Сравнительный анализ активности ядрышкообразующих районов хромосом и ядер лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 575.224.42

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ЯДРЫШКООБРАЗУЮЩИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ

И ЯДЕР ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЛИМФОМАМИ

© 2016 Е. В. Трубникова1, А. Ю. Лебедев2, В. П. Иванов3, А. С. Белоус4, А. А. Белов5, И. Ю. Шульгин6, Е. В. Котова 7

1докт. биол. наук, доцент, зав. научно-исследовательской лабораторией «Генетика» ФГБОУВПО «Курский государственный университет», доцент кафедры биологии, медицинской генетики и экологии КГМУ

e-mail: tr_e@list.ru 2лаборант НИЛ «Генетика» КГУ 3заслуженный деятель науки РФ, докт. мед. наук, профессор, председатель Курского отделения РАЕН, зав. кафедрой биологии, медицинской генетики и экологии КГМУ (основное место работы), главный научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории «Генетика» КГУ 4канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник НИЛ «Генетика» КГУ, доцент кафедры фармакологии КГМУ e-mail: a.s.belous@mail.ru 5-6аспирант НИЛ «Генетика» КГУ 7студентка ЕГФ КГУ

Курский государственный университет Курский государственный медицинский университет

В работе представлены результаты сравнительного анализа активности ядрышкообразующих районов хромосом и ядер лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами.

Ключевые слова: ядрышкообразующие районы, злокачественные лимфомы.

Цитогенетика человека занимает в современной цитогенетике особое место как по числу лабораторий, занимающихся изучением хромосом человека, так и по громадному объему накопленного фактического материала. Этому не приходится удивляться, поскольку цитогенетика человека прежде всего служит запросам медицинской практики. Вместе с этим сведения о хромосомах человека имеют общебиологическое значение, внося неоценимый вклад в наши знания о закономерностях структурной и функциональной организации эукариот. Ни один биологический вид не подвергается такому интенсивному и всестороннему изучению в отношении его хромосом, как человек, касается ли это молекулярной организации индивидуальных хромосом, полиморфизма нормальных хромосом в популяциях, генетического картирования хромосом, особенностей фенотипического проявления избытка или недостатка материала по той или иной хромосоме или её сегменту [Трубникова и соавт. 2007].

В настоящее время известны многочисленные примеры хромосомных перестроек, которые либо обусловливают предрасположенность к развитию онкологических заболеваний, либо являются прямой причиной злокачественной трансформации [Волкова 2001].

Опухолевую прогрессию при злокачественных лимфомах (3Л) связывают с появлением клеточных клонов, несущих хромосомные перестройки и отличающихся от исходного штамма рядом признаков [Аминева 2000; Переводчиков 1996; Рыжаева и соавт. 2005]. При неходжкинских лимфомах аномалии кариотипа выявляются у 80-90% больных, при лимфомах Ходжкина — у 40-80%, и хромосомные нарушения, как правило, очень сложны. Выявлен целый ряд хромосомных изменений, характерных для лимфом, среди них транслокации (8;14), (2;8), (8;22), (14;18), (11; 14), разные перестройки длинного плеча хромосомы 2, делеции длинного плеча хромосомы 6, трисомии 3, 7, 12 и 18 [Волкова 2001; LeBeau 1990; Sorokin 1995]. Установлены некоторые корреляции между особенностями кариотипа и гистологическим строением опухоли, однако данные не всегда совпадают [Залетаева и соавт. 1994; Ильинская и соавт. 1989]. Но, несмотря на значительные успехи в изучении проблемы, в настоящее время окончательно этиология ЗЛ не выяснена [Рыжаева и соавт.]. Известно, что злокачественная трансформация при наличии генетической предрасположенности может проявляться при определенных условиях. Изучение генетических процессов непосредственно в лимфоцитах может помочь найти адекватный способ коррекции сдвига пролиферативной активности и лечения заболеваний.

Данные показывают, что во многих случаях при ЗЛ возникают хромосомные транслокации, влияние которых на развитие опухоли еще не до конца изучено [Иванов и соавт. 2015]. Несмотря на то что некоторые конкретные траслокации исследователи соотносят с определенным типом лимфом, в целом считается, что появление хромосомных нестабильностей при ЗЛ носит стохастический характер [Castro et al. 2006]. Однако не известно, зависит ли частота возникновения хромосомных мутаций от стадии заболевания.

