CC BY
107
34. SrivastavaD. K., HusainI., Arteaga C. L., Wilson S. H. Carcinogenesis. - 1999; 20: 1049-54.
35. Tissier A., McDonald J. P., Frank E. G., Woodgate R. Genes Dev. 2000; 14: 1642-50.
36. Wang T. S, EichlerD. C, Korn D. Biochemistry. 1977; 16: 4927-34.
37. Zhang Y, Yuan F., Wu X., Wang Z. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 7099-10.
Поступила 05.09.12
EFFECT OF MN(II) ON THE ERROR-PRONE DNA POLYMERASE IOTA ACTIVITY IN EXTRACTS FROM HUMAN NORMAL AND TUMOR CELLS
A. V. Lakhin1, A. S. Efremova1,I. V. Makarova1, E. E. Grishina2, S. I. Shram1, V. Z. Tarantul1, and L. V. Gening1
1 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2 Ophthalmological Clinical Hospital, Moscow Department of Health, Moscow, Russia
The DNA polymerase iota (Pol i), which has some peculiar features and is characterized by an extremely error-prone DNA synthesis, belongs to the group of enzymes preferentially activated by Mn2+ instead of Mg2+. In this work, the effect of Mn2+ on DNA synthesis in cell extracts from a) normal human and murine tissues, b) human tumor (uveal melanoma), and c) cultured human tumor cell lines SKOV-3 and HL-60 was tested. Each group displayed characteristic features of Mn-dependent DNA synthesis. The changes in the Mn-dependent DNA synthesis caused by malignant transformation of normal tissues are described. It was also shown that the error-prone DNA synthesis catalyzed by Pol i in extracts of all cell types was efficiently suppressed by an RNA aptamer (IKL5) against Pol i obtained in our work earlier. The obtained results suggest that IKL5 might be used to suppress the enhanced activity of Pol i in tumor cells.
Key words: DNA polymerase iota, melanoma, aptamer, mutagenesis
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.831-005-036.11-054]:577.21.08
Т. В. Тупицына1*, Е. А. Бондаренко1, С. А. Кравченко3, П. Ф. Татарский3, И. М. Шетова2, Н. А. Шамалов2, С. М. Кузнецова4, Д. В. Шульженко4, В. И. Скворцова5, П. А. Сломинский1,
Л. А. Лившиц3, С. А. Лимборская1
сравнительный анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA и ace с риском развития инсульта в русской и украинской
популяциях
1ФГБУ науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва; 2ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, кафедра фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии, Москва; 'Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев; 4Государственное учреждение Институт геронтологии им. Д. Ф. Чеботарёва НАМН Украины, Киев; 5Министерство здравоохранения Российской Федерации, Москва
Проведен сравнительный анализ ассоциаций между G20210A полиморфизмом гена F2, G1691A полиморфизмом гена F5, -5Т/С полиморфизмом гена GP1BA, инсерционно-делеционным (I/D) полиморфизмом гена ACE и риском развития инсульта в двух этнических выборках - русской и украинской популяциях. Показано, что в русской популяции у лиц с генотипом DD риск развития ишемического инсульта повышен (ОШ = 1,4, 95% ДИ [1,05; 1.78], р = 0,02), в то время как генотипы I/I и I/D ассоциированы с пониженным риском развития ишемического инсульта (ОШ = 0,7, 95% ДИ [0.56; 0,95], р = 0,02). В украинской этнической выборке различия в распределении частот генотипов и аллелей между больными с инсультом и лицами контрольной группы по данному полиморфному локусу не являются статистически достоверными и I/D полиморфизм гена ACE не ассоциирован с риском развития инсульта в украинской популяции (ОШ = 0,8, 95% ДИ [0,48; 1,32], р = 0,45). G20210A полиморфизм гена F2, G1691A полиморфизм гена F5, -5Т/С полиморфизм гена GP1BA не ассоциированы с риском инсульта в обеих этнических выборках.
Инсульт - сложное заболевание, характеризующееся множеством этиологических факторов, вовлеченных в его патогенез, и разнообразием клинических проявлений. Сочетание генетических и средовых
факторов определяет развитие той или иной формы инсульта, влияет на клиническую картину заболевания, его течение, тяжесть и исход. Ежегодно в России переносят инсульт более 450 тыс. человек, в мире эта цифра приближается к 6 млн, и в структуре общей смертности инсульт занимает второе место, уступая лишь кардиоваскулярной патологии [1].
Одним из основных пусковых факторов в каскаде патогенетических реакций, приводящих к развитию инсульта, является эндотелиальная дисфункция. Ее важнейшая причина - хроническая гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, одним из главных компонентов которой является ангиотен-зинпревращающий фермент (ACE). В 16-м интро-не гена ACE был идентифицирован инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм, который заключается в наличии (аллель I) или отсутствии (аллель D) A/u-повтора [29]. Были охарактеризованы распределения частот генотипов и аллелей по этому полиморфному участку гена ACE в популяциях разных народов. Обнаружены межпопуляционные различия в распределении частот генотипов и аллелей по I/D полиморфизму гена ACE [6, 12, 14, 19].
