CC BY
0
2024. Т. 34, вып. 2
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Исследования по клеточной биологии
УДК 57.088(045)
О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов, Я.А. Романова, А.Х. Касимова, Е.В. Минаева
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНЫХ КОНЪЮГАТОВ С ПОДКЛАССАМИ ИММУНОГЛОБУЛИНА G БЫКА
Диагностические тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА) стали рутинным методом в медицинской и ветеринарной практике для выявления различных инфекционных маркеров и оценки напряженности иммунитета после вакцинации. Метод основан на иммунной реакции взаимодействия антиген-антитело. В тест-системах широко используется непрямая схема анализа для определения специфических антител в анализируемой пробе. Антитела представлены различными подклассами IgG, которые отличаются антигенными и физико-химическими свойствами, а также своей специфической активностью к антигенным детерминантам. Целью работы являлось сравнение взаимодействия иммунопероксидазных конъюгатов, используемых в диагностических тест-системах, с подклассами IgG быка. Из сыворотки крови крупного рогатого скота выделяли 1 и 2 подклассы IgG в электрофоретически гомогенной (более 98 %) и хроматографически мономерной (более 96 %) формах. Далее конструировали различные варианты схем ИФА с использованием подклассов IgG быка и иммунопероксидазных конъюгатов на основе моноклональных и поликлональных антител. Анализ проводили на основе конкурентной схемы. В результате проведенных исследований установлено, что иммунопероксидазный конъюгат на основе моноклональных антител связывается только с первым подклассом IgG и практически не взаимодействует со вторым. Иммунопероксидазный конъюгат на основе поликлональных антител связывается с обоими подклассами IgG быка, но наблюдается различная степень связывания. Уровень взаимодействия с 1 подклассом IgG выше, по сравнению со 2. Это связано с различной долей специфических антител к подклассам IgG быка в общем пуле. Выявленные различия определяют необходимость учета степени связывания иммунопероксидазных конъюгатов с подклассами иммуноглобулина G быка при конструировании диагностических тест-систем для определения специфических антител, что позволит повысить диагностическую чувствительность иммуноферментных наборов и снизить количество ложноотрицательных результатов анализа.
Ключевые слова: иммуноферментный анализ, иммунопероксидазный конъюгат, иммуноглобулин G, подклассы иммуноглобулина.
DOI: 10.35634/2412-9518-2024-34-2-182-189
Иммуноферментный анализ (ИФА) широко применяется в здравоохранении и ветеринарии в качестве диагностического метода. В основе иммуноферментного анализа лежит специфическая реакция антигена с антителом. Ферментная метка позволяет выявлять результат реакции антиген-антитело по уровню ферментативной активности. По количеству продукта реакции, образовавшегося под действием фермента, можно судить о количестве вступившего в реакцию антигена или антитела, фермент в этих методах служит маркером специфического взаимодействия. В диагностических тест-системах распространена непрямая схема анализа по определению в образцах сыворотки крови специфических антител, в основном представленных иммуноглобулинами класса О (^О). Применение в иммунопе-роксидазных коньюгатах (ИПК) моноклональных антител позволило значительно повысить аналитическую чувствительность иммунохимических методов и снизить расход антигена. Но высокоспецифическое связывание, характерное для моноклональных антител, может снижать диагностическую чувствительность тест-систем из-за имеющих различную конформационную структуру антигенных детерминант у подклассов ^О. Также известно, что у подклассов ^О животных отличается спектр специфической активности антител к патогенам [1]. Эта гетерогенность зависит от возраста, породы, перенесенных инфекций и проведенных вакцинаций. В отличие от подклассов ^О других млекопитающих между константными доменами подклассов ^О быка имеются структурные различия, которыми в свою очередь объясняются антигенные и физико-химические различия между ними [2; 3]. В данной работе изучали взаимодействие иммунопероксидазных коньюгатов на основе моноклональных и по-ликлональных антител с подклассами ^О крупного рогатого скота (КРС).
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Материалы и методы исследования
Для выделения подклассов IgG использовали сыворотку крови КРС, полученную от здоровых животных из эпизоотически благополучных хозяйств.
Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли биуретовым методом при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. [4]
Фракционирование белков сыворотки проводили при помощи полиэтиленгликоля (ПЭГ). Гамма-глобулиновую фракцию выделяли из сыворотки крови КРС путем внесения сухого ПЭГ-4000 до 15 % (масса-объём), после добавления раствор перемешивали в течение 30 мин. Полученную ПЭГ-суспензию центрифугировали в течение 20 мин при 4200 g. Гамма-глобулиновый осадок, обогащенный иммуноглобулином G, растворяли в 0,15 М растворе хлорида натрия, руководствуясь концентрацией общего белка в пределах 85-95 мг/мл.
Эксклюзионная хроматография. Препаративную хроматографию выполняли в колоночном варианте на жидкостном хроматографе низкого давления LP Chromatography System (Bio-Rad, США). Использовали сорбент Sephacryl S-200 со следующими параметрами: объём колонки 490 мл, скорость потока - 0,5 мл/мин. Уравновешивали колонку и проводили хроматографию в 0,15 М растворе NaCl. Аналитическую хроматографию выполняли при помощи жидкостного хроматографа умеренного давления NGC Quest 10 Chromatography System (Bio-Rad, США) на колонке Enrich SEC 650 со следующими параметрами: объём колонки 24 мл, скорость потока - 1 мл/мин. Уравновешивали колонку и проводили хроматографию в 0,15 М растворе NaCl.
Аффинная хроматография. Разделение подклассов проводили в колоночном варианте, в режиме сорбции второго подкласса иммуноглобулина G быка (объём колонки - 5,25 мл). Использовался сорбент Affi-Prep Protein-A (Bio-Rad, США). Стартовым раствором являлся 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,0±0,01, десорбирующим - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0±0,01. Скорость элюции поддерживалась на уровне 0,4 мл/мин.
Результаты хроматографического процесса оценивали по величине оптической плотности при длине волны 280 нм (ОП280).
Электрофоретический анализ проводили в вертикальной системе электрофореза в полиакрила-мидном геле с использованием системы Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, США). Гели сканировали на гель-документирующей системе GelDoc EZ System (Bio-Rad, США). Обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения GelDoc (Bio-Rad, США). Образцы исследовали диск-электрофорезом в однородном (8 %) ПААГ в диссоциирующих условиях. Количество белка на трек составляло 25 мкг. В качестве лидирующего красителя использовали бромфеноловый синий. Концентрирование и разделение образцов проводили при напряжении 100-120 В в концентрирующем геле и далее при 200 В до выхода лидирующего красителя из геля. После фиксации гели окрашивали Ку-масси бриллиантовым синим R-250.
Иммуноферментный анализ. Иммунопероксидазные конъюгаты против IgG (ИПК антиIgG) быка на основе моноклональных и поликлональных антител использовались из комплекта коммерческих диагностических тест-систем. Разведение ИПК антиIgG подбирали в прямой схеме анализа. ИПК антиIgG доводили до стандартного разведения, при котором ИПК антиIgG с адсорбционно иммобилизованной при различных концентрациях высокоочищенной фракцией IgG (0,15-40 мкг/мл) обеспечивал значение оптической плотности при 495 нм (D495) 1,0-1,4 в присутствии о-фенилендиамина (ОФД). Использование различных концентраций иммобилизованной фракции IgG позволяет максимально снизить неспецифическую сорбцию белка и сформировать мономолекулярный слой. Адсорбционную иммобилизацию проводили в течение ночи при температуре (8±2) оС из растворов IgG, приготовленных на основе 0,05 М натрий-бикарбонатного буфера, рН 9,5±0,2. Операции отмывки и разведения ИПК антиIgG выполняли с помощью 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора, рН 7,2 ± 0,2 с 0,05 %-ным твин-20 и 2,8 % хлоридом натрия. В качестве субстрата использовали ОФД в 0,5 М цит-ратно-фосфатном буферном растворе, рН 5,0+0,05. Останавливали ферментативную реакцию 10 %-ным раствором серной кислоты. Изменение цветности субстрата ОФД регистрировали по величине D495 на вертикальном абсорбциометре Multiskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия) [5; 6]. Сравнительное изучение взаимодействия иммунопероксидазных конъюгатов в стандартном разведении с подклассами иммуноглобулина G быка проводили при помощи прямого конкурентного метода.
