Сравнительное масс-спектрометрическое исследование биологически активных веществ в корнях дальневосточного женьшеня Panax ginseng C. a. Meyer, полученных методом сверхкритической экстракции

Разгонова М.П.; Каленик Т.К.; Захаренко А.М.; Кравотто Д.; Голохваст К.С.

УДК 615.322: 547.918

DOI 10.29141/2500-1922-2019-4-3-8

Сравнительное масс-спектрометрическое исследование биологически активных веществ в корнях дальневосточного женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer, полученных методом сверхкритической экстракции

М.П. Разгонова1*, Т.К. Каленик1, А.М. Захаренко1, Д. Кравотто2, К.С. Голохваст3

Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, Российская Федерация, *e-mail: [email protected] 2Туринскийуниверситет, г. Турин, Италия

3Тихоокеанский институт географии ДВО РАН, г. Владивосток, Российская Федерация

Реферат

Корни дальневосточного женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer, представленные в двух образцах - культивированный женьшень, выращенный в провинции Кэсон (Северная Корея), и дикий женьшень, собранный в Лазовском районе Приморского края (Россия), были экстрагированы методом сверхкритической СО2-экстракции. Экстракты были проанализированы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрической идентификацией. Результаты анализа показали спектр основных гинсенозидов с включением некоторых минорных групп. При расшифровке результатов обнаружены различия в спектрах двух образцов женьшеня.

Для цитирования: Разгонова М.П., Каленик Т.К., Захаренко А.М., Кравотто Д., Голохваст К.С. Сравнительное масс-спек-трометрическое исследование биологически активных веществ в корнях дальневосточного женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer, полученных методом сверхкритической экстракции //Индустрия питания|Food Industry. 2019. Т. 4, № 3. С. 65-72. DOI 10.29141/2500-1922-2019-4-3-8

Comparative Mass Spectrometric Study of Biologically Active Substances in the Roots of Far Eastern Panax Ginseng C.A. Meyer Obtained by Supercritical Extraction

Maya P. Razgonova1*, Tatiana K. Kalenik1, Aleksander M. Zakharenko1, Giancarlo Cravotto2, Kirill S. Golokhvast3

1Fast Eastern Federal University, Vladivostok, Russian Federation,*e-mail: [email protected] 2Universita degli Studi di Torino, Torino, Italy

3Pacific Geographical Institute of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok, Russian Federation

Keywords: Abstract

Researchers extracted ginseng roots of Panax ginseng C.A. Meyer presented in two samples: cultivated ginseng grown in the province of Kaesong (North Korea) and ginseng collected in the Lazovsky district of the Primorye Region (Russia) using the supercritical CO2-extraction method. They analyzed extracts by the high performance liquid chromatography (HPLC) method with mass spectrometric identification. The results of mass spectrometry showed the spectrum of the main ginsenosides with some minor groups inclusion. While interpreting results a man revealed some differences in the spectra of the two ginseng samples.

Ключевые слова:

женьшень;

сверхкритическая

экстракция;

метод ВЭЖХ;

гинсенозиды;

масс-спектрометрия;

сапогенины

ginseng;

supercritical extraction; HPLC method; ginsenosides; mass spectrometry; sapogenin

For citation: Maya P. Razgonova, Tatiana K. Kalenik, Aleksander M. Zakharenko, Giancarlo Cravotto, Kirill S. Golokhvast. Comparative Mass Spectrometric Study of Biologically Active Substances in the Roots of Far Eastern Panax Ginseng C.A. Meyer Obtained by Supercritical Extraction. Индустрия питания|Food Industry. 2019. Vol. 4, No. 3. Pp. 65-72. DOI10.29141/2500-1922-2019-4-3-8

Введение

Сверхкритическая флюидная экстракция ^Е) и сверхкритическая флюидная хроматография ^С) стали применяться с конца 1970-х годов для анализа продовольствия и определения содержания жира и уровня токсикантов. Использование сверхкритических флюидов для фракционирования и/или обогащения определенных компонентов в продуктах было зарегистрировано с 1980-х годах; в целом коммерческие экстракты, полученные с помощью сверхкритической экстракции, содержат все биологически активные компоненты наряду с инертными смесями экстрагированных составов [1; 2].

