CC BY
89
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №9/2016 ISSN 2410-700Х_
УДК: 575 : 631.523 : 579.25
В.И. Крюков
д.б.н., профессор, Н.Е. Павловская
д.б.н., профессор, зав. кафедрой, ОрёлГАУ, факультет БВМ г. Орёл, Российская Федерация
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧАСТОТ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ, СОДЕРЖАЩИХ И НЕ СОДЕРЖАЩИХ ГМО
Аннотация
Исследованы частоты клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме проростков кукурузы (Zea mays L.) двух сортов. Частоты аберраций составили 0,17% у геномодифицированного сорта «Pioneer» и 0,20% - у не содержащего ГМО сорта Награда 97. Установлено отсутствие статистически достоверных различий между этими величинами.
Ключевые слова
Кукуруза, мутагенез, анафазный метод, ГМО.
Введение
Кукуруза имеет большое хозяйственное значение как пищевая, кормовая и техническая культура. Зерно кукурузы используют для получения муки и крупы. Кукурузу применяют для приготовления пива, спирта, сиропов, масла. Высокое содержание питательных веществ делает кукурузу одним из лучших концентрированных кормов для сельскохозяйственных животных. Зелёную массу кукурузы используют для приготовления силоса, а также для получения биотоплива.
По мнению специалистов, кукуруза, как одна из наиболее урожайных и универсальных кормовых культур, пока ещё недооценена в Российской Федерации. Согласно статистическим данным Россия находится на 18 месте в мире по производству кукурузы. Российские растениеводы ставят перед собой задачу к 2020-му году вывести страну на четвертую позицию в мировом производстве этой культуры. Поэтому внедрение в производство высокопродуктивных, а также резистентных к вредителям и возбудителям болезней сортов является одним из основных путей достижения этой цели. Важная роль в повышении продуктивности кукурузы принадлежит современным методам биотехнологии и генной инженерии
Цель наших исследований - изучение степени цитогенетической стабильности растительных организмов, содержащих и не содержащих ГМО. В данной публикации изложены результаты сравнительного анализа частот аберраций хромосом в клетках корневой меристемы проростков кукурузы (Zea mays L.) не содержащего ГМО сорта традиционной селекции Награда 97 и геномодифицированного сорта «Pioneer».
Методы и материалы исследований
Материалом для исследования являлись делящиеся клетки корневой меристемы проростков двух сортов кукурузы (Zea mays L.), геномодифицированного сорт Pioneer и сорта классической селекции Награда 97. Семена проращивали. Корешки проростков отрезали и помещали в фиксатор в 12±0,5 часа пополудни. Для фиксации использовали смесь этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1 по объёму). После суточной фиксации корешки окрашивали 2 %-м раствором ацетоорсеина в течение 2-3 суток при комнатной температуре [3, с.98]. Временные препараты клеток готовили методом раздавливания тканей.
Для обеспечения корректности микроскопического анализа аберраций хромосом при ожидаемом низком их спонтанном уровне у интактных проростков одновременно был заложен условный
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №9/2016 ISSN 2410-700Х_
положительный контроль. Для этого семена сорта Награда 97 замачивали и проращивали в 0,5%-ном растворе азида натрия (NN3), приготовленного на дистиллированной воде. Цель получения препаратов из корневой меристемы таких проростков - контролировать реальную возможность обнаружения аберрантных ана- и телофаз.
Рисунок. Нормальные делящиеся клетки кукурузы и обнаруженные аномалии: а - нормальная метафаза; б - нормальная анафаза; в - одиночный фрагмент; г - парный фрагмент; д - одинарный мост; е - двойной мост.
б
а
в
Препараты анализировали с помощью микроскопа «AxюImager А1» с цифровой фотокамерой «ProgRes CFscan». Для определения митотического индекса выбирали участок препарата с интенсивной пролиферацией клеток и подсчитывали на этом участке все клетки, относя каждую к соответствующей фазе клеточного цикла. Затем на препарате находили все анафазы и ранние телофазы и учитывали аномалии в них.
Достоверность различий в частотах нарушений между сортами определяли после их ф-преобразования [4, с. 166].
