CC BY
50
УДК 631.41
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЧВЕННОЙ ДНК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РАЗНООБРАЗИЯ АММОНИЙ-ОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ МЕТОДОМ ПЦР-ДГГЕ
А.С. Черобаева, А.Л. Степанов, И.К. Кравченко
Проведена сравнительная оценка пяти методов, включая авторскую модификацию, экстракции и очистки препаратов почвенной ДНК для дальнейшего применения в молекулярных исследованиях разнообразия нитрифицирующих бактерий и архей в почвах. Эксперименты, проведенные с образцами почв природных экосистем и агроэкосистем европейской части России, показали, что количество ДНК, полученной с использованием разных методов, существенно зависело от типа почвы. Последующий молекулярный анализ (ПЦР-ДГГЕ), основанный на анализе фрагментов рибосомальных (16S рРНК) и функциональных (amoA) генов, продемонстрировал значительные различия в составе нитрифицирующих сообществ в зависимости от метода выделения ДНК. Так, для анализа состава сообщества аммоний-окис-ляющих бактерий и архей в кислых почвах (дерново-подзолистая, серая лесная) лучшие результаты были получены при использовании метода, предложенного R.I. Griffiths с соавт. [4] в модификации авторов статьи. В то же время в почвах с высоким содержанием гумусовых веществ (чернозем, каштановая) наиболее эффективным было применение коммерческих наборов реактивов.
Полученные результаты показали, что при проведении молекулярного анализа почвенных микробных сообществ необходимым этапом является подбор оптимальных условий выделения препарата ДНК, особенно для почв с высоким содержанием органических соединений и глинистых минералов, а также различного уровня кислотности.
Ключевые слова: нитрификация, аммоний-окисляющие бактерии, выделение ДНК, ДГГЕ, гепатоА.
Введение
Сложность выделения большинства микроорганизмов из природных объектов в лабораторную культуру [2] обусловила широкое использование мо-лекулярно-биологических подходов, применяемых при изучении микроорганизмов в почвенных образцах и сточных водах [7, 9]. Успех молекулярного анализа микробного сообщества в значительной степени зависит от качества выделенных из почв препаратов ДНК [12]. Несмотря на то что в литературе описано большое число протоколов выделения почвенной ДНК (см., например, [4, 12]) и существует ряд коммерческих наборов реактивов, получение высококачественного препарата является весьма трудной задачей и сопряжено с процессом подбора наиболее оптимального для данного типа почвы и поставленной экспериментальной задачи протокола, а зачастую и разработкой собственных методов или модификаций [1].
Основная часть протоколов базируется на применении метода прямого in situ лизиса и значительно меньшая — на методе лизиса микробной фракции, полученной за счет «первоначальной» клеточной экстракции [9]. В основе метода прямого лизиса лежат три основных этапа обработки образца: физическое воздействие, химический лизис и ферментативный лизис. Методы физической обработки
включают применение технологий заморозки—раз-морозки образца (freeze—thaw) [10], дробление частиц почвы ультразвуком [9, 12], гомогенизацию с силиконовыми или циркониевыми шариками (beat-beating) [10], размельчение образца в жидком азоте [9]. В настоящее время наиболее часто применяется гомогенизация почвенного образца с шариками, что обеспечивает высокий количественный выход ДНК. Недостаток метода — совместная экстракция с ДНК гумусовых веществ, затрудняющих дальнейший молекулярный анализ [10]. Химический лизис основан на обработке образца почв детергентами (доде-цил сульфат натрия — SDS, хлорид натрия — NaCl и буферы — фосфатный, или Tris, pH 7—8) [4, 7, 12]. Возможными модификациями на данном этапе экстракции являются: повышение температуры инкубации, использование хлороформа и фенола, применение хелатообразующих веществ для ингибирова-ния нуклеаз и диспергирования частиц почвы [4, 6]. Ферментативный лизис используется на конечном этапе и проводится под воздействием ферментов ли-зоцима, протеиназы К или Е, акромопептидазы [6]. Наиболее часто модификации вносят в этап очистки выделенного препарата ДНК от контаминиру-ющих веществ, ингибирующих дальнейшие молекулярные реакции. Для очистки ДНК, полученной из почв с высокими концентрациями гумусовых кислот, используют центрифугирование в градиен-
те хлорида цезия, цетил триметиламмоний бромид (СТАВ), поливинилполипирролидон (РУРР) и сульфат алюминия, электрофорез в агарозном геле, хроматографические колонки типа Сефадекс [7, 12, 13, 18]. Эффективность данного этапа определяется отсутствием ингибирующих веществ по результатам проведения ПЦР [8].