Использование сверхкритической флюидной экстракции представляет большой интерес, особенно для естественной экстракции продукта. Сам процесс сверхкритической экстракции имеет потенциальные преимущества перед обычными процессами извлечения, например: уменьшенное время экстракции, уменьшенный объем органического растворителя и возможность более селективной экстракции [3]. Сверхкритические жидкости характеризуются относительно высокой плотностью, а также относительно низкой вязкостью и высокой диффузностью [4]. Сверхкритические флюидные процессы - это процессы, в которых используется жидкость выше критической температуры и критического давления. SFE позволяет проводить экстракцию с использованием минимальных сумм органических модификаторов, процесс идет при намного более мягких условиях. Технология сверхкритических флюидов предполагает использование уникальных свойств этих жидкостей для проникновения из субстрата в матрицу клетки и проведения мягкой экстракции. Дополнительными преимуществами метода являются низкое термическое разрушение, безопасность для пищевых продуктов и биологически активных веществ.

Сверхкритический углекислый газ является привлекательным сверхкритическим растворителем из-за низких критических температур использования (30-40 °С), нетоксичности и инертности. Недостаток же использования чистого С02 для экстракции и фракционирования - отсутствие чистого дипольного момента; С02 является неэффективным растворителем для материалов с более высокой полярностью [4]. Чтобы

это преодолеть, можно использовать полярные модификаторы для увеличения общей полярности из жидкой фазы во время извлечения.

SFE применяется в экстракции многих натуральных продуктов, например плодов лимонника китайского [5], масла, богатого антиок-сидантами и полиненасыщенными жирными кислотами из микроводорослей [6], нимбина из семян дерева ним [7], антиоксидантов из семян кориандра [8], имбирного олеорезина (терпентин) из имбиря [9] и многих других соединений, экстрагируемых из растительных матриц.

Авторы статьи произвели успешную сверхкритическую экстракцию корней дальневосточного женьшеня при различных уровнях давления, температуры и с разным содержанием сораство-рителя [10].

Дальневосточный женьшень Panax ginseng C.A. Meyer - многолетнее растение, используемое в традиционной восточной медицине. Наиболее полно исследованные активные компоненты женьшеня, известные как гинсенозиды, представляют собой гомологический ряд три-терпеноидных сапонинов с различным профилем гликолизирования [11; 12].

Гинсенозиды, как сообщалось, имеют разнообразное положительное лекарственное действие - противоопухолевый, химиопрофи-лактический, иммуномодулирующий и антидиабетический эффекты [13; 14; 15].

Однако из-за тепловой нестабильности некоторых гинсенозидов выработка и качество экстрактов из дальневосточного женьшеня зависит от экстракционного метода [16].

Обычные методы экстракции для изоляции гинсенозидов из женьшеня включают Sox-hlet-экстракцию, а также ультразвуковую экстракцию и микроволновую экстракцию [17]. Некоторые обычные методы экстракции требуют долгого экстракционного периода и больших количеств растворителя, что может привести к тепловому разрушению целевых компонентов. Кроме того, часто требуется дополнительная процедура фильтрации и/или концентрации, чтобы удалить твердый остаток [18].

В России активными продолжателями научных традиций изучения дикоросов Дальнего Востока стали ученые: Г.Б. Еляков (основатель Тихоокеанского института биоорганической химии

Дальневосточного отделения РАН), И.И. Брех-ман, Ю.Н. Журавлев, В.В. Маханьков, Н. И. Уварова, Г.В. Малиновская, В.П. Булгаков, Б. Бржихнач, Т.К. Каленик [19; 20; 21; 22; 23].