Известно, что конечным этапом патогенеза атеросклероза при развитии цереброваскулярных заболеваний является формирование тромба. К тромбозу раз-
личных кровеносных сосудов, в том числе и артерии головного мозга, может приводить патологическая гиперактивация свертывающей системы крови. Ген F2 кодирует коагулирующий фактор II - протромбин, который входит в состав сложного комплекса белков, образующих свертывающую систему крови, и является одним из ее главных компонентов. В ходе протеолиза протромбина образуется тромбин. S. Роой и соавт. описали полиморфный локус G20210A, расположенный в З'-фланкирующей области гена F2 [22]. Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что аллель А по G20210A полиморфизму гена F2 является фактором повышенного риска развития венозного тромбоза в различных популяциях [10, 17, 20, 23]. Однако в некоторых исследованиях такой ассоциации найдено не было [2].
Коагулирующий фактор V ^5) секретируется в результате активации тромбоцитов. В гене F5 был обнаружен полиморфный локус G1691A (мутация Лейдена). Замена G на А в положении 1691 гена F5 приводит к замене Arg506Gln в белковой молекуле. Мутация Лейдена ассоциирована с устойчивостью к активированному протеину С - ингибитору F5, и является причиной гиперкоагуляционной активности F5, что может приводить к развитию тромбозов. Данная замена встречается в случайных выборках с частотой от 2 до 15 и до 60% у некоторых пациентов с венозными тромбозами в анамнезе [8].
Гликопротеин 1Ь ^РШ) - тромбоцитарный белок, экспрессирующийся на поверхности клеточной мембраны. Гликопротеин 1Ь
факторов риска инсульта важную роль может играть этническая составляющая с учетом того, что наблюдаются значительные межэтнические различия в распределении генотипов и аллелей однонуклеотидных полиморфизмов генов в разных популяциях. В связи с этим в настоящем исследовании был проведен сравнительный анализ ассоциаций между G20210A полиморфизмом гена F2, G1691A полиморфизмом гена F5, -5Т/С полиморфизмом гена GP1BA, I/D полиморфизмом гена ACE и риском развития инсульта в двух близких этнических выборках - русской и украинской популяциях.
Материалы и методы
Для проведения молекулярно-генетического анализа полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA, ACE были сформированы 4 выборки: выборка больных инсультом из русской популяции (n = 1234 человека, 611 женщин и 623 мужчины, средний возраст 67,6 ± 12,3 года); контрольная выборка из русской популяции (n = 667 человек, 359 женщин и 308 мужчин, средний возраст 46,3 ± 11,4 года); выборка больных с инсультом из украинской популяции (n = 216 человек, 102 женщины и 114 мужчин, средний возраст 64,6 ± 9,1 года) и контрольная выборка из украинской популяции (n = 100 человек, 50 женщин и 50 мужчин, средний возраст 30,2 ± 7,6 года).
Для проведения анализа использовали препараты ДНК, полученные из 3 мл венозной крови. Выделение геномной ДНК проводили с использованием набора AxyPrep™ Blood Genomic DNA Midiprep Kit (Axygen, США) согласно рекомендациям производителя.
входит в состав глико-протеинового комплекса GPIb/IX/V, который функционирует как рецептор для фактора фон Вилле-бранда (VWF). VWF -плазменный гликопротеин, играющий центральную роль в гемостазе. В 5'-нетранслируемой области гена GP1BA, кодирующего a-субъединицу гликопротеина Ib (GPlba), обнаружен полиморфный локус - замена Т на С в положении -5 от инициа-торного кодона ATG --5Т/С полиморфизм [13]. Данная замена приводит к нарушению регулятор-ной последовательности (элемент Козак), что оказывает влияние на эффективность трансляции.
