CC BY
25
Sadriddinov Asomiddin Fayazovich, Tashkent Pediatric Medical Institute, professor, department of histology
Sultanbekova Iroda Azatovna, Assistant, department of biology
Sheraliev Kambarali Saidalievich, Tashkent Pediatric Medical Institute, Assistant, department of Human Anatomy
Guzacheva Elena Nikolayevna, doctor of family clinics in Tashkent city E-mail: asom_sad_23@mail.ru
Comparative light optical and electrone microscopic study of dynamics for natural death of hepatic cells
Abstract: In dynamic of apoptosis their two types were divided. At the first type of apoptosis at the beginning in cytoplasm ofhepatocyte the vacuoles occur (in rats), that then transform into small light vesicles being called as "stormy plasma". Then the volume of cell is increased, and, it's shape is rounded out and the progressing shrivel occur. At the second type of apoptosis on the background of less changing cytoplasm the nucleus is undergone to deep desorganizations, and, it is decomposed into large fragments, the karyorrhexis occurs, so, this type is named as "nuclear catastrophe". Such course of apoptosis is observed in both animals but with some predominance of the second type in the rats. At the final stage of both types for apoptosis the cells are torn out from the hepatic plate the cellular membrane is ruptured, and, cellular countent is washed away to sinusoid lumen.
Keywords: liver, morphology, apoptosis, extrusion of hepatocytes.
Садриддинов Асомидин Фаязович, доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии Ташкентского педиатрического медицинского института
Султанбекова Ирода Азатовна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биологии
Шералиев Камбарали Саидалиевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии Ташкентского педиатрического медицинского института
Гузачева Елена Николаевна, врач семейной поликлиники Юнусабадского района города Ташкента
E-mail: asom_sad_23@mail.ru
Сравнительное светооптическое и электронномикроскопическое исследование динамики естественной гибели печеночных клеток
Аннотация: В динамике течения апоптоза выделены два его типа. При первом типе апоптоза в начале цитоплазме гепатоцита появляются вакуоли (у крыс), которые затем преобразуются в мелкие светлые пузырьки, обозначенные как «бурлящая цитоплазма». В последующем увеличивается объем
клетки и округляется её форма, затем наступает прогрессирующее сморщивание ядра. При втором типе апоптоза на фоне менее измененной цитоплазмы, глубоким дезорганизациям подвергается ядро, которое распадается на крупные фрагменты, происходит кариоресксис, обозначены нами как «ядерная катастрофа». Такое течение апоптоза наблюдается у обоих животных, с некоторым преобладанием второго типа у кроликов. На конечной стадии обоих типов апоптоза клетки отрываются от печеночной пластинки, разрывается клеточная мембрана и содержимое клетки вымывается в просвет синусоида.
Ключевые слова: печень, морфология, апоптоз, экструзия гепатоцитов.
Результаты исследования. Печень кроликов и белых крыс состоят из многочисленных долек, нечетко ограниченных друг от друга. В центре дольки, как обычно, локализована центральная вена, от
Введение. Многие патологии печени сопровождаются не только некрозом, но и также естественной гибелью печеночных клеток [1; 2]. В печени, как и во многих других органах эпителиального происхождения, выделяют порто-венозный градиент, в пределах которого поддерживается постоянство её клеточного состава [3; 4; 5; 6]. Градиент представляет собой радиально ориентированные печеночные пластинки, находящийся между портальным трактом и центральной веной. В градиенте гепатоциты одной стороной прилегают к синусоидам, другой, к желчным канальцам. Предполагается, что в перипортальных зонах порто-венозного градиента происходит митотиче-ское деление гепатоцитов, а в промежуточной, клетки дифференцируясь, приспосабливаются к выполнению сложных функций, после чего в перивенозных зонах подвергаются естественной гибели [7; 8; 9; 10]. Однако, данных о топографической локализации и способов естественной гибели клеток в пределах градиента малочисленны, что, по-видимому, обусловлены со сложностью их идентификации на светооптическом уровне. В связи с этим, для определения апоптоза предложен иммуноцитохимический метод, но он требует значительные затраты, поэтому не всегда возможен и удобен в применении. Исходя из этого, целью данного исследования явилось сравнительное светооптическое и электронно-микроскопическое изучение динамики естественной гибели печеночных клеток подопытных кроликов и белых беспородных крыс.
