Сравнительное исследование воздействия низкотемпературной аргоновой плазмы и слабых переменных магнитных полей на рост и экспрессию генов культивируемых стволовых и трансформированных клеток человека Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

УДК: 57.043 DOI: 10.12737/23847

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АРГОНОВОЙ ПЛАЗМЫ И СЛАБЫХ ПЕРЕМЕННЫХ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ НА РОСТ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ СТВОЛОВЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

А.М. ЕРМАКОВ, А.В. ЗНОБИЩЕВА, О.Н. ЕРМАКОВА, А.Л. ПОПОВ, А.К. ЮНУСОВА

ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ул. Институтская 3, Пущино, 142290, Россия

Аннотация. Проведено сравнительное исследование воздействия низкотемпературной аргоновой плазмы и слабых переменных магнитных полей в режиме параметрического резонанса на рост и экспрессию генов культивируемых клеток человека. Однократное облучение низкотемпературной аргоновой плазмой стволовых клеток в течение 10-15 мин активировало экспрессию генов пролиферации, стволовости и дифференцировки, одновременно умеренно тормозило транскрипцию генов апоптоза и некроза; в результате ускорялся роста культуры клеток. Экспозиция в слабом комбинированном магнитном поле (70 мкТл), настроенном на ионы кальция, не влияла на рост стволовых клеток на фоне активации экспрессии генов, как и при воздействии низкотемпературной аргоновой плазмой. В быстрорастущих трансформированных клетках человека линии MNNG/HOS после облучения низкотемпературной аргоновой плазмой в течение 10 мин или при экспозиции в слабом комбинированном магнитном поле активировалась экспрессия генов дифференцировки, некроза и апоптоза, без изменения скорости роста клеток. После более длительного 15-минутного облучения низкотемпературной аргоновой плазмой происходило торможение роста трансформированных клеток человека.

Ключевые слова: низкотемпературная аргоновая плазма, слабые переменные магнитные поля, мезенхимальные стволовые клетки человека, трансформированные клетки человека, пролиферация, экспрессия генов.

COMPARATIVE STUDY OF THE EFFECTS OF LOW-TEMPERATURE ARGON PLASMA AND WEAK ALTERNATING MAGNETIC FIELDS ON THE GROWTH AND GENE EXPRESSION CULTURED STEM CELLS AND TRANSFORMED HUMAN CELLS

A.M. ERMAKOV, A.V. ZNOBISCHEVA, O.N. ERMAKOVA, A.L. POPOV, A.K. YUNUSOVA

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of the Russian Academy of Sciences Institutskaya str., 3, Pushchino, 142290, Russia

Abstract. The authors were carried out a comparative study of the effects of low-temperature argon plasma (LTAP) and weak alternating magnetic fields in parametric resonance mode on the growth and gene expression of cultured human cells. A single irradiation of stem cells by LTAP for 10-15 min has activated the expression of the genes of proliferation, differentiation and stemness and moderately inhibited the transcription of the genes of apoptosis and necrosis, resulting in acceleration of cells culture growth. The exposition by the alternated weak magnetic field (70 |jT) tuned with the calcium ions has demonstrated the absence of the effect on stem cells growth against the activation of the genes expression. In growing transformed human cells line MNNG/HOS the activation of the gene expression of differentiation, apoptosis and necrosis had occurred after the LTAP irradiation by 10 minutes or after the exposure to the combined weak magnetic field without altering the cells growth rate. In the transformed human cells after it's more prolonged exposure by LTAP for 15 minutes the inhibition of the cells culture growth has been observed.

Key words: low-temperature argon plasma, weak alternating magnetic field, human mesenchymal stem cells, transformed human cells, proliferation, gene expression.