Сравнительное изучение действия разных коммерческих наборов и модифицированные методов показало, что количество и качество препарата ДНК во многом зависит от типа анализируемого образца, химического состава и физических свойств почвы [4, 12, 13]. Следовательно, универсального протокола, дающего одинаково высокий процент выгхо-да высококачественной ДНК из разных типов почв, не существует [13]. Особую актуальность проблема экстракции препаратов ДНК из почвы приобрела в связи с применением молекулярныгх методов, позволяющих получить количественные и качественные характеристики микробныгх сообществ: молекулярное клонирование, электрофоретическое разделение в градиенте денатуратов (ДГГЕ), ПЦР в реальном времени [6, 8, 13]. Особое внимание уделяется качеству препаратов ДНК при анализе так называемых функциональных генов, кодирующих синтез ключевых ферментов важнейших биохимических или биогеохимических процессов. Одним из них является автотрофное окисление аммония, которое, согласно современным представлениям, осуществляется представителями ЕиЪа^епа и АгсИаеа.
Цель настоящей работы состояла в подборе оптимального протокола для получения препарата ДНК из почвенных образцов некоторых зональных почв европейской части России, который может быть эффективно применен для оценки разнообразия ам-моний-окисляющих бактерий и архей.
Объекты и методы исследования
Образцы четырех типичных зональных почв быши отобраны в мае 2010 г. Две из них характер-
ны для лесной зоны (дерново-подзолистая и серая лесная) и две другие — для степной (чернозем и каштановая). Отбор образцов осуществляли из природного экотопа (лес) и агроценоза для каждого типа почвы. Некоторые их характеристики приведены в табл. 1.
Методы выделения ДНК из почвенных образцов
Метод 1. Препарат ДНК выделяли из почвенного образца массой 0,5 г с помощью коммерческого набора реактивов — Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit («MoBio», США) — в соответствии с протоколом производителя.
Метод 2. Препарат ДНК из почвенного образца массой 0,5 г выделяли в соответствии с протоколом производителя при помощи коммерческого набора реактивов FastDNA spin kit for soil («Qbio-gene», Канада).
Препараты ДНК, полученные методами 1 и 2, растворяли в 50 мкл дистиллированной воды. Дальнейшую очистку производили с помощью коммерческого набора реактивов UltraClean 15 DNA purification Kit («MoBio», Канада).
Метод 3. Препарат ДНК выделяли согласно протоколу C. Yeates с соавт. [21], который основан на прямом лизисе большой навески. Почвенный образец массой 100 г переносили в пробирки (190 мл, «Labcare», Великобритания), содержащие 100 мл экстракционного буфера Tris-HCl (100 мМ Tris-HCL, 100 мМ EDTA, 1,5 M NaCl, рН 8,0) и 100 г стеклянных шариков (диаметр 1 мм, «Bio-Spec Products», США). После интенсивного встряхивания (Bio-101, «Vista», США) со скоростью 5,5 rpm в течение 2 мин. добавляли 10 мл 10%-го раствора SDS и инкубировали при 65° в течение 1 ч. К супернатанту, полученному после центрифугирования на скорости 6000 g в течение 10 мин., добавляли 100 мл экстракционного буфера Tris-HCl и инкубировали 10 мин. при 65°. Экстракты переносили в центрифужные пробирки (50 мл), половина объема которых была за-
Таблица 1
Общая характеристика почв
Почва, код, место взятия образца Описание почв рНвод Содержание гумуса, % мкг N/г почвы
Дерново-подзолистая (Д), г. Москва мощнодерновая среднеподзолистая, песчано-крупнопылеватый суглинок 4,3 2,1 3,9
Серая лесная (С), Пущино, Московская обл. среднемощная среднесуглинистая на лёссовидном суглинке, подстилаемом песчаным аллювием 5,9 2,0 1,8
Каштановая (К), Волгоградская обл., Ило-винский р-н среднемощная, среднесуглинистая на карбонатном лёссовидном суглинке 7,2 3,9 1,8
Чернозем (Ч) Воронежская обл., Талов-ский р-н типичный среднемощный, тяжелосуглинистый на карбонатных лёссовидных суглинках 6,8 7,2 2,4
полнена 30%-м раствором полиэтиленгликоля (PEG) в 1,6 M NaCl, и выдерживали при комнатной температуре 2 ч. Образцы центрифугировали 20 мин. на скорости 10 000 g и полученный осадок, содержащий ДНК, растворяли в 20 мл буфера ТЕ (100 мМ Tris-HCL, 1 мМ EDTA, pH 8,0). Для осаждения был добавлен 7,5 М-й раствор ацетата натрия до конечной концентрации 0,5 М. Для преципитации протеинов образцы держали на льду 5 мин., затем центрифугировали (4°, 16 000 g, 30 мин.). К водной фазе, содержащей нуклеиновые кислоты, добавляли смесь фенол/хлороформ (23:24), хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и 0,6 объемов изопропанола. После двух часов инкубации при комнатной температуре экстракт центрифугировали (16 000 g, 30 мин.) и ДНК ресуспендировали в 1 мл буфера ТЕ.