Материал и методы исследования. Материалом служил печень половозрелых кроликов (п = 16) и белых беспородных крыс (п = 18) обоего пола, содержавшихся в обычных условиях вивария. Животные с соблюдением этических норм забивались под легким эфирным наркозом путем декапитации. Кусочки ткани печени после соответствующей обработки заливали в парафин, а окрашенные срезы гематоксилин — эозином, просматривали под иммерсионным объективом (Х100) микроскопа N 4800М. Часть кусочков ткани печени обрабатывали для электронно-микроскопических исследований, и полученные срезы просматривали под микроскопом }БМ-1005.
которой радиально расходятся печеночные пластинки и синусоидные гемокапилляры. На периферии, в области углов дольки находятся портальные тракты, содержащие триаду печени. Основной клеточный элемент печени — гепатоциты образуют печеночные пластинки, расположенные между портальным трактом и центральной веной, которые и формируют порто-венозный градиент. При анализе клеточных элементов градиента установлено, что мито-тическое деление гепатоцитов встречается крайне редко (1:2 500 клеток) и в основном, выявляются в перипортальных участках. В противоположность этому апоптоз, часто обнаруживается в перивеноз-ных, изредка в промежуточных гепатоцитах порто-венозного градиента. Как правило, апоптозу подвержены единичные гепатоциты в паренхиме печени и они легко отличаются от окружающих с резким просветлением цитоплазмы или изменением структуры ядра. Как показали наши исследования в печени подопытных кроликов и крыс в зависимости от преобладания глубины изменения цитоплазмы или ядра гепатоцитов целесообразно различать два типа апоптоза, соответственно обозначенные нами как «бурлящая цитоплазма» (апоптоз первого типа-АПТ) и «ядерная катастрофа» (апоптоз второго типа-АВТ). Чаще встречалось АПТ, когда глубоким изменениям, подвергались цитоплазма гепатоци-та, в отличие от ядра, как у кроликов, так и крыс, динамику которого, мы опишем вначале. Апоптоз данного типа начинается с появления в цитоплазме печеночной клетки 2-3-х вакуолей, содержащих, по-видимому, переливающуюся жидкость. Причем, вакуоли очень хорошо заметны только у крыс, и вначале они занимают только небольшую часть цитоплазмы, остальная часть окрашена оксифильно и имеет обычное строение (рис. 1 а). Ядра гепатоцита локализуется в центре цитоплазмы, имеет округлую форму и не обнаруживает существенных изменений.
Рис. 1. Печень крысы. Здесь и далее окраска гематоксилин-эозином. Ок.15. 06.100 (иммерсия). А-Г — динамика первого типа апоптоза. А - начало апоптоза, появление вакуолей в цитоплазме гепатоцита. Б - замешение цитоплазмы гепатоцита вакуолями. В - преобразование цитоплазмы гепатоцита в пенистую структуру. Г - морфологическая картина «целующиегося» апоптоза
На следующем этапе в связи с увеличением числа вакуолей в цитоплазме, объем апоптотической клетки увеличивается, а сама клетка округляется, однако межклеточные связи с окружающими клетками еще не нарушены. Вслед за вакуолизацией цитоплазмы, наступает изменения элементов ядра, изменяется ядрышка, количество которых уменьшается, либо исчезают, либо сливаются с глыбками хроматина, в связи с чем, трудно их идентифицировать. На следующем этапе в результате полного замещения цитоплазмы вакуолями клетка выглядит резко набухшей, приобретает строгую округлую форму и светлый вид (рис. 1 б). Следует заметить, что крупно вакуольная стадия апоптоза, в основном характерна для крыс. Затем, очевидно, вследствие распада этих вакуолей
на более мелкие пузырьки или везикулы цитоплазма приобретает пенистый характер (клетка как бы «кипит»), поэтому нами такое состояние обозначено как «бурлящая цитоплазма». На фоне ярко окрашенных окружающих клеток пенистые клетки отчетливо выделяются как у кроликов, так и белых крыс (рис. 1 в). С этого момента развития апоптоза изменения в ядре гепатоцита становится более заметной, ядерная оболочка становится извилистой, хроматин уплотняется, ядрышки, как отмечалось выше, не всегда идентифицируются и все это завершается пикнозом ядра. Наряду с апоптозом единичных клеток, в редких случаях обнаруживалась очаговая гибель 2-х или 3-гепатоцитов (они выявлены только у крыс), цитоплазма и ядро которых изменены вышеописанным образом и выглядят
как «целующиеся» апоптозы (рис. 1 г). В последующем, при данном типе апоптоза, изменения ядерных элементов углубляясь, пикнотизированное ядро перемещается на периферию цитоплазмы и уменьшаясь еще больше в объеме, растворяется или же целиком исчезает (рис. 2 а). Таким образом, в результате АПТ, объем клетки увеличивается в 2-3 раза, цитоплазма заполняется пенистыми — «апоптотическими»
телами, ядро резко уменьшается в объеме. Такая клетка приобретает сферическую форму и несколько выбухает в просвет синусоида, причем, эти изменения одинаково протекают у обоих видов животных. В случаях, когда апоптозу подвергается двуядерная клетка, содержимое обоих ядер сливаются, образуя более крупные конгломераты, и в конечном итоге, они также исчезают или растворяются.