Результаты исследований по изучению влияния полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA и ACE на риск развития инсульта не являются однозначными [4, 5, 9, 15, 16, 31]. Возможно, это связано с тем, что при рассмотрении проблемы
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, температурный режим проведения
амплификации
Ген
Полиморфизм
Последовательность праймеров (5'^3') Последовательность зондов (5'^3')
Температурный режим
F2
^G20210A
F5
^G1691A (p.Arg506Gln)
TTTTGTGTTTCTAAAACTATGGTTCCC AGAGAGCTGCCCATGAATAGC ROX-TGACTCTCAGCGAGCCTCAATGC-BHQ2 FAM-TGACTCTCAGCAAGCCTCAATGC-BHQ1
CAGAATTTCTGAAAGGTTACTTCAAGG CTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGC ROX-ACCTGTATTCCTCGCCTGTCCAGG-BHQ2 FAM-ACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGG-BHQ1
GP1BA -5T/C (Kozak) GGGATGCTTCCTGGGGATGC GCAGCAGGAGCAGCAAGAGG ROX-TTGCCCACAGGTCCTCATGCCT-BHQ2 FAM-TTGCCCACAGGCCCTCATGCCT-BHQ1
ACE
I/D
CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT
50°С - 3 мин 95°С - 10 мин 95°С - 15 с
68°С - 50 с, 40 циклов 72°С - 30 с 25°С - 2 мин 50°С - 3 мин 95°С - 10 мин 95°С - 15 с
65°С - 50 с, 40 циклов 72°С - 30 с 25°С - 2 мин 50°С - 3 мин 95°С - 10 мин 95°С - 15 с
68°С - 50 с, 40 циклов
72°С - 30 с
25°С - 2 мин
95°С - 5 мин
95°С - 1 мин
58°С - 1 мин, 30 циклов
72°С - 1 мин
25°С - 2 мин
Полиморфные аллели гена ACE были исследованы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Фрагменты, полученные в результате ПЦР, анализировали под УФ-светом после проведения вертикального электрофореза в 6% полиа-криламидном геле. Полиморфные аллели генов F2, F5, GP1-BA исследовали методом ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии TaqMan. ПЦР проводили на ам-плификаторе StepOnePlus фирмы Applied Biosystems. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10x ПЦР-буфера ("Синтол", Россия); 2,5 мкл 25 мМ MgCl2; 2,5 мкл 2,5 мМ раствора dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 10 пМ каждого праймера (для всех исследованных генов); 4 пМ каждого зонда (для генов F2, F5, GP1BA); 1,25 ед. HotTaq-полимеразы ("Синтол", Россия); 0,1-0,2 мкг геномной ДНК и деионизированной воды до 25 мкл. Последовательности праймеров и зондов, а также температурный режим проведения амплификации для каждого исследуемого полиморфного локуса приведены в табл. 1.
При статистической обработке полученных данных использовали программное обеспечение MS Excel 2007 (Microsoft, США) и программы GraphPad InStat3 (http://www. graphpad.com/), с помощью которой определяли величину критерия х2 (хи квадрат) и показателя отношения шансов (ОШ). Достоверными считали значенияp < 0,05.
Результаты и обсуждение По всем исследованным полиморфным локусам распределение генотипов и аллелей в обеих популяциях соответствует закону Харди-Вейнберга у больных и в контрольной группе.
В табл. 2 представлены результаты генотипирова-ния G20210A полиморфного локуса гена F2 у больных инсультом и в контрольных группах из русской и украинской популяций.
Как в группе больных, так и в контрольной группе из русской популяции с наибольшей частотой встречается генотип G/G, причем в выборке пациентов на-
Таблица 2
Сравнительный анализ генотипов и аллелей по G20210A полиморфному локусу гена Г2 у больных с инсультом и у лиц контрольной группы в русской и украинской популяциях
Варианты генотипов и аллелей Русская этническая выборка Украинская этническая выборка
больные контроль Р больные контроль Р
n=1234 частота, % n=717 частота, % n=216 частота, % n=100 частота, %
F2 G/G 1214 98,3 700 97,6 0,32 207 95,8 97 97,0 0,85
F2 G/A 20 1,7 17 2,4 9 4,2 3 3,0
F2 A/A 0 0 0 0 0 0 0 0
F2 G 2448 99,2 1417 98,8 423 97,9 197 98,5
0,32 0,85
F2 A 20 0,8 17 1,2 9 2,1 3 1,5
Таблица 3
Сравнительный анализ генотипов и аллелей по G1691A полиморфному локусу гена Г5 у больных с инсультом и у лиц контрольных групп в русской и украинской популяциях
Вариан- Русская этническая выборка Украинская этническая выборка
ты гено- больные контроль Р больные контроль
аллелей n=1234 частота, % n=477 частота, % n=216 частота, % n=100 частота, % Р
F5 G/G 1200 97,2 463 97,1 0,97 208 96,3 98 98,0 0,65
F5 G/A 34 2,8 14 2,9 8 3,7 2 2,0
F5 A/A 0 0 0 0 0 0 0 0
F5 G F5 A 2434 34 98,6 1,4 940 14 98,5 1,5 0,97 420 8 98,1 1,9 198 2 99,0 1,0 0,64
блюдается незначительное повышение частоты этого генотипа (на 0,7%) по сравнению с контролем. Частота аллеля G также выше в выборке больных, в то время как частота аллеля A повышена в контрольной группе. Однако выявленные нами различия в распределении частот генотипов и аллелей по G20210A полиморфизму гена F2 между больными с инсультом и контрольной группой не являются статистически достоверными (для генотипов %2 = 1,00, р = 0.32; для аллелей %2 = 0,99, р = 0,32; см. табл. 2). Из полученных данных можно сделать вывод о том, что G20210A полиморфизм гена F2 не ассоциирован с риском развития инсульта в русской популяции (ОШ = 0,7, 95% ДИ [0,35; 1,30]).
В украинской популяции в выборке больных повышена частота генотипа G/A и аллеля A, а в контрольной группе наблюдается незначительное повышение частоты генотипа G/G и аллеля G. Однако так же, как и в русской популяции, в украинской популяции различия в распределении частот генотипов и аллелей по данному полиморфному локусу между больными с инсультом и контрольной группой не являются статистически достоверными (для генотипов %2 = 0,04, р = 0,85; для аллелей %2 = 0,03, р = 0,85) (см. табл. 2).