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
2024. Т. 34, вып. 2
Результаты и их обсуждение
По результатам исследований гетерогенности IgG быка выделяют существование трех подклассов: IgG1, IgG2a и IgG2b по серологической классификации J.E. Butler [7]. IgG2b представлен в сыворотке в небольших концентрациях вследствие низкой экспрессии его генов, в связи с этим далее рассматривали только IgG1 и IgG2а, последний традиционно обозначают как IgG2 [2].
На первом этапе проводили выделение подклассов IgG быка из сыворотки крови КРС. В процессе фракционирования использовали методы, отличающиеся наиболее мягкими условиями проведения стадий очистки для минимизации нарушений конформационной нативности целевого белка. Для получения гамма-глобулиновой фракции сыворотки использовали полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 4000, так как ПЭГ не приводит к денатурации белка и оказывает стабилизирующее действие на молекулу. Процесс осаждения гамма-глобулиновой фракции сыворотки проводили с использованием 15 % концентрации ПЭГ при комнатной температуре, значение рН доводили до 7,0 ± 0,1. Распределение общего белка в целевой гамма-глобулиновой фракции составило 61±5 %. По результатам обработки элек-трофореграмм в целевом осадке преимущественно находится IgG фракция (чистота 60 ± 3 %) с примесью альбумина и других белков (рис. 1.).
Высокомолекулярные соединения (>150 кДа)
^-глобул иновая фракция (150-160 кДа}
Примесные белки, включая фракцию альбумина (<140 кДа)
12 3
Рис. 1. Электрофореграммы образцов осадка и надосадка после фракционирования сыворотки 15 % ПЭГ. Примечание. Распределение образцов по трекам: 1 - сыворотка КРС; 2 - осадок; 3 - надосадок
Рис. 2. Профили эксклюзионной хроматографии и электрофореграммы целевых фракций: а) хроматограмма гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови и электрофореграмма конечного образца; б) хроматограмма рехроматографии фракции IgG и электрофореграмма
конечного образца
Далее гамма-глобулиновую фракцию подвергали двухстадийной очистке с использованием эксклюзионной хроматографии низкого давления с последующей рехроматографией. Эксклюзионная хроматография позволяет разделять белки по молекулярным параметрам, причем режимы проведения стадий очистки отличаются наиболее щадящими условиями для сохранения нативной конформации белка.
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
После 1 стадии хроматографии отбирали элюированные фракции, содержащие целевой белок (IgG), которые в дальнейшем объединяли на основе результатов электрофоретического анализа (рис. 2(а)).
Для выполнения последующей рехроматографии проводили концентрирование белка при помощи осаждения IgG 15 % ПЭГ. Повторную хроматографию проводили аналогично ранее изложенному способу. Профиль хроматографического процесса представлен на рис. 2(б). Результаты электрофоретического анализа объединённого пика показывают, что в процессе очистки гамма-глобулиновой фракции сыворотки была получена электрофоретически гомогенная фракция IgG с электрофоретиче-ской чистотой более 98 %.
Далее для выделения подклассов из фракции IgG использовали аффинную хроматографию на сорбенте Affi-Prep Protein-A как наиболее селективную стадию разделения, основанную на различном сродстве Fc-фрагментов подклассов иммуноглобулина G быка к Protein A Staphylococcus aureus. Хроматографию проводили в режиме сорбции IgG2. Результаты аффинной хроматографии представлены на рис. 3 (а).
Рис. 3. Профиль аффинной хроматографиии и электрофореграммы образцов подклассов IgG: а) профиль аффинной хроматографии разделения подклассов IgG; б) результаты электрофореза образцов объединенных фракций после аффинной хроматографии 1 - IgG1 (1 пик аффинной хроматографии); 2 - IgG2 (2 пик аффинной хроматографии). Примечание. Вертикальными линиями показаны объединяемые фракции
к_
(а)
N я
О
Мономерный IgG.
содержание мономеров - 96 %
Я * V ■ >
Ч iff Л Н
Номер фракции
Мономерный IgG
содержание мономеров - Si
^ Номерфракцин
Рис. 4. Профиль эксклюзионной хроматографии умеренного давления образцов подклассов IgG:
а) образец IgG1; б) образец IgG2. Примечание. Вертикальными линиями показаны объединяемые фракции
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
2024. Т. 34, вып. 2
При используемых условиях элюирования не связывается с сорбентом и проходит через объём колонки транзитом [8]. Сорбированную фракцию IgG2 элюировали за счет снижения значения рН буфера. После проведения аффинной хроматографии транзитный пик составил 48 % от нанесенного общего количества белка на колонку, десорбированный пик - 52 %. Полученные пики после аффинной хроматографии анализировали с помощью диск-электрофореза в ПААГ в диссоциирующих условиях (рис. 3 (б)). Полученные по результатам обработки электрофореграмм данные свидетельствуют, что оба пика аффинной хроматографии представлены иммуноглобулином G с молекулярной массой от 150 до 160 кДа с электрофоретической чистотой более 98 %.