Рис. 2. Печень кролика. А - конечная стадия первого типа апоптоза. Этап разрыва клеточной оболочки. Б - второй тип апоптоза, распад ядра - «ядерная катастрофа». В - цитологическая картина первого и второго типа апоптоза. В верхней части рисунка «бурлящая цитоплазма»,
а в нижней - «ядерная катастрофа». Г - экструзия гепатоцитов в перивенозных зонах печеночной дольки. Видна отделившиеся печеночная клетка от пластинки (нижняя стрелка), границы клетки распливчаты и ядро отчетливо не выявляется (верхняя стрелка)
Завершается апоптоз первого и второго типа тем, (рис. 2 а). При АВТ серьезные изменения претерпе-что клеточная мембрана клетки разрывается и содер- вает ядро клетки. Содержимое его сразу распадается жимое цитоплазмы вытекает в просвет синусоида на крупные фрагменты, происходит кариорексис. В
связи с этим, уже в самом начале апоптоза структурные элементы ядра не дифференцируются, и в целом, они выявляются в виде темных бесформенных образований, поэтому обозначены нами как «ядерная катастрофа» (рис. 2 б). В отличие от АПТ, в данном случае цитоплазма гепатоцита приобретает тонкозернистую гомогенную структуру, а сама клетка также округляется и отчетливо вырисовывается её оболочка (рис. 2 б). Следует подчеркнуть, что при данном типе апоптоза увеличение объема клетки не столь выражено, как при первом типе апоптоза и данный вид чаще встречался у кроликов, чем у крыс. Существование двух типов апоптоза и его цитологическое различие наглядно демонстрируется на небольшом участке паренхимы печени (рис. 2 в). В верхней части рисунка виден гепатоцит со светлой цитоплазмой — «бурлящий тип апоптоза» (АПТ), а в нижней, гепатоцит с распадающимся ядром — «ядерная катастрофа» (АВТ). Таким образом, в результате полной дезорганизации цитоплазмы и особенно ядра, в клетке формируется темные глыбки хроматина в центре, которые постепенно разрыхляются, на фоне тонкозернистой структуры цитоплазмы (рис. 2 в, нижняя часть рисунка). В заключительном этапе естественной гибели клеток при обоих типах апоптоза, клеточные оболочки деградирующих клеток отделяются от соседних, цитоплазма разрыхляется и становится мелкозернистой. Затем следует разрыв окружающей мембраны, вследствие чего содержимое клеток вымывается в просвет синусоида, а соседние клетки, смещаясь, восстанавливают нормальную структуру печеночной пластинки. Светооптическая картина апоптоза подтверждаются ультраструктурными исследованиями. Оптической «бурлящей цитоплазме» электронно-микроскопически соответствует выявление вакуо-лярных или везикулярных образований, окруженных мембраной. Более того, ультраструктурные исследования существенно дополняют светооптические данные степени дезорганизации субклеточных структур, как цитоплазмы, так и ядерного материала. Хорошо различимые апоптотические тела окружены одинарной мембраной, имеют округлую форму и содержат остатки, разрушенных митохондрий, зернистой ци-топлазматической сети или других органелл. Кроме того, между апоптотическими телами, наряду с глыб-ками дезорганизованного хроматина, также выявляются проникшие эритроциты (рис. 3 а). Характерное для АВТ гомогенизированный тонкозернистый материал цитоплазмы при электронно-микроскопическом исследовании оказалось распавшимися