В результате проведенного исследования ни среди больных, ни в контрольной группе в обеих этнических выборках мы не выявили лиц с генотипом A/A. Это связано с низкой частотой данного генотипа (по данным популяционных исследований среди европейских популяций редкий аллель A встречается с частотой от 1 до 2,5% [24]).
В исследованиях, проведенных нами ранее, в украинской популяции были установлены статистически достоверные различия по частоте генотипа G/A в группе больных с ишемическим инсультом в сравнении со специальной контрольной группой индивидов пожилого возраста (73,9 ± 6,4 года), среди которых не было случаев ишемического инсульта. Важно отметить, что в данной контрольной группе не было выявлено ни одного носителя полиморфного аллеля А. Таким образом, можно предположить, что но-сительство аллеля А может быть фактором риска ишемического инсульта.
В табл. 3 представлены результаты сравнительного анализа частот генотипов и аллелей по G1691A полиморфному локу-су гена F5 у больных с инсультом и у лиц контрольных групп в русской и украинской популяциях.
Как в группе больных с инсультом, так и
Таблица 4
Сравнительный анализ генотипов и аллелей по -5T/C (Kozak) полиморфному локусу гена GP1BA у больных с инсультом и у лиц контрольных групп в русской и украинской популяциях
Вариан- Русская этническая выборка Украинская этническая выборка
ты гено- больные контроль p больные контроль
аллелей n=1234 частота, % n=717 частота, % n=216 частота, % n=100 частота, % p
-3T/T 890 72,1 338 73,0 0,26 174 80,6 76 76,0 0,44
-3T/C 319 23,9 162 22,6 42 19,4 24 24,0
-3C/C 23 2,0 17 2,4 0 0 0 0
-3T -3C 2099 369 83,0 13,0 1238 196 86,3 13,7 0,29 390 42 90,3 9,7 176 24 88,0 12,0 0,46
в контрольных, в обеих популяционных выборках с наибольшей частотой встречается генотип G/G, причем в русской этнической выборке частоты генотипов G/G и G/A, а также частоты аллелей G и A у больных практически совпадают с таковыми в контроле (для генотипов и аллелей х2 = 0,001, р = 0,97), в то время как в выборке украинского этноса у больных наблюдается незначительное снижение частоты генотипа G/G и аллеля G и повышение частоты генотипа G/A и аллеля A по сравнению с контрольной группой, однако данные различия не являются статистически достоверными (для генотипов %2 = 0,21, р = 0,65; для аллелей %2 = 0,22, р = 0,64) (см. табл. 3). В результате проведенного исследования ни среди больных, ни в контрольных группах мы не выявили лиц с генотипом A/A. Это связано с низкой частотой встречаемости данного генотипа. Таким образом, нами было показано, что G1691A полиморфный локус гена F5 не ассоциирован с риском развития инсульта в обеих исследованных популяциях (для русской популяции ОШ = 0,9, 95% ДИ [0,50; 1,76]; для украинской популяции ОШ = 1,9, 95% ДИ [0,40; 8,97]).
В табл. 4 приведены результаты генотипирования -5T/C (Kozak) полиморфного локуса гена GP1BA у больных с инсультом и в контрольных группах русской и украинской этнических выборок.
При изучении распределения частот генотипов и аллелей в группе больных с инсультом и в контрольной группе из русской популяции не было установлено статистически достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей по -5T/C (Kozak)
полиморфному локусу гена GP1BA между этими двумя группами (для генотипов X2 = 2,73, р = 0,26; для аллелей х2 = 1,11, р = 0,29) (см. табл. 4). При изучении влияния данного полиморфизма на риск развития инсульта нами было показано, что замена Т на С в регуляторной последовательности гена GP1BA не ассоциирована с риском развития инсульта в русской популяции (ОШ = 1,1, 95% ДИ [0,92; 1,34]). Аналогичные данные были получены и в украинской популяции (для генотипов X2 = 0,60, р = 0,44; для аллелей х2 = 0,53; р = 0,46; ОШ = 0.8, 95% ДИ [0,46; 1,35]) (см. табл. 4).
В табл. 5 показаны результаты генотипирования I/D полиморфного локуса гена ACE у больных инсультом и в контрольных группах, а также результаты анализа его влияния на риск развития инсульта в русской и украинской этнических популяциях. В результате проведенных исследований было показано, что в русской популяции у лиц с генотипами I/I и I/D наблюдается снижение риска развития инсульта по сравнению с носителями D/D генотипа (ОШ = 0,8, 95% ДИ [0,59; 0.98], р = 0,04) (см. табл. 5). В украинской этнической выборке различия в распределении частот генотипов и аллелей между больными с инсультом и лицами контрольной группы по данному полиморфному ло-кусу не являются статистически достоверными и I/D полиморфизм гена ACE не ассоциирован с риском развития инсульта в украинской популяции (ОШ = 0,8, 95% ДИ [0,48; 1.32], р = 0,45) (см. табл. 5).