В свете изложенного на фоне неуклонного роста заболеваемости ЗЛ во многих развитых странах [Аксель, Двойрин 1992] вопросы их профилактики, ранней диагностики и адекватной терапии являются весьма актуальными [Волкова 2001].

Целью настоящего исследования явилось проведение сравнительного анализа активности ядрышкообразующих районов хромосом и ядер лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами.

Материалы и методы

Исследования были проведены на цитогенетических препаратах ядер и хромосом лимфоцитов из венозной крови человека.

Для изучения активности ядрышкообразующих районов на ядрах был проанализирован материал от 40 индивидов, 20 из которых составили группу контроля (добровольцы, не имеющие жалобы на состояние здоровья, проживающие в Курске и Курской области и самоопределяющие себя «коренными жителями Курской области») и 20 - группу больных, стоящих на учете в Курском областном онкологическом диспансере (КООД) и имеющих диагноз «злокачественные лимфомы». Для изучения активности рибосомных генов на хромосомах использовали популяционную выборку контроля (n=300) и выборку больных со злокачественными лимфомами (n=80). Пациенты включались в группу после установления и верификации диагноза, подтвержденного с помощью стандартизированных клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования, проведенных квалифицированными специалистами Курского областного онкологического диспансера по стандартизированным методикам.

Основные лабораторные исследования выполнялись согласно унифицированным методикам на базе клинико-диагностической лаборатории КООД и областной клинической больницы г. Курска. Все были информированы о проводимом

Трубникова Е. В., Лебедев А. Ю., Иванов В. П., Белоус А. С., Белов А. А., Шульгин И. Ю., Котова Е. В.

Сравнительный анализ активности ядрышкообразующих районов хромосом и ядер

лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами

исследовании и дали свое согласие на взятие биологического материала. Средний возраст добровольцев составил 19 лет. Группы были рандомизированы по полу и по возрасту.

В каждом случае из единой клеточной популяции оценивалось по 30 интерфазных клеток и по 20 метафаз, что в общей сложности составило 1200 ядер и 7600 метафазных пластин.

Изготовление цитогенетических препаратов проводили в Научно-исследовательской лаборатории «Генетика» Курского государственного университета по общепринятой методике непрямого культивирования лимфоцитов периферической крови.

Для специфического выявления районов ядрышковых организаторов (ЯОР) использовался метод дифференциальной окраски хромосом нитратом серебра, предложенный Howell и Black, с некоторыми модификациями. Использованная методика дифференциальной окраски включала в себя следующие этапы. На высушенный и промаркированный препарат под каждое покровное стекло наносилось 50 мкл бидистиллированной деионизированной воды, 150 мкл 50%-го раствора нитрата серебра и 100 мкл 2%-го раствора желатина в 0,1%-м растворе муравьиной кислоты и инкубировалось во влажной камере в термостате при температуре 56,7-60°С 40-60 минут. После промывки под струей проточной воды каждый препарат проводился по спиртам и в случае необходимости докрашивался 1%-м раствором красителя Гимза на фосфатном буфере (рН 6,8).

Микроскопирование и дальнейшее фотографирование препаратов проводилось с помощью микроскопа «ZEISS» (увеличение окуляра 10, увеличение объектива 90).

Статистическую обработку результатов проводили на ПК с помощью пакета прикладных программ Microsoft Office Excel и STATISTICA.

Для анализа функциональной активности ЯОР рассчитывали средние значение, стандартное отклонение признака, минимальные и максимальные значения, медиану. Сравнительный анализ проводили через расчет критерия Стьюдента и значения уровня значимости для него.

Оценка функциональной активности ядрышкообразующих организаторов на интерфазных ядрах проводилась на ПК с помощью программы MicroMed Karyo 2.0. В первую очередь были получены электронные микрофотографии дифференциально окрашенных ядер лимфоцитов периферической крови человека. Далее было проведено измерение в микрометрах (мкм) суммарной площади окрашенных серебром ядрышек, площади самих ядер лимфоцитов, проведен подсчет количества ядрышек внутри каждого ядра, а также рассчитано отношение суммарной площади просеребрённых ядрышек к площади самого ядра.