Метод 4. Метод, описанный R.I. Griffiths с со-авт. [4], в модификации G.W. Nicol с соавт. [16] позволяет проводить одновременное выделение из почвы ДНК и РНК. Почвенный образец массой 0,5 г помещали в пробирки с силиконовыми шариками (Bio-101 Multimix 2 Matrix tubes) и добавляли 0,5 мл СТАВ-экстракционного буфера («Sigma», Великобритания), 0,25 мл жидкого фенола и 0,25 мл хло-роформ/изоамилового спирта (24:1).
После интенсивного перемешивания (Bio-101, «Vista», США) на скорости 4,0 rpm в течение 30 с и последующего 10-минутного центрифугирования при 16 000 g переносили верхнюю фазу центрифу-гата в новую пробирку объемом 1,7 мл и добавляли смесь хлороформа и изоамилового спирта. Для преципитации ДНК использовали 1,6 M полиэти-ленгликоль-6000/NaCl и инкубацию в течение ночи при 4°. Осадок ДНК промывали 70%-м этиловым спиртом и растворяли в 30 мкл дистиллированной воды.
Метод 5. В протокол R.I. Griffiths с соавт. [4] нами были внесены следующие изменения. Во-первых, был добавлен этап начальной инкубации образца почвы и СТАВ-экстракционного буфера в пробирках с силиконовыми шариками в течение двух часов на льду для улучшения качества преципитации ДНК и РНК. Для образцов почв с высоким содержанием гуматов (каштановая и чернозем) количество СТАВ-экстракционного буфера было увеличено до 0,7 мл. Во-вторых, для улучшения гомогенизации почвы были увеличены время обработки на роторе до 40 с и скорость вращения до 5,5 rpm. В-третьих, после этапа механической обработки су-пернатант был перенесен в пробирки с гелем Max-Tract High Density («Qiagen», Великобритания). Max-Tract-гель создает стабильный барьер, который препятствует попаданию органических компонентов, белков и других примесей в водный раствор и увеличивает эффективность выделения нуклеиновых кислот до 30%. Дальнейшая процедура соответствовала протоколу [4].
Для каждого метода было проведено по четыре серии экспериментов, в каждой из которых вы-
деляли препарат ДНК из трех отдельных образцов почвы. Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли на спектрофотометре Nanodrop 2000 («Thermo», Великобритания).
Амплификация фрагментов
генов 16S рРНК и amoA
Для амплификации фрагментов 16S рРНК ам-моний-окисляющих бактерий использовали прай-меры CTO189f и CTO654r [11]. Полученные продукты использовали в качестве ДНК-матрицы для второго раунда амплификации с праймерами P3 и P2 [14]. Фрагмент рибосомального гена 16S рРНК кренархеот был амплифицирован с помощью системы праймеров и A109f [5] и модифицированным 1492r (5 -GYYACCTTGTTACGACTT-3 ) [15]. Продукты после первого раунда ПЦР использовали в качестве матрицы для последующей амплификации с праймерами 771f и 957r [17]. Для амплификации фрагментов гена amoA аммоний-окисляющих бактерий использовали систему олигонуклеотидных праймеров amoA-1F и amoA-2R [19], а для аммоний-окис-ляющих архей — CrenamoA23f и CrenamoA616r [20].
Для всех ПЦР-реакций объем реакционной смеси составлял 50 мкл и включал 10 • ПЦР-буфер (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 2 мМ MgCl2), 2 мкл dNTP, 10 пмоль каждого из прай-мров, 2 единицы Taq ДНК-полимеразы. Использовали следующий температурно-временной протокол: 5 мин. при 95°, следующие 10 циклов — 30 с при 94°, 30 с при 55°, 1 мин при 72°; следующие 25 циклов — 30 с при 92°, 30 с при 55°, 1 мин. при 72°, элонгация — 10 мин. при 72°; для праймеров A109f/1492r период элонгации составлял 2 мин. Для амплификации использовали прибор MyCycler («BioRad», США). Анализ продуктов ПЦР проводили в 1%-м агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл-1.