Результаты и обсуждение
В обширной монографии по генетике кукурузы [10, с. 163] началом цитогенетических исследований кукурузы указывают 1929 год, когда Барбара Мак-Клинток опубликовала первую идиограмму этого растения [12, с.55]. Первое подробное описание соматических хромосом кукурузы, по-видимому, было сделано в работе Чи-Чанг Чена [8, с.752]. С тех пор цитогенетика этой культуры была детально изучена благодаря тому, что кариотип кукурузы имеет небольшое число (2п =20) хорошо отличимых друг от друга хромосом.
Помимо обычного кариотипа обнаружены у кукурузы обнаружены формы, в кариотипе которых больше 20-ти хромосом. Всекомпоненты нормального набора были обозначены как А-хромосомы. Дополнительные хромосомы были названы В-хромосомами. Морфологически В-хромосомы отличаются от А-хромосом и не гомологичны им. Происхождение и генетическая роль 5-хромосом до сих пор не выяснена. Их присутствие в небольшом количестве в клетках не влияет на жизнеспособность растений.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №9/2016 ISSN 2410-700Х_
Если же число В-хромосом достигает 10 и более, то у растений увеличивается число абортивных пыльцевых зёрен, снижается фертильность, появляются дефекты зерновок.
K. Kakeda с сотрудниками [11, с.265] разработали метод обработки препаратов хромосом, позволивший показать, что G-полосы присутствуют и в растительных хромосомах. Окраска хромосом кукурузы, полученная с помощью ферментативного метода мацерации и обработки трипсином или додецилсульфатом натрия, показала чёткие G-полосы. Опубликованы результаты дифференциального С-окрашивания хромосом [5, с.28; 17, с.140;]. Использование другого метода дифференциальной окраски позволило обнаружить новые варианты распределения гетерохроматина по длине хромосом [6, с. 517]. Позже эти авторы разработали метод получения препаратов митотических хромосом кукурузы с дифференциальной окраской высокого разрешения [7, с.417]. Использование метода FISH окрашивания хромосом позволило выявить дополнительные визуальные маркеры на хромосомах кукурузы [13, с.544; 16, с. 138].
Стабильность структуры кариотипа является условием стабильности сорта или всей культуры. Поэтому изучение изменчивости кариотипов сельскохозяйственных культур является важным аспектом селекционных исследований. Анализ наследуемых изменений хромосом у кукурузы был выполнен Г. Файлайоном и Д. Вэлденом [9, с.183]. Ориентировочные оценки спонтанной частоты аберраций хромосом могут быть получены из публикаций авторов, изучавших индуцированный мутагенез у кукурузы. Так, при исследовании радиосенсибилизирующего эффекта метронидазола частота аберрантных анафаз в интактных соматических клетках кукурузы контрольного варианта составила 3,1% [14, с.79].
Научных публикаций результатов, содержащих сравнительный анализ спонтанных частот возникновения аберраций хромосом у сортов кукурузы, полученных методами традиционной селекции и геномодифицированных сортов, очень немного. Это затрудняет анализ перспектив и использования сохранения геномодифицированных культур. По этой причине необходимо детальное исследование степени хромосомной стабильности соматических и генеративных клеток геномодифицированных сортов сельскохозяйственных растений и сравнение этих характеристик с характеристиками сортов, не содержащих ГМО.
В нашей работе анализ частоты аберраций предваряло исследование митотических индексов в корневых меристемах проростков обоих сортов. Митотический индекс в дополнительном контроле (воздействие 0,5%-ного азида натрия) не анализировали, т.к. это не входило в задачу исследования. Результаты анализа митотической активности в клетках корешков у проростков анализируемых сортов кукурузы приведены в таблице 1.