субклеточными элементами-клеточным детритом. Среди этих элементов, как при первом типе апоптоза, обнаруживаются фрагменты ядра, окруженные мембраной, а также вклинившиеся эритроциты. Кроме естественной гибели клеток, нами в печени выявлено иной способ гибели гепатоцитов, когда терминально расположенные клетки (контактирующие с центральной веной) еще с нормальной структурой целиком отделяются от печеночных пластинок, подвергаясь «вынужденной» экструзии. При светооптическом исследовании такие гепатоциты отчетливо отделены от соседних, свободно располагаются в печеночном градиенте или в просвете синусоидных капилляров, цитоплазма окрашена в светло розовый цвет, а ядро выявляется в виде тени (рис. 2 г). При электронно-микроскопическом исследовании экструзированный гепатоцит обнаруживается в просвете синусоида, о чем свидетельствует расположенные вокруг эритроциты. Однако в отличие от апоптоза в данной клетке хорошо сохранена её форма и отчетливо различается билиарные и синусоидные полюсы, а также все мембранные структуры (рис. 3 б). Синусоидный полюс содержит большое число коротких микроворсинок, а билиарный — секреторные гранулы (очевидно, компоненты желчи), комплекс Гольджи, а также остатки желчных канальцев. Заслуживает внимание выявляемые остатки межклеточных связей — плотных контактов и десмосом на мембранах гепатоцита (рис. 3 б). Важно упомянуть хорошую сохранность внутриклеточных органелл, и элементов ядра, за исключением незначительного изменения ядрышка (клетка двуядерная, в каждом ядре содержится однотипные ядрышки). В ядрышках вместо обычных фибриллярно-гранулярных компонентов обнаруживаются уплотненные нитчатые структуры, однако, скопления гетерохроматина (ядрышковые организаторы) вокруг нитей отсутствуют. Можно предположить, что экструзированная клетка также уносится током крови, где разрушаются или фагоцитируются микро- или макрофагами крови.
Обсуждение полученных результатов. Цитологический анализ структуры порто-венозного градиента кроликов и белых беспородных крыс позволил выявить единичные фигуры митотического деления гепатоцитов, в основном в перипортальных зонах печеночной дольки. Эти результаты совпадают с исследованиями [9; 11], которые при введении Н 3-ти-мидина показали, что предшественники гепатоцитов находятся в радиусе 200 мкм. от портальных трактов. Следовательно, можно предположить, что в этой зоне
находится диферон, клетки которых, дифференцируясь, перемещаются в сторону центральной вены.
Анализ локализации апоптотических клеток в печени кроликов и белых крыс позволило выявить единично разбросанных, и редко в виде 2-3-х гепатоци-тов, локализованных в основном, в промежуточных или центральных зонах дольки. Полученные данные совпадают с исследованиями [3; 4; 5], которые описали естественную гибель крайних 2-3-х рядов клеток вокруг терминальных печеночных венул, а изредка между 3-5 рядами. По цитологическому признаку апоптоза у обоих видов животных нами обнаружены два типа его течения. При АПТ существенно изменяется цитоплазма, которая заполняется сначала вакуолями (только у крыс), а затем везикулами, как у кроликов, так и крыс («бурлящая цитоплазма»). Во втором типе на фоне менее измененной цитоплазмы происходит полная фрагментация и распад ядра («ядерная катастрофа»), чаще встречающиеся у кроликов. На молекулярном уровне в течении апоптоза различают 3 стадии: сигнальная, эффекторная и деградационная [3; 7; 9; 12], наши исследования, по-видимому, отражают только последние две стадии. Цитологическая вакуолизация и последующая везикуляция цитоплазмы, очевидно, связаны с проте-олитической активностью каспазы [10; 12], а также деполимеризацией микротрубочек [5; 12]. Вследствие указанных явлений, а возможно и полного разрушения цитоскелета клетка приобретает сферическую форму, а содержимое цитоплазмы превращается в пенистые пузырьки, что послужило основанием для обозначения их как «кипение» или «бурлящая цитоплазма». Большинство исследователи отмечают, что для апоптоза характерно сморщивание клетки [5; 6; 13], в наших исследованиях пикноз больше свойственно только для ядра в конечной стадии первого типа апоптоза. В тоже время формирование