В данном исследовании нами также был проведен сравнительный анализ генотипов и аллелей по всем исследованным полиморфным локусам между больными с ишемическим подтипом инсульта (1009 человек из русской популяции, 183 человека из украинской популяции) и контрольной выборкой, а также между больными с геморрагическим подтипом инсульта (222 человека из русской популяции, 33 человека из украинской популяции) и контрольной выборкой, и,
Таблица 5
Сравнительный анализ генотипов и аллелей по 1/0 полиморфному локусу гена ACE у больных с инсультом и у лиц контрольных
групп в русской и украинской популяциях
Вариан- Русская этническая выборка Украинская этническая выборка
ты гено- больные контроль ОШ ДИ больные контроль ОШ ДИ
аллелей n=1100 частота, % n=438 частота, % p n=216 частота, % n=100 частота, % p
I/I 244 22,2 109 23,8 0,11 36 23,9 18 18,0 0,08
I/D 332 30,2 246 33,7 82 38,0 31 31,0
D/D 304 27,6 103 22,3 78 36,1 31 31,0
I/I+I/D D/D 796 304 72,4 27,6 333 103 77,3 22,3 0,04 0,8 [0,39; 0,98] 138 78 63,9 36,1 69 31 69,0 31,0 0,43 0,8 [0,48; 1,32]
I D 1040 1160 47,3 32,7 464 432 30,7 49,3 0,09 1,1 [0,98; 1,34] 194 238 44,9 33,1 87 113 43,3 36,3 0,81 1,0 [0,76; 1,48]
Таблица 6
Сравнительный анализ генотипов и аллелей по 1/0 полиморфному локусу гена АСЕ у больных с ишемическим инсультом (ИИ) и у
лиц контрольных групп в российской и украинской популяциях
Вариан- Русская этническая выборка Украинская этническая выборка
ты гено- больные ИИ контроль ОШ ДИ больные ИИ контроль р ОШ ДИ
аллелей n=903 частота, % n=458 частота, % р n=183 частота, % n=100 частота, %
I/I 197 21,8 109 23,8 0,06 44 24,1 18 18,0 0,16
I/D 449 49,7 246 53,7 72 39,3 51 51,0
D/D 257 28,5 103 22,5 67 36,6 31 31,0
I/I+I/D D/D 646 257 71,5 28,5 355 103 77,5 22,5 0,02 0,7 [0,56; 0,95] 116 67 63,4 36,6 69 31 69,0 31,0 0,41 0,8 [0,46; 1,31]
I D 843 963 46,7 53,3 464 452 50,7 49,3 0,05 1,2 [1,00; 1,38] 160 206 43,7 56,3 87 113 43,5 56,5 0,96 1,0 [0,71; 1,31]
кроме того, между выборками больных с инсультом, больных с ишемическим инсультом, больных с геморрагическим инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу.
В результате проведенного анализа нами были выявлены статистически достоверные различия в распределении частот генотипов по I/D полиморфному локусу гена ACE между больными с ишемическим подтипом инсульта и контрольной группой в русской популяции. Полученные данные представлены в табл. 6.
У больных с ишемическим инсультом наблюдается достоверное повышение частоты генотипа D/D и понижение частоты генотипов I/I и I/D по сравнению с контрольной группой. Генотипы I/I и I/D ассоциированы с пониженным риском развития ишемическо-го подтипа инсульта в русской популяции (ОШ = 0,7, 95% ДИ [0,56; 0.95], р = 0,02). Возможно, результаты, связанные с этой группой больных, внесли вклад в выявленную ассоциацию в общей группе больных с инсультом в русской популяции. В украинской популяции у больных с ишемическим инсультом также наблюдается повышение частоты генотипа D/D (36,6%) по сравнению с контрольной группой (31,0%), однако выявленные различия не являются статистически достоверными (ОШ = 0,8, 95% ДИ [0,46; 1,31], р = 0.41; см. табл. 6).
При изучении распределения частот генотипов и аллелей по I/D полиморфизму гена ACE в русской и украинской популяциях между больными с геморрагическим подтипом инсульта и контрольной выборкой, а также между выборками больных с инсультом, больных с ишемическим инсультом, больных с геморрагическим инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу, не было установлено статистически достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей по данному полиморфному локусу между исследуемыми выборками (р > 0,05). Также было установлено, что G20210A полиморфизм гена F2, G1691A полиморфизм гена F5, -5Т/С полиморфизм гена GP1BA не ассоциированы с риском развития ишемического подтипа инсульта, геморрагического подтипа инсульта, а также ишеми-ческого и геморрагического инсульта у женщин, ише-мического и геморрагического инсульта у мужчин как в русской, так и в украинской популяциях (р > 0,05).