В ходе исследований дезинфицирующей способности низкотемпературной аргоновй

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

плазмы (НТАП) при лечении инфицированных ран и язв [5-7,11] возникли обоснованные опасения, что высокая бактерицидная активность холодной плазмы в отношении микрофлоры, колонизирующей раны и язвы, может сочетаться с угнетением процессов регенерации и заживления. Неопределенность в этом вопросе связана, прежде всего, с тем, что основная масса базовых исследований выполнена in vitro и с не изученностью влияния облучения НТАП на процессы регенерации поврежденных тканей и пролиферацию стволовых клеток in vivo. Еще большая неопределенность и противоречивость в прогнозировании и применении в регенераторной медицине характерна и для издавна используемых высокоамплитудных магнитных полей порядка 10-3 Тл и более. Несмотря на огромный массив данных по маг-нитотерапии, это воздействие до сих пор оценивается как трудно воспроизводимое, непредсказуемое по конечному эффекту [8,9]. Ранее в лаборатории В.В Леднева было показано, что слабые комбинированные магнитные поля (КМП) в режиме параметрического резонанса, в отличие высокоамплитудных магнитных полей, могут достаточно воспроизводимо влиять на рост и развитие различных биологических объектов [1]. Наш опыт исследований, выполненных под руководством В.В. Леднева, по воздействию слабых КМП на скорость регенерации плана-рий дал основания предположить, что уменьшение дозы облучения НТАП может оказаться столь же продуктивным, как и уменьшение амплитуды и частоты КМП в отношении регенераторных процессов. Планарии являются классическим объектом для изучения процессов регенерации потому, что клеточная масса их тела на 30% представлена стволовыми клетками - необластами. Именно поэтому для оценки возможного регенераторного воздействия НТАП на более простом объекте нами были проведены исследования влияния низкоинтенсивных режимов НТАП в сравнении со слабыми КМП, настроенными на ионы кальция или калия, для которых нами ранее показана регенераторная активность [2,4]. Для полноты сравнения мы исследовании влияние обоих видов слабых физических воздействий не только на рост клеточных культур, но и на экспрессию ключевых групп генов, определяющих течение процессов пролиферации, дифференцировки и

гибели стволовых и трансформированных клеток человека.

Цель исследования заключалась в сравнительном изучении воздействия низкотемпературной аргоновой плазмы и слабых переменных магнитных полей, настроенных в режиме параметрического резонанса на ионы кальция или калия, на рост культивируемых мезенхи-мальных стволовых и трансформированных клеток человека и экспрессию генов регенераторного процесса в этих клетках.

Материалы и методы исследования. Культура клеток. В эксперименте использовали первичную культуру мезенхимальных стволовых клеток (МСК) пульпы зуба (Th) и линию трансформированных клеток MNNG/hos (Human Caucasian osteosarcoma) человека. Клетки культивировали в 96 луночных планшетах в среде DMEM/F-12 (1:1, "Life technologies", США), с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина при 37оС в атмосфере воздуха с повышенным до 5% содержанием СО2.

Облучение клеток низкотемпературной аргоновой плазмой. Низкоинтенсивное облучение клеток НТАП проводили однократно в течение 5-20 мин через сутки после высева клеток в планшеты на расстоянии от апертуры излучателя плазмотрона 8 см (как минимум 16-кратное уменьшение дозы по сравнению с дезинфицирующим режимом НТАП). В качестве генератора НТАП использовали MicroPlasterв (ADTEC Plasma Technology Co. Ltd., Япония, Германия). При этом планшет разделяли на 2 части: одну половину облучали холодной плазмой, а вторую, служившей контролем, закрывали непроницаемой для плазменного облучения крышкой. После сеанса облучения в культуре клеток меняли среду. Далее производили скрининг биологических эффектов (определение конфлюентности) и забор клеток для анализа уровня экспрессии генов через 2, 24, 48 и 72 часа после облучения.

Техника получения магнитных полей и экспонирование в нем клеток. КМП, состояло из постоянного поля Земли, Bdc, и искусственно создаваемого переменного поля низкой частоты, BAC, направленного коллинеарно к земному полю. Величина постоянной компоненты поля Bdc определялась с помощью феррозондового магнитометра типа СГК-64М (завод «Геолого-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

разведка») с точностью +0.01 мкТл. Переменную компоненту КМП создавали с помощью катушечной пары Гельмгольца диаметром 60 см. Амплитуду (70 мкТл) и частоту (15 и 29 Гц) переменной синусоидальной компоненты задавали с помощью специально сконструированного генератора. Значения соотношения амплитуд постоянной и переменной компонент поля Bac/Bdc, а также частоты, /ас, переменной компоненты поля устанавливались в соответствии с теорией магнитного параметрического резонанса В.В. Леднева. Согласно теории, наибольшая величина биологического эффекта достигается при точной настройке КМП на «циклотронную» частоту для иона кальция или калия при Bac/Bdc=1,84 [3].