Объекты и методы исследования

В качестве объекта исследования были использованы: дикий женьшень Panax ginseng C. A. Meyer (P. ginseng) из Лазовского района Приморья (Россия) и культивированный женьшень из провинции Кэсон (Северная Корея).

Сверхкритическая СО2-экстракция была осуществлена учеными Дальневосточного федерального университета с помощью экстракционного аппарата сверхкритического давления Thar SFC (США) (см. фото).

Учеными Университета Турина (Италия) для хроматографирования и идентификации использовался жидкостный хроматограф Waters Fraction Link, оснащенный детектором двойного поглощения 2487 и масс-детектором Micromass ZQ. Разделение образцов было выполнено при комнатной температуре с двойной мобильной фазой, состоящей из воды с 0,1 % муравьиной кислоты (растворитель A) и ацетонитрила (растворитель B) при скорости потока 1 мл/мин. Программа элюции градиента (время, %): 0,01, 2; 1,5, 2;15, 100; 21, 100. Элюирующая колонка Kine-tex C18 100 Á: 3 х 150 мм; 2,6 мкм; Phenomenex. Масс-детектирование производили в режиме регистрации положительно заряженных ионов. Сравнительные хроматограммы сверхкритических экстрактов дальневосточного и корейского корней женьшеня представлены на рис. 1, 2.

Результаты исследования и их обсуждение

Получение метаболических профилей - весьма важный результат биологического анализа. В настоящее время наиболее часто для этого используются методы ядерно-магнитного резо-

Сверхкритическая система флюидной экстракции TharSFC (США) Supercritical Fluid Extraction System

нанса (ЯМР), высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). В ходе исследования были использованы метод ВЭЖХ-МС/МС с дополнительной ионизацией и анализ фрагментарных ионов. Данные масс-спектрометрии (при вторичной ионизации и фрагментации молекулярных ионов) хорошо согласуются с известными структурными формулами гинсенозидов.

Рис. 1. Хроматограмма сверхкритического экстракта корня дальневосточного женьшеня P. ginseng (Россия) Fig. 1. Supercritical Chromatogram of Root Extract of the Far Eastern P. Ginseng

Рис. 2. Хроматограмма сверхкритического экстракта корня культивированного женьшеня P. ginseng

(Северная Корея)

Fig. 2. Supercritical Chromatogram of Root Extract of the Korean P. Ginseng (North Korea, Kaesong province)

Фрагменты гинсенозидов образуются за счет последовательного отщепления молекул Сахаров (глюкозы, арабинозы). Молекула любого гинсенозида состоит из сапогенина и саха-ридных боковых цепей, которые могут иметь более простые заместители (малонил). Конечные фрагменты соответствуют агликонам 20 (S): протопанаксадиолу (PPD), протопанаксатрио-лу (PPT) и октиллольным (ОТ) сапогенинам. На данный момент из всей группы растений рода Panax выделено более 620 соединений гинсенозидов [24].

На рисунках 3 и 4 представлены профили хро-матограммы некоторых гинсенозидов из дальневосточного женьшеня P. ginseng.

Ниже представлены данные масс-спектромет-рии в положительном режиме регистрации масс-спектров высокого разрешения гинсенози-дов дальневосточного женьшеня и корейского культивированного женьшеня, соответственно (см. таблицу).

В масс-спектрах экстракта дальневосточного женьшеня обнаружены достаточно редко встречающиеся кориогинсенозид KG-R2 и нотогинсе-нозид R2.