Таблица 1
Количества (верхняя строке) и частоты (%, нижняя строка) клеток находящихся на разных стадиях
клеточного цикла в корневой меристеме кукурузы
Сорт Всего Число клеток по фазам митоза Всего в митозе
клеток Профаза Метафаза Анафаза Телофаза
Награда 97 1195 59 4,9 32 2,7 17 1,4 21 1,8 129 10,8
Pioneer 1243 61 4,9 28 2,3 23 1,9 14 1,1 126 10,1
Митотический индекс клеток корневой меристемы кукурузы оказался равен 10,8% у сорта «Награда 97» и 10,1% - у растений сорта «Pioneer». Статистически достоверные различия между этими величинами отсутствуют. Такая же частота делящихся клеток (10,94%) была обнаружена в контрольном варианте растений кукурузы [18, с.799], но все эти три величины оказываются втрое выше митотического индекса (=3,4%), установленного в исследовании [15, с.53]. Учитывая тот факт, что митотический индекс в пролиферирующих тканях растений может сильно меняться в течение суток [2, с. 112] и очень чувствителен к внешним воздействиям на растения, такие различия в его величине можно рассматривать как лежащие в пределах нормы.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №9/2016 ISSN 2410-700Х_
В тканях проростков кукурузы, обработанных 0,5%-ным раствором азида натрия были обнаружены 20 аномальных клеток среди 537 проанализированных ана- и телофаз. Среди выявленных аномалий были 13 одиночных и 5 парных фрагментов, а также по одному одинарному и двойному мосту (табл. 2).
Таблица 2
Количества (верхняя строка) и частоты (%, нижняя строка) клеток с аномалиями в корневой меристеме
проростков кукурузы.
Сорт Анафаз Фрагментов Мостов
всего нормальных аномальных одиночных парных одинарных двойных
+Контроль 537 517 96,28 20 3,72 13 2,42 5 0,93 1 0,19 1 0,19
Награда 97 1023 1021 99,80 2 0,20 - 1 0,10 1 0,10 -
Pioneer 1206 1204 99,83 2 0,17 1 0,08 1 0,08 - -
Примечание: Несовпадение сумм % в сотых долях - результат округления.
У интактных растений кукурузы было обнаружено всего лишь по 2 аномалии из 1023 проанализированных анафаз у растений сорта Награда 97 и 1206 анафаз у растений сорта Pioneer. Среди обнаруженных аномалий были зарегистрированы один парный фрагмент и один одинарный мост в анафазах клеток растений сорта Награда 97 и по одному одинарному и парному фрагменту в анафазах клеток растений сорта «Pioneer». Других аномалий, а именно - множественных мостов, скученных (clamping), рассеянных, дезориентированных и липких хромосом не обнаружили.
Суммарные частоты аберрантных клеток в корневой меристеме оказались равными 0,20% и 0,17% у растений сортов Награда 97и Pioneer, соответственно. Рассчитанный U-критерий свидетельствовал об отсутствии статистически достоверных различий между частотами аберрантных клеток у проанализированных сортов кукурузы. Близкая по величине частота аберраций хромосом (0,13%) была обнаружена в работе [18, с.799]. В то же время автор другого исследования обнаружил у интактных растений 2,47% аберрантных клеток [15, с.53]. Такие различия в частотах, возможно, объяснит факт, установленный Богуславской Л.В. с сотрудниками, которые обнаружили, что частота аберрантных клеток изменятся от 1,0% на 5 день прорастания семян до 1,6% на 7 день, и даже до 3,3% на 9 день прорастания [1, с.17].
Таким образом, в результате проведённых исследований нами установлено отсутствие статистически достоверных различий в частотах аберраций хромосом в соматических клетках корневой меристемы проростков двух сортов кукурузы, один из которых имел в геноме ГМО, а у другого сорта ГМО отсутствовали. Следовательно, наличие в геноме растений ГМО не изменяет кариотипическую стабильность, по крайней мере, у сорта кукурузы «Pioneer».
Поскольку и митотический индекс, и спонтанная частота аберраций хромосом в корневой меристеме проростков кукурузы оказывается очень вариабельной и сильно зависит от влияния внешних факторов, то в дальнейшем для проведения сравнительного анализа от исследователей потребуется стандартизация условий выполнения таких анализов. Стандартизировать потребуется, как минимум, сроки получения тканей от момента прорастания (или замачивания) семян, температуру среды и условия освещённости, которые могут влиять на циркадные ритмы частоты митоза. Без такой стандартизации разброс данных, получаемых разными исследователями, будет всегда широким, что окажется препятствием для правильного понимания исследуемых закономерностей хромосомного мутагенеза у кукурузы.