Планшет с клеточной культурой помещали в экспериментальную камеру, расположенную в фокусе магнитного поля катушек Гельмголь-ца. Контрольный планшет находился в такой же термостатируемой камере вне действия переменного магнитного поля. Клетки экспонировали в магнитном поле в течение 4-5 суток. Величину конфлюентности и уровень экспрессии генов определяли ежедневно.

Анализ конфлюентности клеточной культуры. Скорость роста клеточной культуры оценивали по динамике изменения конфлю-ентности (занимаемой клетками площади) с помощью планшетного ридера Clone Pix Imager (Molecular Devices, США). На каждую экспериментальную точку приходилось не менее 4 измерений (по 48 лункам каждое).

МТТ-тест. Жизнеспособность клеток определяли по активности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ с помощью МТТ-теста, основанного на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид). Реагент в количестве 0,5 мг/мл вносили в лунки дополнительных планшетов с культурой клеток через 24 или 72 часа культивирования клеток. Оптическую плотность формаза-на, образовавшегося при восстановлении бесцветной соли тетразолия, определяли при А=540 нм на фотометре (BioRad, USA).

Определение экспрессии генов (ПЦР в реальном времени). Матричную РНК выделяли набором с магнитными частицами (Sileks, Россия), отбор клеток осуществляли через 2, 24, 48, 72 или 96 часов после облучения. Обратную

транскрипцию проводили набором фирмы Sileks (Россия). ПЦР выполняли в реакционной смеси с SybrGreen (Syntol, Россия) на амплифика-торе CFX-96 (BioRad, USA) или ABI 7500 Fast RealTime PCR System (Applied Biosystems, США). В клетках человека регистрировали экспрессию 96 генов, ответственных за 25 ключевых клеточных процессов. Уровень транскрипции генов нормировался по средней величине уровней экспрессии хаус-кипинг генов ß-актина, rplpO (ribosomal protein, large, P0) и gapdh (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Ген - специфические праймеры подбирали в программе Primer Express (Applied Biosystems, США). Каждое измерение проводили на двух одинаковых плашках (внутренний повтор) и усредняли по 2-м независимым образцам клеток. Негативным контролем служили образцы, обрабатываемые без стадии обратной транскрипции. Полученные данные экспрессии анализировали с помощью онлайн сервиса http://www.sabiosciences.com/, программы mayday-2.14 (Center for Bioinformatics Tübingen, Германия) и программы Genesis [10]. Учитывались лишь те результаты, для которых изменения уровня экспрессии генов наблюдались при p<0,05.

Статистическая обработка полученных результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программы "Sigma-Plot 9.11" (Systat Software Inc., Германия) методом дисперсионного однофакторного анализа ANOVA, с использованием параметрического критерия Стьюдента. Результаты представлены на рисунках в виде средних значений ± стандартное отклонение.

Результаты и их обсуждение. Облучение НТАП в течение 5 мин не изменяло последующую динамику роста культуры МСК Th и трансформированных клеток остеосаркомы линии MNNG/HOS. Тенденция к торможению роста трансформированных клеток на 23% наблюдалась лишь через 5 суток после облучения (рис. 1). После 10 мин облучения рост культуры МСК активировался через 4 и 5 суток культивирования (38 и 33% соответственно). Рост клеток MNNG/HOS после 10 мин облучения не ускорялся.

После более длительного 15-минутного облучения НТАП рост стволовых клеток не изменялся в первые 4 суток. Через 5 суток плотность культуры облученных клеток возрастала на 26% по сравнению с контролем. В отличие от ство-

10ШМАЬ ОБ ШШ МБЭТСАЬ ТЕСИМОШСШБ - 2016 - V. 23, № 4 - Р. 24-32

ловых клеток рост культуры трансформированных клеток MNNG/HOS после 15-минтуного облучения был значительно угнетен через 3, 4 и 5 суток на 25, 32 и 41% соответственно.

Облучение НТАП в течение 20 мин значительно тормозило (на 60-67%) рост стволовых и трансформированных клеток, начиная со вторых суток после воздействия (рис. 1, г).