Функциональную активность рибосомных генов на хромосомах оценивали по размеру преципитата восстановленного серебра, выпавшего в районах вторичных перетяжек акроцентрических хромосом лимфоцитов, и выражали в баллах - от 0 до 4.

Результаты исследования

Для сравнительного анализа показателей функциональной активности ЯОР у больных со злокачественными лимфомами в первую очередь нами были проанализированы препараты, полученные от группы контроля. Рассчитанные показатели представлены в таблице 1.

Таблица 1

Общие показатели функциональной активности ядрышек в интерфазных ядрах _в группе контроля_

Статистический показатель Среднее знач. площади ядрышек (мкм2) Среднее количество ядрышек Доля суммарной площади ядрышек от общей площади ядра

Среднее значение 4173.05 2.32 0.20046

Медиана 4112.00 2.26 0.20130

Стандартное отклонен 859.93 0.24 0.01449

Минимальное значение 2600.00 1.90 0.17650

Максимальное значение 5936.00 2.87 0.23170

Из таблицы видно, что среднее значение площади ядрышек в группе контроля

2

составило 4173.05±859.93 мкм , практически не отклонялось от медианы признака -2 2 2 4112.00 мкм и варьировало от 2600.00 мкм до 5936.00 мкм . Среднее количество

ядрышек в клетках лимфоцитов здоровых индивидов составило 2.32±0.24, варьировало

от 1.90 до 2.87.

Для сравнительного анализа функциональной активности ЯОР наиболее информативным является рассчитанный показатель - доля суммарной площади ядрышек от общей площади ядра. Его среднее значение для контроля было 0.20±0.02, совпадало с медианным значением (Ме=0.20) и варьировало от 0.18 до 0.23.

Далее были изучены показатели функциональной активности ЯОР у больных со злокачественными лимфомами (таблица 2).

Таблица 2

Общие показатели функциональной активности ядрышек в интерфазных ядрах _в группе больных со злокачественными лимфомами_

Статистический показатель Среднее знач. площади ядрышек (мкм2) Среднее количество ядрышек Доля суммарной площади ядрышек от общей площади ядра

Среднее значение 3491.15 2.11 0.139

Медиана 3194.00 2.10 0.111

Стандартное отклонен 1056.71 0.25 0.050

Минимальное значение 2023.00 1.70 0.082

Максимальное значение 5943.00 2.54 0.223

Из представленных данных видно, что средняя площадь ядрышек в группе больных со злокачественными лимфомами была 3491.15±1056.71 мкм2, значение медианы признака было смещено в сторону меньших значений и составило 3194.00 мкм2. Этот факт указывает на преобладание в группе индивидов с меньшими значениями площади ядрышек. Минимальный показатель составил 2023.00 мкм , максимальный - 5943.00 мкм .

Среднее количество ядрышек в клетках лимфоцитов больных со злокачественными лимфомами составило 2.11±0.25, варьировало от 1.70 до 2.54. Значение медианы не отклонялось от среднего значения (Ме=2.10).

Трубникова Е. В., Лебедев А. Ю., Иванов В. П., Белоус А. С., Белов А. А., Шульгин И. Ю., Котова Е. В.

Сравнительный анализ активности ядрышкообразующих районов хромосом и ядер лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами

Средний показатель отношения доли суммарной площади ядрышек к общей площади ядра в группе больных был равен 0.139±0.05 и практически совпадал с медианным значением (Ме=0.111), варьировал значительно - от 0.08 до 0.22.

Следующим этапом нашей работы был сравнительный анализ функциональной активности районов ядрышковых организаторов в ядрах лимфоцитов периферической крови у здоровых людей - жителей Курской области и больных со злокачественными лимфомами. Для этого нами были сравнены средние значения, а также дисперсия (варьирование) рассматриваемых признаков в двух группах. Были рассчитаны коэффициенты Стьюдента и Фишера и соответствующие уровни значимости (р) для них. Полученные данные представлены в таблице 3 и на диаграммах (рис. 1-3).

4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000

.А

□ Контроль

□ Больные ЗЛ

Среднее значение площади ядрышек

Рис. 1. Средние значения площади ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови группы контроля и группы больных со злокачественными лимфомами

Сравнительный анализ средних значений рассматриваемых показателей у больных со злокачественными лимфомами выявил статистически значимые отличия от популяционных показателей во всех случаях.

