬИ1С (М Я1ГУА)
■ подача кислорода
продувка
аргоном добавление 50 мкл 1мМ АБТС
Рис. 8. Амперограммы биоэлектрохимических процессов в системе на основе УПЭ, модифицированных МУНТ-Н2О2 и лакказой Са1впи1ор1апв8]аротст Ас-875 при заданном потенциале (мВ)
Потенциал Т1-активного центра находится около +250 мВ (таблица) относительно хлорид серебряного электрода (потенциал хлорид серебряного +200 мВ). В пересчете на водородный потенциал активного центра + 450мВ. Как видно из таблицы и диаграммы (рис. 9), система в которой были использованы многостенные углеродные нанотрубки, окисленные 10 часов, позволяет наиболее оптимально ориентировать Т1-активный центр лакказы Ас-875 к электроду.
Доля оптимально ориентированных лакказ для системы УПЭ + МУНТ+ бактериальная лакказа Ас-875
В Е Абсолютные значе- Доля лакказы, спо- Среднее значение
ния тока ППЭ, мкА собной к ППЭ доли лакказы, спо-
иа ц собной к ППЭ
X е т УПЭ+ УПЭ+ УПЭ+ УПЭ+ УПЭ+ УПЭ+
о с МУНТ- МУНТ- МУНТ-10 МУНТ- МУНТ-10 МУНТ-
10 Н2О2 Н2О2 Н2О2
0 0,71 0,15 70% 31%
0,32 0,72 39% 44% 50% 35%
0,53 0,66 40% 30%
+ 50 0,08 0,76 43% 39%
0,39 0,93 81% 27% 60% 43%
0,05 0,05 56% 68%
+ 100 0,08 0,30 67% 42%
0,14 0,23 70% 52% 71% 58%
0,12 0,27 75% 79%
+ 150 0,02 0,21 39% 30%
0,04 0,19 36% 28% 38% 29%
0,02 0,20 39% 28%
+ 200 0,03 0,41 35% 20%
0,02 0,02 38% 14% 34% 16%
0,003 0,15 30% 15%
+ 250 0,04 0,06 22% 9%
0,01 0,02 20% 12% 22% 14%
0,02 0,01 23% 22%
+ 300 0 0 0% 0%
0,001 0,02 5% 7% 3% 4%
0,001 0,03 3% 6%
+ 310 шумы шумы - - 0% 0%
+ 320 шумы шумы - - 0% 0%
100
90
60
70
m 60 с с
SO 40
Рис. 9. Доля лакказ, обеспечивающих прямой перенос электронов, в системах на основе графитово-пастового электрода, модифицированного нанотрубками, и лакказыСа1впи1ор1апв8]ароп1ст Ac-875 иммобилизованной методом инкапсулирования
Лакказу иммобилизовали на двух видах многостенных УНТ: МУНТ-10 (10 часов окисления) и МУНТ-Н2О2 (окисленные в парах перекиси). В литературе достаточно мало сведений о влиянии вида окисленных нанотрубок на электропроводящие свойства иммобилизованной лакказы на поверхности электрода. Опираясь на характеристики нанотрубок стоит отметить, что МУНТ-10 имеют преимущественно карбоксильные группы на всей поверхности, а на поверхности МУНТ-Н2О2 формируется очень незначительное количество карбонильных групп и достаточное количество гидроксильных групп (локальная концевая и подповерхностная функционализация кислородсодержащими группами) [8]. Это говорит о том, что в МУНТ-10 преобладают группы -СОО-, благодаря которым поверхность отрицательно заряжена. Поверхность МУНТ-Н2О2 в большей части состоит из незаряженных полярных гидроксильных групп -ОН, из-за чего является нейтральной.
Чтобы объяснить ориентацию лакказ на поверхности нанострукту-рирующего материала с помощью программы YASARA Structure было рассчитано распределение электростатического потенциала лакказы Ас-875 методом частичных сумм Эвальда в периодической ячейке с границами, отстоящими на 20 нм от границ молекул, где пороговое значение потенциала составило 200 ккал/моль (837 кДж/моль) при pH 5,0 в водном растворе с 1,17% NaCl. Отображение рассчитанного электростатического потенциала на доступную растворителю поверхность приведено на рис. 10.
А Б
Рис. 10. Распределение электростатического потенциала для лакказы Ас-875 при рН 5. А - вид со стороны Т1 активного центра, Б - вид с противоположной от Т1 активного центра стороны. Синие участки обозначают положительный потенциал, красные - отрицательный
Из рис. 10 видно, что в условиях измерений (0,2 М натрий-ацетатный буфер рН 5.0) лакказа Ас-875 имеет положительный заряд. Со стороны Т1 центра, который служит акцептором электронов, наблюдается более положительный заряд, чем с противоположной. Исходя из этого следует предположить, что благоприятная для прямого переноса электронов ориентация будет достигаться при модификации катода отрицательно заряженным наноструктурирующим материалом.
Т2-ТЗ
ф.Ф 0©©©©©
нанотрубки
Т2-ТЗ Т1
©Ф' \
оооооо
нанотрубки
О
эффективное взаимодействие
13 НгО
наименее эффективное взаимодействие
или
Рис. 11. Предполагаемая ориентация лакказы на поверхности МУНТ
Как видно из рис. 10, наибольшая доля прямого переноса электронов достигается с использованием отрицательно заряженного наноматериала. Это может быть следствием того, что отрицательная
поверхность модифицированного МУНТ-10 электрода притягивается к положительно заряженной молекуле фермента, и та ориентируется максимально эффективно (рис. 11). В случае электрода, модифицированного МУНТ-Н2О2, благоприятная ориентация молекул белка к электроду достигается реже, так как отсутствует притяжение между стороной T1 центра и поверхностью электрода.