Изменение экспрессии генов в стволовых и трансформированных клетках человека после облучения НТАП. В стволовых клетках первоначально (через 2 часа) после 10-минутного облучения наблюдался всплеск транскрипции большинства исследуемых генов. Через сутки активировалась дополнительная серия иных генов, а уровень экспрессии предыдущих генов несколько снижался. Через 2 суток происходила вторая волна активации экспрессии генов, которая характеризовалась более выраженной специфичностью: в большей степени активировались гены кластера дифференцировки, анти-апоптотические и ответственные за регуляцию свойств стволовости. Через трое суток уровень транскрипционной активности генов снижался. Облучение стволовых клеток в течение 15 мин в меньшей степени стимулировало экспрессию генов, и появлялись признаки клеточного повреждения (рис. 2, а).

В трансформированных клетках, отличающихся исходно повышенным уровнем экспрессии, признаки повреждения появлялись раньше, чем в стволовых: уже после 10 минутного облучения НТАП. При этом происходила активация генов апоптоза. Большая доза облучения (15 мин) в большей степени активировала транскрипцию генов деления трансформированных клеток и одновременно увеличивала пул экс-прессируемых генов, ответственных за диффе-ренцировку и гибель (рис. 2, б). Причем через 2 и 3 суток культивирования после облучения значительная масса клеток гибла и откреплялась от поверхности культуральных плашек.

Таким образом, кратковременное облучение НТАП стволовых клеток способствовало начальной неспецифической активации экспрессии генов, сменяющейся запуском транскрипции генов, контролирующих дифференцировку и проявление свойств стволовости. В трансформированных клетках облучение НТАП инициировало активацию апоптотических генов, и генов подавляющих пролиферацию.

60

50

Л

1-

о о 40

X

1-

X 30

0)

2

Е; 20

X

£ 10

0

80

70

П

н о 60

о

£ 50

I

ш 40

у

с 30

£ П 20

10

0

70

60

50

О

о

X 40

1-

X

о 30

У

с 20

X

о ^ 10

0

80

70

.0 60

!»

о X 50

н

X 01 40

30

20

о

10

Контроль МЫЫО

т Контроль ТИ

д Плазма ТИ

2 3 4

Сутки после облучения а

Контроль ММЭ

т Контроль ТИ

Плазма ТИ

2 3 4

Сутки после облучения б

Контроль ММ№ Плазма ММ№ Контроль ТИ Плазма ТН

2 3 4

Сутки после облучения в

Контроль МЫЫв Плазма МЫЫв Контроль ТН Плазма ТИ

1 2 3 4 5

Сутки после облучения

г

Рис. 1. Динамика увеличения площади культуры (конфлюентности) МСК (П) и трансформированных клеток (MNNG/HOS) человека в контроле и после облучения НТАП при разной длительности экспозиции (а - 5 мин, б - 10 мин, в - 15 мин, г - 20 мин). ** - р<0,01; * - р<0,001

5

*

0

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИИ - 2016 - Т. 23, № 4 - С. 24-32 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

л

2 24 48 72

+2 2 24

Стволовость

Пролиферация

1 Дифферен-цировка

Некроз, апоптоз

Дифферен-цировка

Чекпойнты, арест кле

ЮЧН01 и

цикла

Некроз,

апопто!

¡Остальные исследуемые 1гены

о

Рис. 2. Кластерный анализ изменения экспрессии генов в МСК Тк (а) и трансформированных клетках MNNG/HOS через 2 часа, сутки, двое и трое суток после 15 мин облучения НТАП (отклонения показаны в логарифмической шкале с основанием 2). На цветных диаграммах: черный цвет -уровень экспрессии сравним с контролем, градации цвета

от черного до синего отражают степень ингибирования экспрессии генов, градации от черного до красного цвета -уровень стимуляции относительно необлученного контроля

Воздействие КМП, настроенного в режиме параметрического резонанса на ионы К+ и Са2+ на рост и жизнеспособность культивируемых клеток человека. Непрерывное экспонирование культуры стволовых клеток в КМП, настроенном на ионы Ся2+ приводило к изменению конфлю-ентности (рис. 3, а). На 2 сутки площадь поверхности, занимаемой клетками, увеличивалась на 25% (р<0,001) и затем снижалась до контрольного уровня. Продолжение воздействия Ся2+-КМП тормозило приращение занимаемой площади к 4 суткам на 11% (р<0,001) и к 5-м суткам на 8% (р<0,001). Однако жизнеспособность клеток, оцениваемая по МТТ-тесту, не изменялась.