Таким образом, результаты представленных выше
исследований по изучению влияния полиморфных локусов генов F2, F5, GP1BA и ACE на риск развития инсульта показывают, что три из изученных ло-кусов напрямую не ассоциированы с риском данного заболевания в двух этнически родственных группах. В то же время в других популяциях были обнаружены такие ассоциации. В ряде работ были выявлены положительные ассоциации G20210A полиморфизма гена F2 с риском развития транзиторных ишемических атак, ишемического инсульта, кардиоэмболического инсульта [7, 16, 21]. В ряде других исследований были обнаружены положительные ассоциации между G1691A полиморфизмом гена F5 и риском развития ишемического инсульта [16, 18, 25]. Эти данные были подтверждены в мета-анализах [9, 33]. Однако в широкомасштабном мультилокусном ассоциативном исследовании не обнаружено достоверных ассоциаций между данным полиморфизмом и инсультом [15]. В настоящее время известно не очень много работ, посвященных изучению влияния полиморфных вариантов гена GP1BA на риск развития цереброваскуляр-ной патологии и на тяжесть течения данной группы заболеваний. В ряде исследований было показано, что -5Т/С полиморфизм данного гена ассоциирован с повышенным риском развития ишемического инсульта в некоторых популяциях [4, 11, 27, 28].
Что касается локуса ACE, то было обнаружено, что I/D полиморфизм этого гена ассоциирован с уровнем фермента в крови, лимфе и тканях. Активность ACE сравнительно выше у гомозиготных по аллелю D лиц, чем у лиц с гетерозиготным генотипом и гомозиготных по аллелю I лиц [32]. Мета-анализ 29 исследований показал, что у лиц с генотипом I/D уровень фермента в плазме крови повышен на 31%, а у лиц с генотипом D/D - на 58% по сравнению с носителями генотипа I/I [30]. Обнаружение ассоциаций I/D полиморфизма гена ACE с активностью и концентрацией фермента в плазме крови и тканях послужило основанием для исследования гена ACE как гена предрасположенности к многофакторным заболеваниям, а I/D полиморфизм стал использоваться как маркерный для изучения роли гена ACE в детерминации риска этих заболеваний. Большое количество работ посвящено изучению риска развития ишемического инсульта у лиц с генотипом DD [3, 5, 9, 26, 31, 34]. В нашем исследовании показано, что в русской популяции у лиц с генотипом DD
риск развития ишемического инсульта повышен (ОШ = 1,4, 95% ДИ [1.05; 1.78], р = 0,02), в то время как генотипы I/I и I/D ассоциированы с пониженным риском развития ишемического инсульта (ОШ = 0,7, 95% ДИ [0,56; 0,95], р = 0.02). Однако авторы некоторых исследований не установили связи полиморфизма гена ACE с ишемическим инсультом [5, 26]. В ряде работ были найдены ассоциации между генотипом DD и высоким риском развития лакунарных инсультов [31, 34].
По-видимому, как и для большей части описанных генетических дефектов, риск носительства аллеля или генотипа, ассоциированных с заболеванием, в значительной степени модифицируется целым рядом пока неизвестных факторов. В результате при исследованиях, проведенных у различных гетерогенных групп пациентов, получаются противоречивые результаты. Возможно, что в данном случае необходимо изучать ассоциацию полиморфизма гена не с заболеванием как таковым, а с определенными характеристиками патологического процесса у пациентов. Вероятно также, что оценка отдельных полиморфных локусов в большинстве случаев не может дать ясного представления о значении изучаемого локуса в патогенезе такого сложного гетерогенного заболевания как инсульт. Кроме того, нельзя исключать, что некоторые факторы внешней среды в разных популяциях могут вносить разный вклад в формирование клинической картины и фенотипа заболевания. Тем не менее, необходимо еще раз подчеркнуть, что полученные в данной работе результаты показывают ассоциацию I/D полиморфизма гена ACE с риском развития ишемического инсульта в русской популяции. Наличие такой ассоциации свидетельствует о важной роли ACE в патогенезе сосудистых нарушений мозга.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ; программ РАН "Молекулярная и клеточная биология", "Фундаментальные науки - медицине"; программы поддержки ведущих научных школ НШ-4294-2012-4; государственных контрактов № 02.522.11.2018, №16.740.11.0002; а также гранта НАН Украины № 22/08-09 ДФ.
Сведения об авторах:
Тупицына Татьяна Викторовна - канд. биол. наук, 123182, г. Москва, пл. акад. И.В. Курчатова, д. 2, e-mail: tanya_tupitsina@mail.ru, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, науч. сотр. Лаборатории молекулярной генетики наследственных болезней Отдела молекулярных основ генетики человека;
Бондаренко Елена Александровна - канд. биол. наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, мл. науч. сотр. Лаборатории молекулярной генетики наследственных болезней Отдела молекулярных основ генетики человека;
Кравченко Сергей Афанасьевич - канд. биол. наук, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, ст. науч. сотр. Отдела геномики человека;
Татарский Павел Феликсович - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, мл. науч. сотр. Отдела геномики человека;
Шетова Ирма Мухамедовна - канд. мед. наук, ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова Минз-дравсоцразвития России, ассистент кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии;
Шамалов Николай Анатольевич - канд. мед. наук, ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, доцент кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии;
Кузнецова Светлана Михайловна - чл.-корр. НАМН Украины, проф., Государственное учреждение Институт геронтологии им. Д.Ф. Чеботарёва НАМН Украины, заведующий Отделом сосудистой патологии головного мозга;
Шульженко Дина Владимировна - канд. мед. наук, Государственное учреждение Институт геронтологии им. Д.Ф. Чеботарёва НАМН Украины, врач Отделения реабилитации больных, перенесших нарушение мозгового кровообращения;
Скворцова Вероника Игоревна - чл.-корр. РАМН, проф., Министерство здравоохранения Российской Федерации, министр;
Сломинский Петр Андреевич - д-р биол. наук, проф., Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, заведующий Лабораторией молекулярной генетики наследственных болезней Отдела молекулярных основ генетики человека;
Лившиц Людмила Аврамовна - д-р биол. наук, проф., Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, заведующий Отделом геномики человека;
Лимборская Светлана Андреевна - д-р биол. наук, проф., Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, заведующий Отделом молекулярных основ генетики человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гусев Е. И., CKeop^eaВ. И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина; 2001: 13.