Принимая во внимание недостаточность информации о хромосомной нестабильности у многих используемых сортов кукурузы, целесообразно провести сравнительный анализ хромосомного мутагенеза у всех сортов кукурузы, выращиваемых в Орловской области, независимо от наличия в них ГМО. Объясняется это тем, что различные сорта одной и той же сельскохозяйственной культуры могут иметь различную степень спонтанного хромосомного мутагенеза, а также различно реагировать на мутагенные
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №9/2016 ISSN 2410-700Х_
факторы. Проведение подобных исследований можно рекомендовать для характеристики сортов различных культур, создаваемых и исследуемых во ВНИИ ЗБК и ФГБНУ ВНИИСПК.
Работа выполнена в ИНИИЦ ОрёлГАУ по заданию и при финансовой поддержке МСХ РФ.
Вывод
Частоты клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме проростков кукурузы (Zea mays L.) составили 0,17% у геномодифицированного сорта «Pioneer» и 0,20% - у сорта Награда 97, не содержащего ГМО. Эти величины не имеют статистически достоверных различий. Список цитированной литературы
1. Богуславская Л. В. и др. Цитогенетические изменения в апикальной меристеме корня кукурузы при действии ионов никеля / Л. В. Богуславская. Н. Ф. Павлюкова. А. Н. Винченко // Вюник Дншропетровського ушверситету. Бюлопя, еколопя. 2006, Т. 2, № 14. -С. 17-20.
2. Козак М.Ф. Вопросы эволюционной морфологии и цитогенетики сои. Монография. -Астрахань: Издат. дом «Астраханский университет». 2004. -166 с.
3. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. -М.: «Агропромиздат», 1988. - 280 с.
4. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. -М.: Медицина, 1975.-295 с.
5. Aguiar Perecin M.L.R. C-Banding in Maize. I. Band Patterns. / Margarida L. R. De Aguiar Perecin // Caryologia, 1985. V. 38, № 1. -P. 23-30.
6. Carvalho R.C. and Saraiva L.S. A new heterochromatin banding pattern revealed by modified HKG banding technique in maize chromosomes. / Roberto De Carvalho, Carlos; Sergio Saraiva, Luiz, // Heredity. 1993. V.70, № 5. -P 515-519.
7. Carvalho C.R. and Saraiva L.S. High-resolution HKG-banding in maize mitotic chromosomes / Carlos Roberto de Carvalho, Luiz Sergio Saraiva // Journal of Plant Research, 1997, V. 110, № 4. -P. 417-420.
8. Chen C.-C. The somatic chromosomes of maize / Chi-Chang Chen // Canadian Journal of Genetics and Cytology, 1969, V. 11, № 3. -P. 752-754.
9. Filion G.W., Walden D.B. Karyotype analysis: the detection of chromosomal alterations in the somatic karyotype of Zea mays L. / W. Gary Filion and David B. Walden // Chromosoma (Berl.), 1973. V. 41. -P. 183-194.
10. Handbook of Maize. Genetics and Genomics. / Jeffrey L. Bennetzen, Sarah Hake (Editors). - Springer Science & Business Media, 2009. -779 p.
11. Kakeda K et al. High resolution bands in maize chromosomes by G-banding methods / K. Kakeda, H. Yamagata, K. Fukui, M. Ohno, K. Fukui, Z. Z. Wei, E. S. Zhu // Theoret. and Appl. Genetics. 1990, V. 80, № 2, -P. 265-272.
12. McClintock, Barbara. A method for making aceto-carmin[e] smears permanent. // Stain Technology 1929. V. IV, №2. -P 53-56.
13. Mondin M. et al. Karyotype variability in tropical maize sister inbred lines and hybrids compared with KYS standard line / Mateus Mondin, Janay A. Santos-Serejo, Monica R. Bertáo, Prianda Laborda, Daniel Pizzaia, and Margarida L. R. Aguiar-Perecin. //Front. Plant Sci. 2014; V.5. -P. 544.
14. Oliveira F.A and Viccini L.F. Induction of maize chromosome altered plants by seeds irradiation pre-soaked in metronidazole / Fabricio Alves De Oliveira and Lyderson Facio Viccini // Caryologia. 2004. V. 57, № 1. -P. 79-87.