КМП, настроенное на ионы К+, по иному влияло на динамику роста клеточной культуры МСК Тк (рис. 3, б). На 2 сутки площадь, занимаемая клетками, уменьшалась на 9% (р<0,001) и, оставалась на этом же уровне через 3-5 суток культивирования. В контрольных образцах МСК Тк величина площади, занимаемой клетками, постепенно уменьшалась. В результате к 4 и 5 суткам под воздействием К+-КМП превышала контрольные значения площадь разрастания клеток на 14% (р<0,001) и 8% (р<0,001). Жизнеспособность клеточных культур не отличалась от контроля.

38 * 36

¡5 34 о

0

1 32 н

i 30 с

■§■ 28

О

* 26 24

1 2 3 4 5

Продолжительнсть культивирования, сут

2 С

-е-

1 2 3 4 5

Продолжительность культивирования, сут б

Рис. 3. Динамика изменения конфлюентности культуры мезенхимальных стволовых клеток (ТЬ) человека в контроле и при экспонировании в Ся2+-КМП (а) и К+-КМП (б). Параметры КМП: Бос= 38 мкТл, Са2+-КМП - Блс=70 мкТл, /лс = 29 Гц; К+-КМП - Блс=70 мкТл, /лс = 15 Гц. * - р<0,001

Воздействие Са2+-КМП на культивируемые трансформированные клетки человека сопровождалось увеличением скорости роста культуры. Но эффекты проявлялись при более длительном экспонировании (рис. 4. а). К 4 суткам культивирования в са2+-КМП конфлюентность была выше контрольных значений на 8% (р<0,001), и к 5 суткам на 20% (р<0,001). По МТТ тест на 4 сутки экспонирования в са2+-КМП показало, что в опытных группах клеток интенсивность развития окраски была на 15% выше контрольного уровня (р<0,001) (рис. 4, б). Воздействие К+-КМП на клетки MNNG/HOS не влияло ни на динамику роста, ни на развитие окрашивания МТТ.

Таким образом, воздействие комбинированных магнитных полей, настроенных на параметрический резонанс ионов кальция или калия, мало влияло на рост клеточных культур и жизнеспособность клеток, несмотря на значительные сдвиги в транскрипционной активности под влиянием этих полей, как это будет показано далее.

а

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

X 50 § 40

q

30

X

о

* 20

10

1 2 3 4 5

Продолжительность культивирования, сут а

б

Рис. 4. Динамика увеличения конфлюентности культуры клеток MNNG/HOS человека и показатели жизнеспособности (MTT тест на четвертые сутки) в контроле и при экспонировании в Ca2+-КМП (а и б). ** - р<0,01; * - р<0,001

Изменение экспрессии генов в стволовых и трансформированных клетках человека при экспонировании в КМП, настроенном на ионы кальция или калия. В стволовых клетках Th при экспонировании в комбинированном магнитном поле, настроенном на параметрический резонанс для ионов Ca2+ (Ca^-КМП), транскрипция некоторых генов активировалась волнообразно: в первые сутки с последующим спадом, а затем вновь на четвертые сутки экспонирования. Наблюдалась экспрессия генов модуляторов хроматина и хромосом (KAT2A и RB1), регуляторов симметричности деления (NUMB и PARD6A) (рис. 5). У ряда генов высокий уровень транскрипции сохранялся на протяжении всех 4-х суток (маркеры некроза - FOXI1 и RAB25). У других генов разных групп (DHH, NOTCH1, ALPL, VDR, SOX1, GATA3, PITCH1, POU5F1 и LIN28B) значимая стимуляция экспрессии проявлялась на 2 сутки экспонирования в Ca^-КМП и сохранялась на очень высоком уровне до 4-х суток. Экспрессия большинства генов регулято-

ров клеточного цикла и деления клеток и многих генов таких кластеров, как у KAT2A, RB1, JAG1, NOTCH1 и NOTCH2, большинства маркеров остеогенной дифференцировки, маркеров ассиметричного деления и плюрипотентности в течение 1-3 суток культивирования была ниже контрольного уровня, но повышалась на 4 сутки. При этом на 4-е стуки возрастала экспрессия антиапоптотических (BCL2 и BIRC3) и про-апоптотических генов (CD40, FAS и TNFRSF1).