R US SI AN GINSENG_EtOH50

100 ■ #

0.65 S. 52 9.02

1.001.96 2.13

6.14 8.33

JLu

9.92

12.30

1554

-t-

5.00

10 00

15.00

1: Scan ES+ 801 593

i.07e4

20 00

0.91 9.741023 1323

RUSSIAN GlNSENG_ËtOH50 100.

iff 1.SB 3.BS ^ 7.49 °,S4j|jy J 5.00 10.00

14.69

14.77 i7.S0 20.25

15.00

1: Scan ES+ 768.469 1.04*4

20.00

RUSSIAN GtNSENGEtOHSO 100

9.94 6 79 8.99

* 1fl.W2.M 506 ** 0.67 1 3.73 1224 1495

...__..... _:__■ 'uJn.iil.............,_1_1_,_-. ■

0

5.00

10 00

1: Scan ES+ 621.507 2.21*4

20.34 16 71 20.90

15.00

20.00

Рис. 3. Масс-спектры гинсенозидов Rg1, Rk3 и нотогинсенозида R2, выделенных из дальневосточного женьшеня P. ginseng (Россия) Fig. 3. Mass Spectra of Ginsenosides Rg1, Rk3 and Notoginsenoside Rb2 Separated from Far Eastern P. Ginseng

10.41

RUSSIAN GINSENG_EtQH5Q 100

о . 2,33..... 644

s.oo

10.00

13.07 14.83 15.00

1: Scan ES+ 374.216 I29e4

17.08 19 OS Í9-66 20.89

_\_t i i I . i

20.00

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

RUSSIAN GlNSENG_ElOH5Q 100

2.56 4.60

0 ............

5.00

3,82 10.36 881 1071

7.04 11Д6

in II

10.00

15.00

1: Scan ES+ 947 555 16 49 6 37e3

20;4fl^o.w

20.00

RUSSIAN GINSENG_EtOH50 100

* 1.62 345

О ■-'-1—

6.98

9.79

9.75

9.92

JL

5 00

10.00

15 73 17 fifi 14.02 1766

_Л___J_

15.00

1: Scan ES+ Ё9Э.555 9.38e3

19.94

20.00

RUSSIAN GINSENG_EtOH50

100 &

0-

3.11

7.24

9 85 9.82 9.95

9.79 i 10 21 12 .08 13 59 _iJLj_i_

1 : Scan ES+ 1079.658 1.65e4

5.00 10.00 15.00 20.00

Рис. 4. Профиль молекулярных ионов гинсенозидов Rd, Rk1 и нотогинсенозида Rb2, выделенных из дальневосточного женьшеня P. ginseng Fig. 4. Molecular Ions Profile of Ginsenoside Rd, R1 and Notoginsenosides Rb2 Separated from Far Eastern P. Ginseng

Данные масс-спектрометрии женьшеня дальневосточного P. ginseng (Россия) и культивированного женьшеня P. ginseng (Северная Корея) Mass Spectrometry Data of Far Eastern P. Ginseng and Korean Cultivated P. Ginseng (North Korea)

Гинсенозиды МС, m/z Структурная формула Дальневосточный P.ginseng (Россия) Культивированный P. ginseng (Северная Корея)

Гинсенозид Rk3 621,507 C36H60O8 + +

Гинсенозид Rh1 639,396 C36H62O9 - +

Гинсенозид Rk1 767,459 C42H70O12 + +

Нотогинсенозид R2 768,469 C41H70O13 + -

Гинсенозид Rg3 785,565 C42H72O13 - +

Гинсенозид Rg1 801,593 C42H72O14 + +

Неизвестный гинсенозид 929,352 C48H82O17 - +

Гинсенозид Rd 947,555 C48H82O18 + +

Гинсенозид Rb2 1079,658 C53H90O22 + +

Гинсенозид Rb1 1109,606 C54H92O23 + -

Кориогинсенозид KG-R2 1122,142 C54H92O24 + -

Ацетилгинсенозид Rb1 1152,489 C56H94O24 + -

Гинсенозид Ral 1209,98 C58H98O26 + -

В экстракте корейского культивированного женьшеня был найден неизвестный гинсено-зид с предполагаемой структурной формулой

С48Н82О17 (рис. 5). Гинсенозид с такой же структурной формулой был идентифицирован в процессе исследования, проведеннного H.-P. Wang [25].