Полученные образцы подклассов IgG быка анализировали на наличие агрегатов, димеров и фрагментов, которые определяли при помощи эксклюзионной хроматографии умеренного давления (рис. 4). На полученных хроматографических профилях представлен единственный пик, элюирован-ный в объеме, соответствующем выходу иммуноглобулина G. Содержание мономеров подклассов IgG в полученных объединенных фракциях составляет более 96 %.
В результате фракционирования сыворотки крови КРС были получены 1 и 2 подклассы IgG в электрофоретически гомогенной (чистота более 98 %) и хроматографически мономерной (более 96 %) формах.
На втором этапе конструировали тест-систему на основе прямой конкурентной схемы ИФА. В лунках полистиролового планшета проводили раздельную адсорбционную иммобилизацию подклассов IgG1 и IgG2 при концентрации белка 10 мкг/мл. Далее в лунки с IgG1 вносили 100 мкл IgG1 и 100 мкл ИПК антиIgG на основе моноклональных или поликлональных антител в 2 раза более концентрированном растворе, нежели ранее определенном стандартном разведении. Начальные концентрации подклассов IgG составили 40 мкг/мл, и далее образцы титровали с шагом 4. После процедуры встряхивания и инкубации планшетов при температуре 37,0±0,2 оС добавляли субстрат и по количеству образовавшего продукта ферментативной реакции строили зависимость В495 в лунках от концентрации добавленного гомологичного конкурента. Эти же процедуры выполняли и с IgG2. Результаты исследования представлены на рис. 5 и 6.
С, мкг/мл
—— —
Рис. 5. Результаты конкурентной схемы ИФА подклассов IgG быка с моноклональным ИПК антиIgG
Результаты проведенного конкурентного ИФА анализа показывают, что ИПК антиIgG на основе моноклональных антител взаимодействует с IgG1 быка. На графике представлена классическая кривая снижения оптической плотности при увеличении концентрации гомологичного конкурента, в частности, IgG1. Начальное значение оптической плотности при минимальных концентрациях конкурента соответствовало величине стандартного разведения. В то же время в конкурентной схеме с IgG2 величина оптической плотности демонстрирует низкий уровень_связывания с гомологичным конкурентом. Это свидетельствует о практически полном отсутствии взаимодействия ИПК антиIgG с IgG2 быка. Мо-ноклональные антитела, используемые в данном конъюгате, специфически связываются с антигенной детерминантой, представленной на молекулах IgG быка только 1 подкласса, и не распознают молекулы 2 подкласса.
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
С, мкг/мл
——«"1862
Рис. 6. Результаты конкурентной схемы ИФА подклассов IgG быка с поликлональным ИПК антиIgG
Изучение ИПК антиIgG на основе поликлональных антител с подклассами IgG быка показало, что ИПК антиIgG связывается с обоими подклассами IgG. Полученные графики демонстрируют наличие конкурентных взаимодействий, но значения оптической плотности, при отсутствии конкурента, говорят о различном количественном представительстве антител к подклассам в поликлональном им-мунопероксидазном конъюгате. Значение оптической плотности при стандартном разведении ИПК ан-тиIgG примерно в 2 раза выше у IgG1 по сравнению с IgG2, что говорит о меньшей доле антител ко 2-му подклассу IgG быка в поликлональном ИПК антиIgG. Выявленные различия во взаимодействии поликлональных ИПК к подклассам IgG могут быть следствием различных причин. Поликлональные IgG являются результатом секреции многих клонов В-лимфоцитов и, следовательно, совокупность антител в ИПК антиIgG направлена против множества антигенных детерминант молекулы