При экспонировании культивируемых трансформированных клеткок MNNG/HOS в Са2+-КМП наблюдалась иная динамика экспрессии генов (рис. 5): возрастала транскрипционная активность генов в кластере Notch сиг-налинга (NOTCH1 и NOTCH2); маркеров остеогенной дифференцировки (BGLAP, COL1A1, FGFR1, RUNX2, SMAD2, SMAD4, SMAD5 и SPP1); Wnt сигналинга (AXIN и MSX1); регуляторов клеточного цикла, деления и репликации ДНК (CCND1, CDK4, CDC6, WEE1, CCNA2, AURKB, CCNB2, CUL1, SKP2, CCNB1, CDK7 и CDKN1B); проапототического гена BAX. В остальных кластерах экспрессия генов была значительно более гетерогенной: на 2 и 3 сутки культивирования повышалось количество мРНК у проапоптотических генов (CFLAR и FAS), на 2, 3 и 4 сутки - у антиапоптотических генов (BCL2, BIRC3, MCL1 и TRAF2). На 1, 2 и 4 сутки экспозиции в магнитном поле была обнаружена повышенная экспрессия гена маркера аутофагии - NFKB1. Мозаично активировались маркеры миграции и метастазирования (IL8, SNAI1, TWIST1 и ZEB1), а также некоторые маркеры раковых стволовых клеток (ALDH1A1, CD24, CD44, GATA3 и ITGB1) и некроза (CCDC103 и JPH3).

Основным отличие экспрессии генов в трансформированных клетках от стволовых под влиянием «кальциевого» КМП была большая выраженность транскрипции генов пролиферации и остеогенной дифференцировки.

При экспонировании культуры мезенхи-мальных стволовых клеток Th в комбинированном переменном магнитном поле, настроенном на параметрический резонанс на ионы K+ (К+-КМП), в первые сутки культивирования экспрессия большинства генов не отличалась от контроля (рис. 5). Значительно снижался только уровень транскрипции для большинства генов модуляторов хроматина и хромосом, сим-

80

70

60

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2016 - Т. 23, № 4 - С. 24-32 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

метричности деления и Notch сигналинга. Трехсуточное воздействие K+-KMn приводило к стимуляции экспрессии большинства маркеров остеогенной дифференцировки, Wnt сигналинга и маркеров ассиметричного деления. Одновременно активировалась транскрипция некоторых генов маркеров миграции и метастази-рования (IL8 и TWIST1), плюрипотентности (NANOG и SOX2), проапоптоза (BAX, CFLAR и TNFRSF1) и регуляторов клеточного цикла (CDK4, CDC6, CCNB2, CUL1, CDKN1B и CDKN2B). К 4-м суткам транскрипционная активность большинства генов не отличалась от контрольного уровня. Из 94 исследуемых генов высокий уровень экспрессии сохранялся лишь 16: в кластере маркеров остеогенной дифференцировки (BGLAP, EGFR, FGF-2, IGF1 и SPP1) и у единичных генов других групп (DHH, PARD6A, NOTCH2, AXIN, WEE1, CUL1, CDKN2B, MCM2, IL8, CD40, TNFRSF1).

PARD6A, NOTCH1, IGFR1, TGFBR1, VDR и CCNA2. На 3-4 сутки прослеживалась тенденция к дальнейшему уменьшению транскрипционной активности исследуемых генов, но оставался повышенным уровень экспрессии у генов PARD6A, ALPL, TNF, APC, CCNA2, CCNB1, MCM2, NOS2, BMP7.

Таким образом, нами установлена динамика экспрессии генов в культивируемых стволовых и трансформированных клетках в ответ на воздействие комбинированного магнитного поля, настроенного в соответствии с теорией В.В. Леднева на параметрический резонанс для ионов кальция или калия. При этом стволовые и трансформированные клетки характеризуются разной ответной реакцией экспрессии генов при воздействии одинаковых типов комбинированных магнитных полей.