2. Altinisik J., Ates O., Ulutin T., Cengiz M., Buyru N. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2008; 14: 41З-20.
3. Ariyaratnam R., Casas J. P., Whittaker J., Smeeth L., Hingorani A.D., SharmaP. PLoS Med. 2007; 4: 728-36.
4. BakerR. I., Eikelboom J., LofthouseE., StaplesN., Afshar-Kharghan V., Lopez J. A. et al. Blood. 2001; 98: 36-40.
З. Banerjee I., Gupta V., Ganesh S. J. Hum. Genet. 2007; З2: 20З-19.
6. Barley J., Blackwood A., Carter N. D., Crews D. E., Cruickshank J. K., Jeffery S. et al. J. Hypertens. 1994; 1: 9ЗЗ-З7.
7. Berge E., HaugK. B., Charlotte SandsetE., HaugbroK. K., Turkovic M., SandsetP. M. Stroke. 2007; 38: 1069-71.
8. Bertina R. M., Koeleman B. P. C., Koster T., Rosendaal F. R., Dirven R. J., de Ronde H. et al. Nature. 1994; 369: 64-7.
9. Casas J. P., Hingorami A. D., Bautista L. E., Sharma P. Arch. Neurol. 2004; 61: 16З2-61.
10. Emmerich J., RosendaalF.R., Cattaneo M., MargaglioneM., De Stefano V., Cumming T. et al. Thromb. Haemost. 2001; 86: 809-16.
11. Hsieh K., Funk M., Schillinger M., Endler G., Janisiw M., Reisinger M. et al. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2004; 1З: 469-73.
12. Jalil J. E., Piddo A. M., Cordova S., Chamorro G., Braun S., JalilR. et al. Am. J. Hypertens. 1999; 12: 697-704.
13. Kaski S., Kekomaki R., Partanen J. Immunogenetics. 1996; 44: 170-6.
14. Krizanova O., Obdrzalkova D., Polakova H., Jelok I., Hudecova S. Physiol. Res. 1997; 46: 3З7-61.
15. Lalouschek W., Endler G., Schillinger M., Hsieh K., Lang W., Cheng S. et al. Clin. Chem. 2007; 53: 600-5.
16. Lalouschek W., Schillinger M., Hsiek K., Endler G., Tentschert S., Lang W. et al. Stroke. 2005; 36: 1405-9.
17. Leroyer C., Mercier B., Oger E., Chenu E., Abgrall J. F., Ferec C., MottierD. Thromb. Haemost. 1998; 80: 49-51.
18. Nowak-Gottl U., Strater R., Heinecke A., Junker R., Koch H. G., Schuierer G., von Eckardstein A. Blood. 1999; 94: 3678-82.
19. Paillard F., Chansel D., Brand E., Benetos A., Thomas F., Czekalski S. et al. Hypertension. 1999; 34: 423-9.
20. Perez-Ceballos E., Corral J., Alberca I., Vaya A., Llamas P., Montes R. et al. Br. J. Haematol. 2002; 118: 610-4.
21. Pezzini A., Grassi M., Iacoviello L., Del Zotto E., Archetti S., Giossi A., Padovani A. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2007; 78: 271-6.
22. Poort S. R., Rosendaal F. R., Reitsma P. H., Bertina R. M. Blood. 1996; 88: 3698-703.
23. Renner W., Köppel H., Hoffmann C., Schallmoser K., Stanger O., ToplakH. et al. Thromb. Res. 2000; 99: 35-9.
24. Rosendaal F. R., Doggen C. J., Zivelin A., Arruda V. R., Aiach M., Siscovick D. S. et al. Thromb. Haemost. 1998; 79: 706-8.
25. Slooter A. J., Rosendaal F. R., Tanis B. C., Kemmeren J. M., van der Graaf Y., AlgraA. J. Thromb. Haemost. 2005; 3: 1213-7.