KOREAN GIN SE NG_ElOH50 100

i R1

3.63

1.61 _

382 9a 1 'f iih?84 ,4os

5.00

14.66

10.00

15.00

1: Scar ES+ 947.459 1.43e4

1882 _1_d_

20.00

KOREAN GIN SE NG_EtOH 50 1.77

100 0

B-5 7 972

11.93

419

_I__

4.61 6M J_I__j_

JU*

Id

14.56

18.52

1: Scan ES+ 929.352 3.7&e3

i.lii U , 1 .....

5.00 10.00 15.00 20.00

Рис. 5. Профиль молекулярных ионов гинсенозида Rd и неизвестного гинсенозида, выделенных из культивированного женьшеня P. ginseng (Северная Корея)

Fig. 5. Molecular Ions Profile of Ginsenoside Rd and Unknown Ginsenoside Separated from Korean Cultivated P. Ginseng

Выводы

Использование сверхкритической флюидной экстракции позволило выделить и проанализировать профили основных гинсенозидов из корней женьшеня P. ginseng, культивированного в провинции Кэсон (Северная Корея), и дикого женьшеня, собранного в Лазовском районе Приморского края. Из корней корейского культивированного женьшеня с помощью этого метода был выделен неизвестный гинсенозид с предполагаемой структурной формулой С48Н82О17.

Данный метод экстракции позволяет выделить и все основные гинсенозиды, которые характерны для женьшеня.

Методом МС/МС масс-спектрометрии были подтверждены молекулярные массы гинсенозидов и последовательность сахаров. Все они соответствуют ранее выделенным гинсенозидам, а метод SFE не приводит к химическим модификациям и может быть рекомендован для выделения гинсенозидов из сырья женьшеня.

Библиографический список

1. King, J.W. Modern Supercritical Fluid Technology for Food Applications. Annual Review of Food Science and Technology. 2014. № 5. Pp. 215-238.

2. Brunner, G. Applications of Supercritical Fluids. Annual Review of Chemical and Biomolecular engineering. 2010. № 1. Pp. 321-42.

3. Taylor, S.L.; King, J.W.; Montanari, L.; Fantozzi, P.; Blanco, M.A. Enrichment and Fractionation of Phospholipid Concentrates by Supercritical Fluid Extraction and Chromatography. Ital. J. Food Sci. 2000. № 12. Pp. 65-76.

4. Lang, Q.; Wai, C. M. Supercritical Fluid Extraction in Herbal and Natural Product Studies - a Practical Review. Talanta. 2001. № 53. Pp. 771-782.

5. Choi, Y.H.; Kim, J.; Jeon, S.H.; Yoo, K.-P.; Lee, H.-K. Optimum SFE Condition for Lignans of Schisandra Chinensis. Chromatographia. Vol. 48. Issue 9. Pp. 695-699.

6. Gouveia, L.; Noble, B.P.; Marcelo, F.M.; Mrejen, S.; Cardoso, M.T.; Pa-lavra, A.F.; Mendes, R.L. Functional Food Oil Coloured by Pigments Extracted from Microalgae with Supercritical CO2. Food Chemistry. 2007. Vol. 101. Pp. 717-723.

7. Tonthubthimthong, P.; Douglas, P.L.; Douglas, S.; Luewisutthichat, W.; Teppaitoon, W.; Pengsopa, L. Extraction of Nimbin from Neem Seeds Using Supercritical CO2 and a Supercritical CO2 + Methanol Mixture. Journal of Supercritical Fluids. 2004. Vol. 30. Pp. 287-301.

8. Yepez, B.; Espinosa, M.; Lopez, S.; Bolanos, G. Producing Antioxidant Fractions from Herbaceous Matrices by Supercritical Fluid Extraction. Fluid Phase Equilib. 2002. № 194. Pp. 879-884.

Bibliography