IgG. Так как иммуногенность подклассов IgG может отличаться, то это приведет к различной доле специфических антител в общей совокупности антител, представленных в ИПК антиIgG. На спектр специфических антител также могут влиять особенности иммунизации и качество использованного антигена для получения антисыворотки с целью изготовления ИПК антиIgG. Способность исследованного ИПК ан-тиIgG на основе поликлональных антител взаимодействовать с обоими подклассами IgG быка, в отличие от ИПК антиIgG на основе моноклональных антител, позволяет дополнительно выявлять в исследуемых образцах специфические антитела из разных подклассов. Данные особенности поликлональных ИПК антиIgG могут повышать диагностическую чувствительность анализа при конструировании тест-систем на основе ИФА для определения специфических антител.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследованные иммунопероксидазные конъюгаты против IgG быка по-разному взаимодействуют с подклассами иммуноглобулина G. Несмотря на высокую степень структурной гомологии и аминокислотной последовательности подклассов, преимущественное связывание иммунопероксидазных конъюгатов происходит с IgG1. Исследуемый конъюгат на основе моноклональных антител практически не взаимодействует с IgG2. Поликло-нальный конъюгат связывается с обоими подклассами IgG, но в меньшей степени с IgG2. Уровень взаимодействия с 1 подклассом IgG выше, по сравнению со 2, что определяется различным количественным представительством специфических антител к подклассам IgG быка в общем пуле. На основании экспериментальных данных можно заключить, что полученные результаты могут быть связаны с особенностями технологии получения исходных антител для синтеза конъюгатов, в т. ч. с различной степенью иммуногенности подклассов IgG быка. Таким образом, обнаруженные различия связывания исследованных ИПК антиIgG с подклассами иммуноглобулина G необходимо учитывать при конструи-
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
2024. Т. 34, вып. 2
ровании тест-систем и ориентироваться на выбор иммунопероксидазных конъюгатов на основе полик-лональных антител. Это позволит повысить диагностическую чувствительность иммуноферментных наборов и снизить количество ложноотрицательных результатов анализа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ulfman L.H., Leusen Jeanette H.W., Savelkoul Huub F.J., Warner John O., van Neerven R.J. Joost. Effects of Bovine Immunoglobulins on Immune Function, Allergy, and Infection // Frontiers in Nutrition. 2018. Vol. 5(52). P. 1-20.
2. Nezlin R.S. The Immunoglobulins. Structure and Function. San Diego: Academic Press, 1998. 269 p.
3. Kacskovics I., Butler J.E. The heterogeneity of bovine IgG2 - VIII. The complete cDNA sequence of bovine IgG2a (A2) and an IgG1 // Mol. Immunol. 1996. Vol. 33(2). P. 189-195.
4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, пер. с англ. М.: Мир, 1991. 543 с.
5. Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Amsterdam: Elsevier, 1985. P. 329-384.
6. Kurstak E. Enzyme Immunodiagnosis. London: Acad. Press, 1986. P. 116-171.
7. Butler J.E., Heyermann H., Frenyo L.V., Kiernan J. The heterogeneity of bovine IgG2. II. The identification of IgG2b. // Immunol. Lett. 1987. Vol. 16(1). P. 31-38.
8. Lawman M.J., Joiner S., Gauntlett D.R., Boyle M.D. Interaction of bovine immunoglobulin gamma 2 (IgG2) with staphylococcal protein A: evidence for IgG2a and IgG2b sub-subclasses in the bovine // Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1985. Vol. 8(1). P. 1-8.