В сравнении с популяционными характеристиками (М=4173.05±859.93 мкм2) среднее значение площади ядрышек у больных со злокачественными лимфомами (М=3491.15±1056.71 мкм2) было значительно снижено, и критерий Стьюдента составил 2.24 при р=0.03.

Среднее количество ядрышек в ядрах лимфоцитов у больных со злокачественными лимфомами (2.11±0.25) также было ниже по сравнению с группой контроля (2.32±0.24), и значение рассчитанного критерия Стьюдента также достигало статистически значимых величин (1 =2.65, при р=0.01).

2.35 2.3 2.25 2.2 2.15 2.1 2.05 2

□ Контроль

□ Больные ЗЛ

Среднее количество ядрышек

Рис. 2. Средние количество ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови группы контроля и группы больных со злокачественными лимфомами

Показатель относительной доли суммарной площади открашенных ядрышек от общей площади ядра также был значительно ниже популяционной величины. Значение критерия Стьюдента при этом составило 1 =5.32 при р=0.001.

0.2 0.15 0.1 0.05 0

7

/ W

-У

□ Контроль

□ Больные ЗЛ

Доля суммарной площади ядрышек от общей площади ядра

Рис. 3. Средние значения отношения суммарной площади ядрышек к общей площади ядра в лимфоцитах периферической крови группы контроля и группы больных со злокачественными лимфомами

Анализ вариационной изменчивости рассматриваемых характеристик комплекса функциональной активности ЯОР показал отличие от популяционной выборки лишь по показателю относительной доли суммарной площади ядрышек от обшей площади ядра (Б=11.89 при р=0.001), по двум другим показателям статистически значимых различий не наблюдалось (р>0.05).

Таблица 3

Сравнительный анализ средних значений показателей функциональной активности ЯОР в ядрах лимфоцитов периферической крови группы контроля и группы больных со злокачественными лимфомами

Контроль Больные со ЗЛ t (р) F (p)

Mean±Std.Dev. Mean±Std.Dev.

Среднее значение площади ядрышек (мкм2) 4173.05±859.93 3491.15±1056.71 2.24 (0.03)* 1.51 (0.38)

Среднее количество 2.32±0.24 2.11±0.25 2.65 (0.01)* 1.07 (0.89)

ядрышек

Доля суммарной

площади ядрышек от общей площади 0.20±0.01 0.14±0.05 5.32 (0.001)* 11.89 (0.001)*

ядра

* различия статистически достоверны (р<0.05)

В ранних исследованиях нами был определен общий уровень ФАРГ для десяти хромосом, который составил 18.35±1.42 условных единиц (усл. ед.), (CI 18.05-18.66), медиана признака практически не отклонялась от среднего значения и составляла 18.42 усл. ед. (25% квантиль 17.38 усл. ед. - 75% квантиль 19.14 усл. ед.). В сравнении с популяционными данными по Курской области у больных со ЗЛ показатели общего уровня ФАРГ были значительно снижены (t=4.01, р<0.01).

Трубникова Е. В., Лебедев А. Ю., Иванов В. П., Белоус А. С., Белов А. А., Шульгин И. Ю., Котова Е. В.

Сравнительный анализ активности ядрышкообразующих районов хромосом и ядер

лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами

Выводы

1. Изучены показатели функциональной активности районов ядрышковых организаторов в ядрах лимфоцитов здоровых людей. В курской популяции среднее значение площади ядрышек составляет 4173.05±859.93 мкм , среднее количество ядрышек - 2.32±0.24, относительная доля суммарной площади открашенных ядрышек от общей площади ядра - 0.20±0.01.

2. Проанализированы показатели активности районов ядрышковых организаторов в ядрах лимфоцитов больных злокачественными лимфомами. Среднее значение площади ядрышек составляет 3491.15±1056.71 мкм , среднее количество ядрышек - 2.11±0.25, относительная доля суммарной площади открашенных ядрышек от общей площади ядра - 0.14±0.05.

3. Проведённый сравнительный анализ всех показателей в двух группах свидетельствует о более низкой функциональной активности районов ядрышковых организаторов на интерфазах у больных со злокачественными лимфомами (t1=2.24, t2=2.65, t3=5.32, при р<0.05, соответственно).

4. Полученные данные по активности ЯОР в интерфазных ядрах подтверждают данные, полученные при анализе активности ЯОР на метафазных хромосомах, и являются статистически значимо ниже средних величин по курской популяции.