Электрофорез в денатурирующем
градиентном геле (ДГГЕ)
Анализ состава сообщества кренархеот и аммо-ний-окисляющих архей выполняли в соответствии с протоколом, описанным в работе G.W. Nicol с соавт. [16]. GC-кламп был присоединен к праймеру 957r второго раунда амплификации фрагментов 16S рРНК сообщества кренархеот [14]. Сообщество ам-моний-окисляющих бактерий охарактеризовано с помощью ДГГЕ-анализа фрагментов 16S рРНК в соответствии с методикой, описанной в работе T.E. Freitag с соавт. [3], и GC-кламп был присоединен к праймеру P3 (357f-GC) [14] второго раунда амплификации. ДГГЕ-анализ amoA аммоний-окисляющих архей не требовал наличия GC-клампа, для разделения использовали ПЦР-продукты, полученные после амплификации с праймерами CrenamoA23f и CrenamoA616r.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
ПМ. | !• iJkfWg -
□ ы ы
Рис. 1. Анализ выделенного препарата ДНК в 1%-м агарозном геле, окрашенном бромистым этидием: А — коммерческий набор реактивов FastDNA spin kit for soil («Qbiogene», Канада), Б — метод R.I. Griffiths с соавт. [4], В — модификация метода R.I. Griffiths с соавт.; 1, 10 — чернозем, лес, 2, 11 — он же, пашня, 3, 12, 19 — дерново-подзолистая, лес, 4, 13, 20 — она же, пашня, 5, 14, 21 — каштановая, лес, 6, 15, 22 — она же, пашня, 7, 16, 23 — серая лесная, лес, 8, 17, 24 — она же, пашня, 9, 18, 25 — маркер молекулярной массы ДНК (100 пн)
ДГГЕ-анализ выполняли с помощью приборов DCode Universal Mutation Detection System («BioRAd», США). Гели содержали 8% (вес/объем) по-лиакриламида и разные градиенты денатурантов (формамида и мочевины): 35—70% для 16S рРНК кренархеот, 35—65 для 16S рРНК аммоний-окисля-ющих бактерий и 15—55% для amoA аммоний-окис-ляющих архей. Электрофорез проводили в 1 • ТАЕ буфере при постоянной температуре 60° в течение 900 мин. при напряжении 100 В. Окрашивание гелей нитратом серебра проводили согласно методике [16], а полученные гели сканировали с помощью сканера Epson GT9600.
Результаты и их обсуждение
Сравнительный анализ концентраций ДНК
в препаратах, выделенных разными методами
Различия в эффективности методов, которые используются для получения препаратов ДНК из природных образцов почв, могут быть причиной проблем молекулярного анализа популяций микроорганизмов в природных сообществах. Мы проверили несколько методов выделения ДНК, два из которых соответствуют коммерческим протоколам,
а два — разработки авторов, из образцов почв для последующего молекулярного анализа микробных сообществ. Кроме того, в один из методов нами быши внесены модификации. Результаты анализа полученных препаратов ДНК в агарозном геле представлены на рис. 1.
Применение метода 1 и метода 2 (коммерческие препараты) позволило стабильно получать препараты ДНК из всех проанализированных образцов почв, причем при использовании последнего, как правило, содержание ДНК бышо выше в 1,5—2,5 раза и достигало в лесных почвах 21,4—29,3 мкг/г-1 сухой почвы (табл. 2). Для почв агроценозов (дерново-подзолистой, серой лесной почв и чернозема) различия оказались не столь велики; для каштановой различия в количестве ДНК, выделенной обоими методами, недостоверны.
Применение метода 3 оказалось эффективным для черноземной почвы и позволило получить препараты с наиболее высоким содержанием ДНК — 34,7 мкг/г-1 в почве леса и 29,5 мкг/г-1 в почве аг-роценоза (табл. 2). Однако эти результаты отличались низкой воспроизводимостью, и высокие значения концентрации ДНК быши получены лишь в одной серии экспериментов из четырех. Метод 3 продемонстрировал примерно те же значения кон-
Таблица 2
Значения концентраций препарата ДНК, выделенного разными методами
Образец Концентрация препарата ДНК, мкг/г 1 сухого веса
метод 1 метод 2 метод 3 метод 4 метод 5
Д лес Д агро 10,4 ± 9,3 9,8 ± 8,7 29.3 ± 1,3 12.4 ± 11,1 18.3 ± 0,2 13.4 ± 2,5 106,7 ± 2,5 4,3 ± 3,8 205,5 ± 5,9 30,7 ± 8,5
С лес агро 11,2 ± 9,5 10,6 ± 7,2 21,4 ± 11,9 12,9 ± 11,1 20,9 ± 4,2 14,6 ± 2,8 13,5 ± 7 90,0 ± 6,3 104,3 ± 10 105,5 ± 6,2
Ч лес агро 8,4 ± 5,8 6,9 ± 7,4 15,6 ± 9,5 10,3 ± 7,6 34,7 ± 8,1 29,5 ± 5,0 0,3 ± 0,1 0,6 ± 0,2 35,2 ± 3,7 66,4 ± 2,5
К лес агро 8,6 ± 8,3 7,9 ± 7,8 6,2 ± 9,5 12,6 ± 10,03 23.7 ± 1,0 24.8 ± 2,3 26,2 ± 6,3 7,3 ± 0,5 46,3 ± 9,2 50,8 ± 6,7
центрации ДНК, что и методы 1 и 2: получаемые результаты были стабильны и воспроизводимы, особенно при анализе образцов каштановой и серой лесной почв лесных биоценозов.
Метод 4 позволил получить для дерново-подзолистой почвы леса препараты с содержанием ДНК 106,7 мкг/г-1 (табл. 2), а также с высоким содержанием РНК (данные не представлены). Для образцов серой лесной почвы естественного экоценоза содержание ДНК было высоким и составило 90 мкг/г-1, но РНК не обнаружено. С помощью метода R.I. Griffiths [4] был получен препарат ДНК из чернозема в наименьшей концентрации. После этапа механической обработки этой почвы объем экстрагированной жидкости, содержащей ДНК, был ниже, чем рекомендовано в оригинальном протоколе [4], что привело к снижению эффективности дальнейших этапов экстракции и, как результат, низкой концентрации ДНК. Для всех остальных образцов с помощью метода 4 не удалось выделить РНК, а количество ДНК было ниже или не отличалось достоверно от результатов методов 1, 2 и 3.