Поступила в редакцию 14.05.2024
Нестерова Ольга Юрьевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии, клеточной биологии и биотехнологии E-mail: nesterova_70@mail.ru
Кузнецов Александр Иванович, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии, клеточной биологии и биотехнологии E-mail: kaliv66@mail.ru
Романова Яна Анатольевна, ассистент кафедры физиологии, клеточной биологии и биотехнологии E-mail: i.romanova.jane@gmail.com
Касимова Айгуль Хасановна, ассистент кафедры физиологии, клеточной биологии и биотехнологии E-mail: ajgul-kasimva@rambler.ru
Минаева Елена Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии, клеточной биологии и биотехнологии E-mail: cndt_ml@mail.ru
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
O.Yu. Nesterova, A.I. Kuznetsov, Ya.A. Romanova, A.Kh. Kasimova, E.V. Minaeva COMPARATIVE STUDY OF THE INTERACTION OF IMMUNOPEROXIDASE CONJUGATES WITH BOVINE IMMUNOGLOBULIN G SUBCLASSES
DOI: 10.35634/2412-9518-2024-34-2-182-189
In medical and veterinary practice, diagnostic test systems based on the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) have become a routine technique for identifying various infectious markers and assessing the strength of immunity after vaccination. This technique is based on the immune reaction of antigen-antibody interaction. An indirect analysis scheme for determining specific antibodies in an analyzed sample is widely used in test systems. Antibodies are represented by various IgG subclasses, which differ in antigenic and physicochemical properties as well as in their specific activity to antigenic determinants. The aim of this work was to compare the interaction of immunoperoxidase conjugates used in diagnostic test systems with bovine IgG subclasses. IgG subclasses 1 and 2 in the electrophoretically homogeneous (more than 98 %) and chromatographically monomelic (more than 96 %) forms were isolated from cattle blood serum. Further, various modifications of ELISA schemes using bovine IgG subclasses and immunoperoxidase conjugates based on monoclonal and polyclonal antibodies were constructed. The results of this study have revealed that the monoclonal antibody immunoperoxidase conjugate binds only to the first IgG subclass and practically does not interact with the second one. The polyclonal antibody immunoperoxidase conjugate binds to both bovine IgG subclasses, but varying degrees of binding have been observed. The level of interaction with IgG subclass 1 is higher compared to IgG subclass 2.This is due to
СЕРИЯ БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
the different proportions of specific antibodies to bovine IgG subclasses in the total pool. These identified differences determine the necessity of accounting the degree of immunoperoxidase conjugates binding to bovine immunoglobulin G subclasses when designing diagnostic test systems for determining specific antibodies. This will increase diagnostic sensitivity of enzyme immunoassay kits and reduce the number of false negative test results.
Keywords: enzyme immunoassay, immunoperoxidase conjugate, immunoglobulin, immunoglobulin G subclasses.
REFERENCES
1. Ulfman L.H., Leusen Jeanette H.W., Savelkoul Huub F.J., Warner John O., van Neerven R.J. Joost. Effects of Bovine Immunoglobulins on Immune Function, Allergy, and Infection, in Frontiers in Nutrition, 2018, vol. 5, article 52, pp. 1-20.
2. Nezlin R.S. The Immunoglobulins. Structure and Function, San Diego: Academic Press, 1998, 269 p.
3. Kacskovics I., Butler J.E. The heterogeneity of bovine IgG2 - VIII. The complete cDNA sequence of bovine IgG2a (A2) and an IgG1, in Molecular Immunology, 1996, vol. 33, no. 2, pp. 189-195.
4. Dawson R., Elliot D., Elliot W., Jones K. Handbook of Biochemist (Trans. from Engl.). Moscow: Mir Publ., 1991, 544 p. (in Russ.).
5. Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Amsterdam: Elsevier, 1985, pp. 329-384.
6. Kurstak E. Enzyme Immunodiagnosis, London: Acad. Press, 1986, pp. 116-171.
7. Butler J.E., Heyermann H., Frenyo L.V., Kiernan J. The heterogeneity of bovine IgG2. II. The identification of IgG2b., in Immunology Letters, 1987, vol. 16, no. 1, pp. 31-38.
8. Lawman M.J., Joiner S., Gauntlett D.R., Boyle M.D. Interaction of bovine immunoglobulin gamma 2 (IgG2) with staphylococcal protein A: evidence for IgG2a and IgG2b sub-subclasses in the bovine, in Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 1985, vol. 8, no. 1, pp. 1-8.
Received 14.05.2024
Nesterova O.Yu., Candidate of Biology, Associate Professor of the Department of Physiology, Cell Biology and Biotechnology E-mail: nesterova_70@mail.ru
Kuznetsov A.I., Candidate of Biology, Associate Professor of the Department of Physiology, Cell Biology and Biotechnology E-mail: kaliv66@mail.ru
Romanova Ya.A., Assistant of the Department of Physiology, Cell Biology and Biotechnology E-mail: i.romanova.jane@gmail.com
Kasimova A.K., Assistant of the Department of Physiology, Cell Biology and Biotechnology E-mail: ajgul-kasimva@rambler.ru
Minaeva E.V., Candidate of Biology, Associate Professor of the Department of Physiology, Cell Biology and Biotechnology E-mail: cndt_ml@mail.ru
Udmurt State University
Universitetskaya st., 1/1, Izhevsk, Russia, 426034