15. Rácuciu M. 50 Hz frequency magnetic field effects on mitotic activity in the maize root / Mihaela Rácuciu // Romanian J. Biophys., Bucharest, 2011. V. 21, № 1, -P. 53-62.
16. Realini M.F. et al. Intra-specific variation in genome size in maize: cytological and phenotypic correlates / María Florencia Realini, Lidia Poggio, Julián Cámara-Hernández, and Graciela Esther González // AoB Plants. 2016; V.8: -P. 138. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4742330/
17. Sachan J.K.S., Tanaka R. Short communication a banding method for Zea chromosomes / J. K. S. Sachan and Ryuso Tanaka // Japan. J. Genetics. 1976. V. 51, № 2. -P. 139-141.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №9/2016 ISSN 2410-700Х_
18. Tanase C. et al. Cytogenetical effect of some polyphenol compounds separated from industrial by-products on maize (Zea mays L.) plants / Corneliu Tanase, Csilla Iuliana Bara and Valentin I. Popa // Cellulose Chem. Technol., 2015 V. 49 № 9-10. -P. 799-805.
© Крюков В.И., Павловская Н.Е., 2016
УДК: 59(470.345)
Ручин Александр Борисович
д.б.н., директор
Мордовский государственный природный заповедник имени П.Г. Смидовича, пос. Пушта E-mail: sasha_ruchin@rambler.ru
К МОНИТОРИНГУ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ МОРДОВИИ, ЗАНЕСЕННЫХ В РЕГИОНАЛЬНУЮ КРАСНУЮ КНИГУ
Аннотация
Представлены сведения о новых находках 14 видах позвоночных животных Мордовии, включенных в региональную красную книгу и красную книгу России, а также сведения о 2 видах, требующих постоянного контроля в природе.
Ключевые слова
Редкие виды, Красная книга, Мордовия, позвоночные.
С момента выхода Красной книги Республики Мордовия [6] и дополнительного списка [10] проводится постоянный мониторинг видов. Ежегодно издаются сводки о новых находках и изучении популяций редких видов [1-5, 7-15 и мн. др.]. В этой статье представлены данные 2013-2016 гг. Использовались традиционные методы сбора и учетов животных (наблюдения, по следам, отловы почвенными ловушками), а также учеты с помощью фотоловушек разных типов.
ВИДЫ, ВКЛЮЧЕННЫЕ В КРАСНУЮ КНИГУ РЕСПУБЛИКИ МОРДОВИЯ (*- ВИДЫ ВКЛЮЧЕНЫ ТАКЖЕ В КРАСНУЮ КНИГУ РФ) ПОЗВОНОЧНЫЕ КЛАСС ЗЕМНОВОДНЫЕ - AMPHIBIA ОТРЯД ANURA - БЕСХВОСТЫЕ Семейство Bufonidae - Жабы
Жаба серая [Bufo bufo (Linnaeus, 1758)]. Категория 3 - редкий вид. Зарегистрированы встречи вида в Темниковском районе (окр. д. Чумартово, 16.VII.2016; окр. с. Русское Караево, 16.VII.2016; окр. п. Красный, 17.VII.2016; окр. с. Пурдошки, 13.VIII.2016; окр. д. Бочино, 13.VIII.2016), в Ельниковском районе (окр. с. Новоямская Слобода, 20.VIII.2016).
Семейство Ranidae - Лягушки
Лягушка травяная [Rana temporaria Linnaeus, 1758]. Категория 3 - редкий вид. Зарегистрированы встречи вида в Ельниковском районе (окр. с. Новоямская Слобода, 23.VII.2016).
КЛАСС ПРЕСМЫКАЮЩИЕСЯ - REPTILIA
ОТРЯД ЧЕРЕПАХИ - TESTUDINES Семейство Пресноводные черепахи - Emydidae
Черепаха болотная [Emys orbicularis (Linnaeus, 1758)]. Категория 4 - неопределенный вид. Одна особь обнаружена в августе 2016 г. в с. Большие Березники недалеко от р. Саляевка. По опросам местных жителей, никто из ближайших домов на улице не держал у себя черепах. Сложно сказать, откуда она