Заключение

Подводя итог полученным результатам эксперимента, можно отметить, что проблема изменчивости функциональной активности рибосомных генов (на метафазных хромосомах) и ядрышкообразующих районов (в интерфазных ядрах) имеет своих сторонников и своих оппонентов. Однако общепризнанным на сегодняшний день является факт адаптационной лабильности живущих организмов и возможности подстраивания их внутренних и внешних систем под постоянно изменяющиеся условия окружающей среды. То есть различные геммологические показатели (биохимические показатели крови, показатели общего анализа крови и др.), которые можно измерить тем или иным образом, характеризуют состояние живой системы. Показатели функциональной активности ядрышкообразующих районов лимфоцитов периферической крови человека также можно отнести к указанной группе характеристик - они напрямую коррелируют с основным обменом организма.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о значительном снижении уровня транскрипционной активности в районах ядрышковых организаторов лимфоцитов крови у больных со злокачественными лимфомами по сравнению с выборкой здоровых людей. На данный факт указывает значительно меньшие средние площади просеребренных участков, соответствующих ядрышкообразующим районам, меньшее среднее количество окрашиваемых ядрышек, а также более низкое значение относительной величины - доли площади окрашенных ядрышек от общей площади ядра. Факт сниженной функциональной активности рибосомных генов подтверждается также и данными по метафазным хромосомам.

Анализ варьирования показателей рассматриваемых характеристик свидетельствует об отсутствии различий в распределении значений окрашенных серебром ядрышкообразующих районов и количества ядрышек на одно ядро лимфоцита, однако показатель доли площади окрашенных ядрышек от общей площади ядра варьирует очень сильно.

Таким образом, мы экспериментально и статистически доказали значительное снижение показателей функциональной активности ядрышкообразующих районов ядер лимфоцитов периферической крови у больных со злокачественными лимфомами.

Библиографический список

Аксель Е.М., Двойрин В.В. Статистика злокачественных новообразований (заболеваемость, смертность, тенденции, социально-экономический ущерб, продолжительность жизни). М., 1992. 308 с.

Аминева Д.Д. Оценка качества полихимиотерапии у больных злокачественными лимфомами: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Уфа, 2000. 22 с.

Волкова М.А. Клиническая онкогематология: рук-во для врачей. М.: Медицина, 2001. С. 92-114.

Залетаева Т.А., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В., Барцева О.Б. Современные методы хромосомного анализа в клинико-цитогенетических исследованиях / Российская мед. акад. последип. образ. М.: Медицина, 1994. 68 с.

Иванов В.П., Трубникова Е.В., Болдинова Е.О., Бобынцева О.В., Локтионов А.В. Анализ уровня спонтанного мутагенеза на разных стадиях злокачественных лимфом // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2015. № 1-1. С. 76-78.

Ильинская Г.В., Флейшман Е.В., Пригожина Е.Л. и др. Особенности кариотипа лимфосаркомы человека // Хромосомы человека в норме и патологии. М.: Наука, 1989. С. 82-88.

Переводчикова Н.И. Онкология. 1996.

ПоддубнаяИ.В. Клиническая онкогематология. М.: Медицина, 2001. С. 336-375.

Рыжаева В.Н., Трубникова Е.В., Иванов В.П., Куденцова Г.В., Киселев И.Л. Изменчивость функциональной активности рибосомных генов прихимиотерапии больных злокачественными лимфомами // Медицинская генетика. 2005. Т. 4. № 6. С. 261a-261.

Трубникова Е.В., Иванов В.П., Стабровская Н.В., Барков А.Н. Оценка уровня спонтанного мутагенеза у работников ГОК // Ученые записки. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2007. № 1 (3). URL: www.scientific-notes.ru/pdf/sa12.pdf (дата обращения: 13.03.2016).

Castro M.A. Chromosome aberrations in solid tumors have a stochastic nature / Castro M.A., Onsten T.G., Moreira J.C., de Almeida R.M // Mutat Res. 2006. № 1-2. С. 150-164.

LeBeau M.M. Chromosomal abnormalities in non-Hodgkin's lymphomas // Semin. Oncol. 1990. Vol. 1. P. 20-29.

Sorokin E. Third International Symposium on Hodgkin's lymphoma. Koln, 1995. Abstr. 110.