26. SlowikA., Turaj W., Dziedzic T. Neurology. 2004; 63: 359-61.
27. SonodaA., MurataM., Ikeda Y., Fukuuchi Y., Watanabe K. Thromb. Haemost. 2001; 85: 573-4.
28. Sonoda A., Murata M., Ito D., Tanahashi N., Ohta A., Tada Y. et al. Stroke. 2000; 31: 493-7.
29. Soubrier F., Alhenc-Gelas F., Hubert C., Allegrini J., John M., Tregear G., CorvolP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85: 9386-90.
30. Staessen J. A., Wang J. G., Ginocchio G., Petrov V., Saavedra A. P., Soubrier F. et al. J. Hypertens. 1997; 15: 1579-92.
31. Szolnoki Z., Somogyvari F., Kondacs A., SzaboM., FodorL., Bene J., MeleghB. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2003; 74: 1615-20.
32. Tiret L., Rigat B., Visvikis S., Breda C., Corvol P., Cambien F., Soubrier F. Am. J. Hum. Genet. 1992; 51: 197-205.
33. Wu A. H., Tsongalis G. J. Am. J. Cardiol. 2001; 87: 1361-6.
34. Zhang J. H., Kohara K., Yamamoto Y. Cerebrovasc. Dis. 2004; 17: 273-9.
Поступила 13.09.12
COMPARATIVE ANALYSIS OF ASSOCIATIONS OF POLYMORPHIC GENES F2, F5, GP1BA AND ACE WITH THE RISK OF STROKE DEVELOPMENT IN RUSSIAN AND UKRAINIAN POPULATIONS
T. V. Tupitsyna1, E. A. Bondarenko1, S. A. Kravchenko3, P. F. Tatarskyy3, I. M. Shetova2, N. A. Shamalov2, S. M. Kuznetsova4, D. V. Shulzenko4, V. I. Skvortsova5, P. A. Slominsky1, L. A. Livshits3, S. A. Limborska1
1 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2 Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia; 3 Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine; 4 Chebotarev State Institute of Gerontology, National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine; 5 Ministry of Health of Russian Federation, Moscow, Russia
The comparative analysis of the associations between G20210A polymorphism ofF2 gene, G1691A polymorphism ofF5 gene, -5T/C polymorphism of gene GP1BA, I/D polymorphism of gene ACE and the risk of development of the stroke in two ethnical samplings -Russian and Ukrainian populations - was conducted. It was shown that the patients of the Russian population with genotype DD have a higher level of the risk of ischemic stroke development (OR = 1.4, 95% CI [1.05; 1.78], р = 0.02), whereas genotypes I/I and I/D are associated with the lower level of risk of ischemic stroke (OR = 0.7, 95% CI [0.56; 0.95], р = 0.02). In the Ukrainian ethnical sampling, differences in distribution of genotypes and alleles frequencies between patients with stroke and healthy persons upon given polymorphic locus are not significant, and I/D polymorphism of gene ACE is not associated with the risk of development of the stroke (OR = 0.8, 95% CI [0.48; 1.32], р = 0.45). The G20210A polymorphism of gene F2, G1691A polymorphism of gene F5, -5Т/С polymorphism of gene GP1BA are not associated with the risk of stroke in two ethnical samplings.
Key words: comparative analysis, associations ofpolymorphic genes, risk of stroke development, Russian and Ukrainian populations
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.862.1:579.25].083.1
Е. В. Кулешевич1, А. М. Савичева2, О. Н. Аржанова2, А. Н. Суворов1
распространенность и генетическая организация "острова патогенности" № xii у клинических штаммов стрептококков группы в
1ФГБУ НИИ экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН; 2ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург
Streptococcus agalactiae, или стрептококки группы В (СГВ), являются этиологическим агентом многих заболеваний детей и взрослых. Особенностью организации генома СГВ является наличие в нем 14 или 15 крупных мигрирующих генетических элементов - так называемых "островов патогенности", многие из которых содержат детерминанты факторов патогенности. Целью данного исследования являлась оценка распространенности и генетической организации "острова патогенности" № XII, несущего известные гены патогенности sspB1, scpB, lmb, в клинических штаммах СГВ.
Проанализировано 74 клинических штамма СГВ на гены потенциальных факторов патогенности "острова патогенности" № XII.
"Остров патогенности" № XII был обнаружен в геноме только у 22% клинических штаммов СГВ, генетическая организация которых различается. Не обнаружена корреляция между наличием "острова патогенности" № XII и типом СГВ.
Ключевые слова: стрептококки группы В, "острова патогенности"
Стрептококки группы В (СГВ) Streptococcus agalactiae являются этиологическим фактором многих заболеваний детей и взрослых. Согласно данным литературы, СГВ - ведущая причина перинатальных инфекций и заболеваний новорожденных бактериальной природы, часто приводящих к летальным исходам. В настоящее время в мире СГВ-инфекция развивается в 1,7 случая на 1000 родов без профилактики антибиотиками и в 0,34-0,37 случая на 1000 родов при проведении профилактики антибиотиками только при раннем начале заболевания новорожденных [16]. При позднем начале заболевания у новорожденных (от 1 нед до 2 мес) инфекция развивается в 0,4-0,47 случая на 1000 родов. Смертность новорожденных от пневмонии, сепсиса или менингита достигает 4-6% [16].