Заключение
Иммобилизация голубого медного белка лакказы на поверхности электрода с использованием углеродных нанотрубок является перспективным направлением, поскольку позволяет увеличить эффективность переноса электронов. Модификация наноструктурирующими материалами может применяться как для создания более чувствительных биосенсоров для детекции фенольных соединений в среде или сточных водах, так и более эффективных биотопливных элементов, интересных с точки зрения разработки новых экологически чистых источников энергии. Таким образом, изучение иммобилизации данного фермента на электродах является многообещающим направлением для науки и производства.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания в области научной деятельности проект № FEWG-2021-0013 (Биокаталитические платформы на основе клеток микроорганизмов, субклеточных структур и ферментов в сочетании с наноматериалами)
Список литературы
1. Expression of thermophilic two-domain laccase fromCatenuloplanes japonicus in Escherichia coli and its activity against triarylmethane and azo dyes / Trubitsina L. I., Abdullatypov A.V., Larionova A.P. [et al.] //PeerJ. 2021. V. 9. P. 11646.
2. Трубицина Л. И. Двухдоменные лакказы бактерий рода Streptomyces: клонирование, экспрессия, характеристика ферментов // Дисс. ... канд. биол.наук: 03.01.04-Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 2017. 147 с.
3. Komori H., Higuchi Y. Structure and molecular evolution of multicopper blue proteins // BioMolConcepts. 2010. V.1. P. 31-40.
4. Biochemical properties and yields of diverse bacterial laccase-like multicopper oxidases expressed in Escherichia coli / Ihssen J., Reiss R, Luchsinger R. [et al.] // Scientific reports. 2015. V. 5. № 1. С. 1-13.
5. Bollella P., Katz E. Enzyme-based biosensors: Tackling electron transfer issues // Sensors. 2020. V. 20. № 12. С. 3517.
6. Гандилян С. В., Гандилян Д. В. Научно-технические основы применения наноструктурного материаловедения и наноэлектроники в системах электромеханических преобразователей энергии специального назначения // Журнал технической физики. 2019. Т. 89. № 7. С. 975-983.
7. Akanda M. R., Sohail M., Kawde A.N. Recent advances in nanomaterial modified pencil graphite electrodes for electroanalysis // Electroanalysis. 2016. V. 28. №.3. P. 408-424.
8. Dyachkova T. P., Tkachev A. G. Methods of functionalization and modification of carbon nanotubes. M.: Publish. House «Spectrum», 2013. 152 p.
Шувалова Екатерина Владимировна, студент, kdks1620@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Абдуллатыпов Азат Вадимович, канд. биол. наук, науч. сотр., azatik888@yandex.ru, Россия, Пущино Институт фундаментальных проблем биологии РАН - обособленное структурное подразделение ФИЦ ПНЦБИ РАН,
Трубицына Любовь Игоревна, канд. биол. наук, мл. науч. сотр., lyhovyerevich@mail.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН - обособленное структурное подразделение ФИЦ ПНЦБИ РАН,
Бабкина Елена Евгеньевна, канд. хим. наук, доц. каф. биотехнологии, hahkinael@ramhler.ru, Тула, Тульский государственный университет,
Алферов Сергей Валерьевич, канд. хим. наук, ст. науч. сотр., s.v.alferov@,gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Егоров Константин Алексеевич, студент, egorov.koct@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук, зав. каф. биотехнологии, olgaponamoreva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE EFFICIENCY OF DIRECT ELECTRON TRANSFER IN SYSTEMS BASED ON CATENULOPLANES JAPONICUS AC-875 LA^ASE AND A CARBON-PASTE ELECTRODE MODIFIED WITH MULTI-WALL CARBON NANOTUBES
E.V. Shuvalova, A.A. Abdullatypov, L.I. Trubitsina, E.E. Babkina, S.V. Alferov, K.A. Egorov, O.N. Ponamoreva
Immobilization of oxidoreductases on the surface of electrodes is a promising method for creating biosensors and hiofuel cells. For the highest efficiency of electron transfer, the enzyme must he oriented on the electrode surface in a strictly defined way. In this work, using the amperometric method, we compared the fraction of Catenuloplanes japonicus Ac-875 lac-case molecules oriented to the graphite electrode with the T1 center on two different systems of electrode modification hy multi-walled carhon nanotuhes (MWСNT). The proportion of direct electron transfer in the system using MWCNT (10 hours of oxidation in nitric acid)
turned out to be higher compared to the system in which the electrodes were modified with MWCNTs (oxidized in peroxide vapor). The possibility of estimating the potential of the active center by this method was also investigated. The potential of the active center of the studied laccase was +450 mV.
Key words: bacterial two-domain laccases, electrochemistry, direct electron transfer, active site potential.
Shuvalova Ekaterina Vladimirovna, student, kdks1620@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Abdullatypov Azat Vadimovich, candidate of biological science, researcher, azatik888@yandex.ru, Russia, Pushchino, Institute of Basic Biological Problems RAS - A Separate Subdivision of PSCBR RAS (IBBP RAS),
Trubitsina Liubov Igorevna, candidate of biological science, Junior Researcher, lybov_yerevich@mail.ru, Russia, Pushchino, Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS - A Separate Subdivision of PSCBR RAS (IBBP RAS),
Babkina Elena Evgenevna, candidate of chemical science, docent of Biotechnology Department, babkinael@rambler.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Alferov Sergey Valerievich, candidate of chemical science, Head of Laboratory, s.v.alferov@,gmail.com, Russia, Tula, Tula State University
EgorovKonstantin Alekseevich, student, egorov.koct@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, Head of Biotechnology Department, olgaponamoreva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University