Нами была предпринята попытка адаптировать метод R.I. Griffiths с соавт. [4] для почв, богатых гумусом и органическими веществами (чернозем). Изменения в процедуре экстракции и гомогенизации, а также инкубация на льду увеличили выход нуклеиновых кислот. Весьма успешным было введение в протокол дополнительного этапа с применением коммерческого набора реактивов MaxTract High Density. Это позволило значительно уменьшить потери ДНК на стадиях дальнейшего получения препарата по сравнению с оригинальным протоколом. В результате нам удалось получить препарат ДНК из чернозема, но в меньшей концентрации, чем при выделении его коммерческими наборами реактивов методами 1 и 2.
Сложность выделения препарата ДНК из почв состоит в том, что они имеют разный химический состав и физические характеристики. Следовательно, весьма проблематично подобрать единый протокол для выделения ДНК из всех типов почв с одинаковой эффективностью. Проведенный сравнительный анализ концентраций препарата ДНК, выделенного разными методами, показал, что коммерческие наборы реактивов позволяют получать стабильный продукт из всех типов изучаемых почв средней концентрации 100—200 мкг/г-1, независимо от количества в них гуминовых кислот, органических веществ, глинистых компонентов и уровня рН. Данный результат является следствием того, что состав коммерческих реактивов достаточно универсален и направлен на выделение препарата ДНК в максимальной концентрации, но при этом коммерческие методы имеют низкую избирательность, и вместе с ДНК экстрагируются гуминовые кислоты. Они являются ингибиторами полимеразных реакций, поэтому в ряде случаев препарат ДНК, выделенный коммерческими наборами реактивов, требует допол-
нительной очистки. В нашем исследовании мы применяли UltraClean 15 DNA purification Kit, что значительно увеличивало стоимость анализов. Коммерческий набор FastDNA spin kit (метод 2) позволил выделить препарат ДНК большей концентрации, чем Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit (метод 1) из всех образцов зональных почв агроценозов и естественных экоценозов.
Метод R.I. Griffiths [4] продемонстрировал высокую эффективность в отношении дерново-подзолистой и серой лесной почв, позволив выделить из них не только препарат ДНК, но и РНК. Однако в соответствии с оригинальным протоколом не удается выделить препарат ДНК высокой концентрации из чернозема и каштановой почвы (табл. 2). Мы предполагаем, что сложности в применении метода к данным почвам могут быть связаны с высокими концентрациями гуминовых кислот в черноземе и глинистых компонентов в каштановой почве. Как известно, процедура очистки от них является достаточно сложной, a метод Griffiths имеет минимальное число этапов очистки ДНК. Вероятно, для богатых гуминовыми кислотами почв необходимы модификации протокола, что и было сделано нами в методе 5. Внесенные модификации способствовали лучшей гомогенизации почвы в экстракционном буфере, преципитации и более интенсивной очистке препарата. Метод C. Yeates с соавт. [21], протокол которого включает многостадийные этапы очистки препарата ДНК, позволил увеличить концентрацию этой кислоты, выделенной из чернозема, однако в отношении остальных почв метод оказался малоэффективным. Поскольку в методе используется интенсивная механическая обработка образцов, мы предполагаем, что часть препарата ДНК почвенных образцов могла быть повреждена.
ПЦР-анализ фрагментов 16S рРНК-генов
аммоний-окисляющих бактерий и архей
Качество полученных препаратов ДНК для дальнейшего молекулярного анализа было проверено в реакции амплификации фрагментов рибосомальных генов 16S рРНК аммоний-окисляющих бактерий (АОБ) и аммоний-окисляющих архей (АОА). С целью увеличения чувствительности метода и уменьшения неспецифических продуктов реакции нами была применена так называемая «вложенная» ПЦР (nested PCR), когда две праймерные системы используются в двух последовательных ПЦР-реакциях так, что вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. Анализ показал, что для всех образцов почв препараты ДНК, полученные с помощью методов 1 и 2, могут быть использованы в первом раунде амплификации фрагментов 16S рРНК-генов аммоний-окисляющих бактерий (рис. 2, А) и архей (результат не приведен). Продукты из почв всех типов имели слабую интен-
ч., Ч2 Д., Д2 C1 С2 Ki к2 ок м
К, К2 Д, Д2 OK MI4! Ч2 К, К2 Д! Д2 C1 С2 OKI К.| К2 С, С2 Д, Д2 ОК М|ч, Ч2 Д Д2 С1 ОК СгК^гМ
К1 к 2 с 1 с2 д, д2 ок м ■
■ tsf ■ ш ^^ м в^Л
и" Ш ^^ мет. 4
[21 мет. 4 | мет. 5
K-i К2 Д! Д2 C1 Cjlfl! Д2 Ci С2 К! К2 Ч1 Ч2 ОК М |Ч1 Ч2 Д! Д2 С, С2 К1 К2 OKI К1 К2 Ci С2 Д! Д2 М
мет. 4 мет. 5
Рис. 2. Результаты двухэтапного «nested» ПЦР-анализа фрагментов 16S рРНК-генов аммоний-окисляющих бактерий (А—Д) и архей (Е, Ж): А, В, Е — 1-й, Б, Г, Д, Ж — 2-й этапы ПЦР-анализа; Ч — чернозем, К — каштановая почва, С — серая лесная, Д — дерново-подзолистая почвы; цифры в индексах: 1 — агроценоз, 2 — лесной экоценоз; ОК — отрицательный контроль, М — маркер молекулярной массы ДНК (1000 пн)
сивность, однако результат был воспроизводимым и стабильным.