2 2 4 48 96

Стволовость

Пролиферация

Диффереи-цпровка

Некроз, апоптоз

-2 0

2 24 48 72

Стволовость

Пролифера-

ция

Дпффереи-

цпровка

Некроз,

апоптоз

+2 24

48 72

ИСтволовость

Пролиферация

Диффереп-Нцпровка

Некроз, Иапоптоз

2 24 48 72

III Стволовость

ÉH Пролифера-

ция

H Дпфферен-

ппровка

IUI 1 Некроз,

ü 1 апоптоз

Са2+-КМП

К -КМП

Рис. 5. Воздействие комбинированного магнитного поля, настроенного на параметрический резонанс для ионов Са2+ (Ся2+-КМП) и ионов К+ (К+-КМП) на экспрессию генов (кластерный анализ) в культивируемых стволовые Тк (а) и трансформированных (ЫМЫС/ИОБ) (б) клетках человека. Отклонения показаны в логарифмической шкале с основанием 2. На цветных диаграммах: черный цвет - уровень экспрессии сравним с контролем, градации цвета от черного до синего отражают степень ингибирования экспрессии генов, градации от черного до красного цвета

- уровень стимуляции относительно необлученного контроля

Воздействие К+-КМП на трансформированные клетки не вызывало значительных изменений уровня экспрессии большинства генов в течение всего периода наблюдений (рис. 5). В 1-е сутки уровень экспрессии возрастал у единичных генов TERT, NOTCH1, SOX1, CCNA2, CDKN2B, AXL, MYC, NANOG, SOX2, LIN28B, BMP7, ATG3, RAB25 и некоторых генов маркеров остеогенной дифференцировки (BMP1, TGFBR1 и VDR). Ко 2-суткам и далее высокая концентрация мРНК сохранялась лишь у генов

Представленные данные свидетельствуют о том, что молекулярно генетический аппарат клетки существенно более чувствителен к воздействию КМП, чем такие интегральные характеристики, как скорость роста, регистрируемая по параметру конфлюентности, и жизнеспособность культивируемых клеток.

Данные, полученные в экспериментах по влиянию облучения НТАП и экспозиции в КМП, настроенном в режиме параметрического резонанса, на стволовые и трансформированные клет-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

ки, культивируемые без контакта с окружающими дифференцированными клетками, в отсутствии паракринной, и нейрогуморальной регуляции процессов пролиферации, дифференциров-ки и роста, не позволяют судить о механизмах действия использованных слабых физических воздействий направленности их влияния на регенераторные процессы в поврежденных тканей. Для адекватной оценки воздействия этих факторов на процессы регенерации и заживления требуется анализ изменений интегральной активности процессов регенерации и экспрессии генов в стволовых и дифференцированных клетках в условиях in vivo.

Выводы. При воздействии низкотемпературной аргоновой плазмы на культивируемые стволовые клетки человека зарегистрирована активация экспрессии генов пролиферации, ство-ловости и дифференцировки, а также умеренное ингибирование транскрипции генов апоптоза и

некроза, реализующиеся в ускорении роста клеток. Слабое комбинированное магнитное поле, настроенное на ионы кальция, не влияет на рост стволовых клеток, хотя вызывает подобные сдвиги в уровне экспрессии генов.

В отличие от культивируемых стволовых клеток, в быстрорастущих трансформированных клетках человека линий MNNG/HOS после кратковременного облучения низкотемпературной аргоновой плазмой или при экспозиции в слабом комбинированном магнитном поле регистрируется преимущественная активация экспрессии генов дифференцировки, некроза и апоптоза без изменения скорости роста клеток. После более длительного 15-минутного облучения низкотемпературной аргоновой плазмой может происходить торможение роста трансформированных клеток человека.

Литература

1. Белова Н.А., Ермаков А.М., Знобищева А.В., Среб-ницкая Л.К., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на регенерацию пла-нарий и гравитационную реакцию растений // Биофизика. 2010. Т. 55, №4. С. 704-709.