отчетливо различимых апоптотических тел, как светооптически так и ультра-структурно нами отмечены при АПТ. Естественная гибель гепатоцитов, вероятно начинается с изменения ядрышка, что подтверждается хорошей сохранностью всех внутриклеточных органелл, а также элементов ядра, за исключением структуры ядрышка при экструзии гепатоцита. Другим не менее важным цитологическим признаком апоптоза является кариорексис, т. е. фрагментация ядра. Согласно литературным данным [3; 6; 9] кариорексис не всегда обязательный признак апоптоза, так как он может протекать и без фрагментации ядра, что согласуется с результатами наших исследований (апоптоз первого типа). В некоторых работах
уплотнение цитоплазмы связывают не апоптозом, а некрозом клеток [5; 7; 11]. Однако в наших исследованиях характерные признаки некроза (лизис клеточной мембраны и миграцию фагоцитирующих клеток) нами не отмечены, в связи с этим они обозначены как апоптоз второго типа. Просветление цитоплазмы гепатоцита с формированием многочисленных вакуолей, вероятно обусловлено нарушением осмотического давления внутри клетки, вследствие изменения концентраций ионов кальция [7; 9; 10]. Согласно фундаментальным исследованиям [13] главными признаками апоптоза являются везикуляция цитоплазмы (АПТ) и фрагментация ядра (АВТ), которым в объединенном виде соответствуют обнаруженные нами при светооптическом и ультраструктурном исследовании. Большинство исследователи указывают, что продукты распада апоптотических клеток в конечном итоге захватываются макрофагами [3; 8; 9; 14; 15]. В наших исследованиях активация клеток Купфера или появление их вблизи апоптотически измененных клеток нами не отмечены. Комплексное исследование динамики естественной гибели гепатоцитов показали, что после естественной гибели клетки разрывается клеточная мембрана и содержимое цитоплазмы элиминируется в просвет синусоида. В печени кроликов и крыс, наряду с апоптозом, подобно покровному эпителию других органов, нами обнаружено явление экструзии, когда клетка целиком отделяется из печеночной пластинки. В связи с тем, что в таких клетках субклеточные структуры хорошо сохранены, то можно предположить, что такая клетка является своего рода «долгожителем», которая, не подвергаясь апоп-тозу, вынужденно отрывается от порто-венозного градиента путем экструзии и элиминируется в ток крови. Таким образом, результаты проведенных исследований предполагают существование порто-венозного градиента [4; 5; 11], в пределах которого происходит новообразование молодых, и гибель старых гепато-цитов. При этом гепатоциты вместе с стромальными элементами перемещаются из перипортальных зон в перивенозные, достигнув конечной цели, а именно терминальных печеночных венул, подвергаются экструзии или запрограммированной гибели путем первого или второго типа апоптоза. Согласно данным [3; 4; 5; 6; 11] гепатоциты из перипортальной зоны в направлении центральной перемещаются со средней скоростью 1,44 мкм/в сутки. По данным этих же исследователей цикл развития клеток печени составляет от 200 дней до 1 года [4; 5; 11]. Если взять за основу среднее количество клеток,
образующих порто-венозный градиент, то оно равно 16-18 клеткам, то общая длина градиента составит (18*22=)396 мкм. (22-средний диаметр гепатоцита). Если ежесуточное перемещение клеток составит 1,44 мкм/сутки, то полное обновление комплекса или градиента (396 мкм.: 1,44 мкм/сут = 275 суткам),
осуществляется примерно за 6-9 месяцев. На этом основании, можно заключить, что печень по сравнению другими органами эпителиального происхождения (кожа, желудок, кишечник и т. д.), относится к категории медленно обновляющихся органов, а её клетки сравнительно «долгожителями».