Из препаратов ДНК, выщеленных методом 3, для всех почвенных образцов нам не удалось амплифи-цировать фрагменты 168 рРНК-генов ни бактерий, ни архей. Повторные реакции, увеличение количества матрицы и изменения в температурно-временном протоколе ПЦР не привели к получению продукта.
Концентрация продуктов амплификации из препаратов ДНК, выделенных с помощью методов 4 и 5 (рис. 2, В) из разных почв, значительно отличалась. Для аммоний-окисляющих архей видимый продукт быш получен только для дерново-подзолистой почвы (рис. 2, ЕЕ).
Несмотря на существенные различия в интенсивности, использование ПЦР-продуктов в качестве матрицы для второго этапа амплификации привело к получению четких продуктов фрагментов 168 рРНК АОБ для всех почв и всех препаратов ДНК (рис. 2, Б, Г, Д). Для АОА результаты амплификации не быши стабильны. Продукт высокой интенсивности был получен для образцов серой лесной и каштановой почв лесных биоценозов и дерново-подзолистой почвы (рис. 2, Ж). Менее четкие продукты получены из чернозема, серой лесной и каштановой почв агроценоза.
Таким образом, при получении препаратов почвенной ДНК для двухэтапной амплификации фрагментов 168 рРНК-генов АОБ и АОА, в том числе
из образцов с высоким содержанием гумусовых веществ, глинистых компонентов и кислот, могут быть успешно применены коммерческие наборы реактивов. Метод R.I. Griffiths с соавт. [4] и наша модификация дают стабильные результата анализа 16S рРНК АОБ в разных почвах, в то время как при анализе АОА наблюдается значительная вариабельность сигнала амплификации.
ПЦР-анализ фрагмента гена атоА аммо-
ний-окисляющих бактерий и архей
Амплификация протеин-кодирующего гена является более специфичной реакцией, и препараты ДНК должны содержать минимальное количество ингибирующих веществ. Наиболее часто для оценки состава сообщества почвенных АОБ используют праймерные системы amoA-1F и amoA-2R [19], которые были успешно применены нами для анализа сообществ АОБ в зональных почвах методом молекулярного клонирования. Для всех образцов почв был получен стабильный продукт амплификации фрагмента функционального гена атоА АОБ независимо от способа выделения ДНК (рис. 3, А). В то же время способ выделения ДНК влиял на успешность амплификации фрагмента гена атоА АОА. Так, для препарата ДНК, выделенного методами 1 и 2, четкий продукт получен для всех типов почв, кроме агроценозов чернозема и каштановой поч-
М С1 С2 к, К2 Д1 д2 Ч, ч2 ок С1 с2 К1 к2 Д1 д2 41 ч2 ок м
ш г* 1
• ^^ щшшШ ЩЩШШ Ш0 —
мет. 2 В мет. 2
м с1 с2 к, к2 Д1 д2 ок С1 с2 К1 к2 Д1 д2 ок ч., Ч2 М
а
-
□ мет. 4 в мет. 5
Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа фрагмента функционального гена амоА аммоний-окисляющих бактерий (А)
и архей (Б, В, Г) (обозначения см. на рис. 2)
вы (рис. 3, Б). С помощью метода 4 получен продукт для дерново-подзолистой и серой лесной почв (рис. 3, В), но не для каштановой. Использование модифицированного нами метода 5 позволило получить слабые сигналы амплификации для каштановой почвы и чернозема.
ДГГЕ-анализ фрагментов 16Б рРНК-генов из препаратов ДНК
ДГГЕ-анализ является универсальным способом оценки состава сообщества микроорганизмов в почвах и сточных водах. Успешный результат его для некоторых вариантов анализа является трудно вос-
производимым из-за сложностей, связанных с конструированием праймеров, к которым необходимо присоединять ОС-богатые участки [20]. Именно поэтому препараты ДНК, используемые для ДГГЕ-ана-лиза, должны соответствовать основным требованиям: содержать минимальное количество ингибирующих веществ, проходить дополнительную очистку от альбуминов, используемых в ПЦР-коктейлях, иметь низкую концентрацию ДНК [3].
Проведенные анализы показали, что ДГГЕ-про-фили фрагментов 168 рРНК-генов АОБ не имеют существенных различий для препаратов ДНК, выделенных методами 1, 2 и 4, 5. На рис. 4, А представлен в качестве примера результат анализа пре-
Рис. 4. Результаты ДГГЕ-анализа фрагментов 168 рРНК-генов аммоний-окисляющих бактерий (А) и архей (Б, В)
(обозначения см. на рис. 2)
парата почвенной ДНК, выделенной методом 2. В то же время ДГГЕ-анализ фрагментов 16S рРНК-генов АОА выывил различия в числе полос, интенсивности сигнала, а также воспроизводимости результатов для разных методов выделения препарата ДНК. Существенные различия в ДГГЕ-профилях показаны для методов с использованием коммерческих наборов реактивов и метода R.I. Griffiths с соавт. [4] (рис. 4, Б, В), при этом последний характеризуется получением более четкого продукта из всех типов почв. Число визуализированных полос путем окрашивания ДГГЕ-продуктов для каждого типа почвы в отдельности было больше, когда в качестве матрицы использовали препарат ДНК, выделенный коммерческим набором реактивов (рис. 4, В).
Следовательно, наиболее подходящим методом выделения препарата ДНК для последующего анализа фрагментов 16S рРНК-генов аммоний-окис-ляющих архей методом ДГГЕ является таковой с применением коммерческих наборов реактивов. Получение четких продуктов, стабильно работающий протокол и результаты последующего окрашивания свидетельствуют о возможности использования в качестве матрицы препарата ДНК, выделенного коммерческими наборами реактивов. При этом препарат ДНК, выделенный методом R.I. Griffiths с соавт. [4], также позволяет получить профили ДГГЕ для всех типов почв, однако число визуализированных полос и четкость сигнала в данном случае несколько ниже (рис. 4, Б).
Выводы
Таким образом, на основании полученных результатов пришли к заключению, что исследование каждого нового образца должно начинаться с подбора оптимальных условий экстракции препарата
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Arbeli Z, Fuentes C.L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples // FEMS Microbiol. Lett. 2007. Vol. 272. P. 269-275.
2. Borneman J., Skroch P.W, O'Sullivan K.M. et al. Molecular microbial diversity of an agricultural soil in Wisconsin // Appl. Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62. P. 1935-1943.
3. Freitag T.E., Chang L, Prosser J.I. Changes in the community structure and activity of betaproteobacterial ammonia-oxidizing sediment bacteria along a freshwater-marine gradient // Environ. Microbiol. 2006. Vol. 8. P. 684—696.
4. Griffiths R.I., Whiteley A.S., O'Donnell A.G., Bailey M.J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA and rRNA-based microbial community composition // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66, N 12. P. 5488—5491.
5. Grobkopf R., Stubner S., Liesack W. Novel euryar-chaeotal lineages detected on rice roots and in the anoxic bulk soil of flooded rice microcosms // Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64. P. 4983—4989.
ДНК, особенно для почв с высоким содержанием органических соединений, глинистых включений и разного уровня рН. На примере зональных почв европейской части России, которые имеют разные структуру, содержание гумусовых веществ и показатели рН, было проведено сравнение препарата ДНК, выделенного разными методами экстракции. Показано, что для кислых почв с выраженным процессом оподзоливания (дерново-подзолистая) наиболее эффективным методом выделения ДНК является метод R.I. Griffiths с соавт. [4]. Для менее кислых серых лесных почв лучшие результаты получены при использовании модифицированного нами протокола Griffiths и коллег [4]. Из почв, богатых гумусовыми веществами (чернозем) и глинистыми включениями (каштановая), удалось выделить качественный препарат ДНК, подходящий для дальнейших молекулярных исследований только при помощи коммерческих наборов реактивов. Амплификация фрагментов рибосомальных (16S rRNA) и функциональных (amoA) генов аммоний-окисляю-щих бактерий характеризовалась меньшей специфичностью к методу выделения ДНК в отличие от ПЦР-анализа аммоний-окисляющих архей. В целом качество препарата ДНК, выделенного коммерческими наборами реактивов или методом Griffiths с соавт. [4], незначительно влияло на эффективность ДГГЕ-анализа. Однако использование препарата ДНК, выделенного с помощью коммерческого набора реактивов, позволяет получить лучшие результаты ДГГЕ-анализа фрагментов amoA-генов ам-моний-окисляющих архей.
Авторы выражают искреннюю благодарность проф. Д.И. Проссеру и сотрудникам его лаборатории (Абердинский ун-т, г. Абердин, Великобритания) за помощь в проведении исследований.
6. Herrick J.B, Miller D.N, Madsen E.L, Ghiorse W.C. Extraction, purification, and amplification of microbial DNA from sediments and soils. In: PCR: essential techniques / Ed. by J.F. Burke. N.Y., 1996.