Рис. 3. Электронно-микроскопическое исследование печени крысы. Обозначение: Я - ядро; АП - апоптотические тела; Э - эритроциты; КЯ - конгломератый ядра; СГ - секреторные гранула; ПЦ - просвет центральной вены; М - митохондрии; БП - билиардный полюс; СП - синусоидальный полюс. А - апоптоз первого типа. Апоптотические тела, фрагменты ядра и вклинившиеся эритроциты (х10 000). Б - экструзированный гепатоцит и контактирующие с ним эритроциты (объяснение в тексте)
Выводы:
случаях после полного распада клетки элиминируются в просвет синусоида;
- в печени существует порто-венозный градиент, где клетки от момента рождения до смерти функционируют, затем на этом пути подвергаются гибели или экструзии;
в печени наряду с апоптотической гибелью обнаружены явления экструзии клеток «долгожителей», с хорошо сохраненными субклеточными структурами, вынужденно отторгнутых в просвет кровеносного русла; течение цитологической картины апоптоза в клетках печени кроликов и белых беспородных крыс почти однотипны, за исключением формирования вакуолей вначале апоптоза у крыс.
- в течение апоптоза печеночных клеток цитологически различается два типа: с преобладанием деструкции цитоплазмы (АПТ) над ядром — «бурлящая цитоплазма» и преобладанием ядерных изменений — кариорексис (АВТ) над цитоплазмой -«ядерная катастрофа», в обоих
Список литературы:
1. Черноусов А. Ф., Хоробрых Т. В., Карпова Р. В., Некрасова Т. П. Регенерация цирротической печени в экс-перименте//Медицинский журнал Юга России. - 2015. - № 2. - С. 48-53.
2. Татьянченко В. К., Овсянников А. В., Шабаршин С. А. О тактике лечения больных с дивертикулезом толстой кишки и сочетанной патологией печени//Медицинский журнал Юга России. - 2012. - № 1. - С. 58-62.
3. Пальцев М. А. Введение в молекулярную медицину. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2004.
4. Садриддинов А. Ф., Исаева Н. З. Порто-венозный градиент -функциональный элемент печени. В c6. матов: Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: Вопросы медицины». - Москва, 2013. - С. 57-66.
5. Benedetti A., Jezugel A. M., Oriondi F. Preferential distribution of apoptotic bodies in acinar zone 3 of normal human and rat liver//J. Hepatol. - 1988. - Vol. 7. - P. 319-324.
6. Colombono A., Ledda-Columbano G. M., Com G. Occurrence of cell death (apoptosis) during the involution of liver hyperplasia//Lab. Invest. - 1985. - Vol. 51. - P. 670-675.
7. Белушкина И. И. Молекулярные основы патологии апоптоза//Арх. пат. - 2001. - Т. 63, №. 1. - C. 51-60.
8. Грязин А. Е., Буеверов А. О., Ивашкин В. Т. и др. Апоптоз мононуклеаров периферической крови при хроническом гепатите С и вирусно-алкогольном гепатите//Российский журнал гастроэнтерологии, гепато-логии, колопроктологии. - 2005. - Т. 15, № 4. - С. 35-40.
9. Ивашкин В. Т. Клеточная и молекулярная биология воспаления печени//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2005. - Т. 15, № 5. - С. 13-17.
10. Серов В. В., Мухин Н. А. Иммунопатология хронических вирусных заболеваний печени//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - № 11. - С. 44-47.
11. Arber N., Zajicek G., Arnicl J. The streaming liver//Liver. - 1988. - Vol. 8. - P. 80-87.
12. Cande C., Cecconi F., Dessen P. Apoptosis-inducing factor: key to the conserved caspase- independent pathways of cell death?//Cell Sci. - 2002. - Vol. 115. - P. 4727-4734.
13. Kerr J. F. R., Willie A. H., Carrie A. R. Apoptosis: a basic biological phenomen with wid-ringing implications tissue kinetics//Brit. J. Cancer. - 1972. - Vol. 26. - P. 239-257.
14. Аруин Л. И. Апоптоз и патология печени//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - Т. 8, № 2. - С. 6-11.
15. Виноградов А. А. Влияние доксирубицина на процессы апоптоза в клетках печени в эксперименте//Укр. жур. экспер. мед. - 2008. - Т. 9, № 4. - С. 59-61.