7. Holben W.E. Isolation and purification of bacterial DNA from soil // Methods of soil analysis. Pt. 2. Microbiological and biochemical properties / Eds. R.W. Weaver, S. Angle, P. Bottomley et al. Madison, Wisconsin, 1994.
8. Inceoglu O, Hoogwout E.F, Hill P., Elsas J.D van. Effect of DNA extraction method on the apparent microbial diversity of soil // Appl. Environ. Microbiol. 2010. Vol. 76, N 10. P. 3378-3382.
9. Knight I.T., Holben W.E, Tiedje J.M., Colwell R.R. Nucleic acid hybridization techniques for detection, identification, and enumeration of microorganisms in the environment // Microbial ecology: principles, methods and applications / Eds. M.A. Levin, R.J. Seidler, M. Rogul. N.Y., 1992.
10. Kuske C.R., Banton K.L., Adorada D.L. et al. Small-scale DNA sample preparation method for field PCR detec-
tion of microbial cells and spores in soil // Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64. P. 2463-2472.
11. Kowalchuk G.A., Stephen J.R, Boer W. de et al. Analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the b-subdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by denaturing gradient gel electrophoresis and sequencing of PCR-amp-lified 16S ribosomal DNA fragments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 1489-1497.
12. Lipthaya J.R, Enzingerb C, Johnsena K. et al. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electropho-resis // Soil Biol. Biochem. 2004. Vol. 36. P. 1607-1614.
13. Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.S. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, N 11. P. 4715-4724.
14. Muyzer G., Waal E.C. de, Uitterlinden A.G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59. P. 695-700.
15. Nicol G.W., Leininger S., Schleper C., Prosser J.I. The influence of soil pH on the diversity, abundance and transcriptional activity of ammonia oxidising archaea and bacteria // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 2966-2978.
16. Nicol G.W., Tscherko D., Embley T.M., Prosser J.I. Primary succession of soil Crenarchaeota across a receding glacier foreland // Environ. Microbiol. 2005. Vol. 7. P. 337—347.
17. Ochsenreiter T., Selezi D., Quaiser A. et al. Diversity and abundance of Crenarchaeota in terrestrial habitats studied by 16S RNA surveys and real time PCR // Environ. Microbiol. 2003. Vol. 5. P. 787—797.
18. Rojas-Herrera R., Narvaez-Zapata J., Zamudio-Maya M., Mena-Martines M.E. A simple silica-based method for metagenomic DNA extraction from soil and sediments // Mol. Biotechnol. 2008. Vol. 40, N 1.
19. Sinigalliano C.D., Kuhn D.N., Jones R.D. Amplification of the amoA gene from diverse species of ammonium-oxidizing bacteria and from an indigenous bacterial population from seawater // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61, N 7. P. 2702—2706.
20. Tourna M., Freitag T.E., Nicol G.W., Prosser J.I. Growth, activity and temperature responses of ammonia-oxidising archaea and bacteria in soil microcosms // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 1357—1364.
21. Yeates C., Gillings M.R., Davison A.D. et al. Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification // Biol. Proc. Online. 1998. Vol. 14, N 1. P. 40—47.
Поступила в редакцию 13.12.2010
COMPARATIVE ANALYSIS OF METHODS FOR ISOLATION
OF SOIL DNA FOR STUDYING DIVERSITY OF AMMONIUM-OXIDIZING
BACTERIA AND ARCHEA BY THE METHODS PCR—DGGE
A.S. Cherobaeva, A.L. Stepanov, I.K. Kravchenko
We have lead a comparative estimation of five methods including the author's modification, extraction and purification of DNA from soil for the further molecular analysis of the diversity of ammonia-oxidizing bacteria and archaea in soils. The experiments showed that the total amount of DNA distinguished in accord with applying methods of DNA extraction from different types of soil. The further molecular analysis (PCR—DGGE) of 16S rRNA and amoA genes has demonstrated significant differences in the community structure of ammonia-oxidizers corresponding to the applying methods of DNA extraction. The most acceptable results are received for the acid soil (soddy-podsol, gray-forest soils) when we used the method by Griffiths and colleagues with our own modification. On the other hand applying of DNA extraction KITs were efficiently for soils with humus and clay (chernozem, chestnuts soil). The results which we have received during molecular analysis of microbial communities in soil showed that for soils with high percentages of humus and clay compounds and different rates of pH level it seems to be necessarily to choose the most acceptable protocols for DNA extraction.
Key words: nitrification, ammonia-oxidizers, extraction DNA, DGGE, amoA.
Сведения об авторах. Черобаева Анна Сергеевна, аспирант 3-го года обучения каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ; тел.: (495)939-34-05, e-mail: annacherobaeva@gmail.com. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ; тел.: (495)939-34-05, e-mail: stepanov_aleksey@mail.ru. Кравченко Ирина Константиновна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН; тел.: (495)135-90-54, e-mail: irinakravchenko@inbox.ru