2. Ермаков А.М., Скавуляк А.Н., Ермакова О.Н. Исследование влияния слабых комбинированных магнитных полей на регенерацию, пролиферацию необ-ластов и экспрессию рана-индуцируемых генов у планарий // Биомедицинский журнал. 2015. Т. 16. С.1171-1183.

3. Леднев В.В. Биоэффекты слабых комбинированных, постоянных и переменных магнитных полей // Биофизика. 1996. Т. 41. №1. С. 224-232.

4. Ermakov A., Ermakova O., Skavulyak A., Kreshchen-ko N., Gudkov S., Maevsky E. The effects of the low temperature argon plasma on stem cells proliferation and regeneration in planarians // Plasma Processes and Polymers. 2016. Vol. 13, №8. P. 788-801.

5. Ermolaeva S.A., Varfolomeev A.F., Chernukha M.Y., Yurov D.S., Vasiliev M.M., Kaminskaya A.A., Moisenovich M.M., Romanova J.M., Murashev A.N., Selezneva I.I., Shimizu T., Sysolyatina E.V., Shaginyan I.A., Petrov O.F., Mayevsky E.I., Fortov V.E., Morfill G.E., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Bactericidal effects of non-thermal argon plasma in vitro, in biofilms and in the animal model of infected wounds // Journal

References

Belova NA, Ermakov AM, Znobischeva AV, Srebnits-kaya LK, Lednev VV. Vliyanie krayne slabykh pere-mennykh magnitnykh poley na regeneratsiyu planariy i gravitatsionnuyu reaktsiyu rasteniy [The impact of extremely weak alternating magnetic fields in the pla-narian regeneration and gravitational response of plants]. Biophysics. 2010;55(4):704-9. Russian. Ermakov AM, Skavulyak AN, Ermakova ON. [Issledo-vanie vliyaniya slabykh kombinirovannykh magnit-nykh poley na regeneratsiyu, proliferatsiyu neoblastov i ekspressiyu rana-indutsiruemykh genov u planariy] Investigation of the effect of weak magnetic fields on the combined regeneration neoblasts proliferation and expression of wound-inducible genes in planarians. Biomedical journal medline.ru. 2015;16:1171-83. Russian.

Lednev VV. Bioeffekty slabykh kombinirovannykh, postoyannykh i peremennykh magnitnykh poley [Pour on the bioeffects of the weak combined, constant and variable magnetic]. Biofizika. 1996;41(1):224-32. Russian. Ermakov A, Ermakova O, Skavulyak A, Kreshchen-ko N, Gudkov S, Maevsky E. The effects of the low temperature argon plasma on stem cells proliferation and regeneration in planarians. Plasma Processes and Polymers. 2016;13(8):788-801.

Ermolaeva SA, Varfolomeev AF, Chernukha MY, Yurov DS, Vasiliev MM, Kaminskaya AA, Moisenovich MM, Romanova JM, Murashev AN, Selezneva II, Shimizu T, Sysolyatina EV, Shaginyan IA, Petrov OF, Mayevsky EI, Fortov VE, Morfill GE, Naroditsky BS, Gintsburg AL. Bactericidal effects of non-thermal argon plasma in vitro, in biofilms and in the animal model of infected wounds. Journal of medical microbiology.

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 24-32

of medical microbiology. 2011. Vol. 60, №Pt1. P. 75-83.

6. Heinlin J., Morfill G., Landthaler M., Stolz W., Isbary G., Zimmermann J.L., Shimizu T., Karrer S. Plasma medicine: possible applications in dermatology // Journal of the German Society of Dermatology. 2010. Vol. 8, №12. P. 968-976.

7. Kalghatgi S., Kelly C.M., Cerchar E., Torabi B., Alekseev O., Fridman A., Friedman G., Azizkhan-Clifford J. Effects of non-thermal plasma on mammalian cells // PLoS One. 2011. Vol. 6, №1. P. e16270.

8. Kanat E., Alp A., Yurtkuran M. Magnetotherapy in hand osteoarthritis: a pilot trial // Complementary therapies in medicine. 2013. Vol. 21, №6. P. 603-608.

9. Markov M. XXIst century magnetotherapy // Electromagnetic biology and medicine. 2015. Vol. 34, №3. P. 190-196.

10. Sturn A., Quackenbush J., Trajanoski Z. Genesis: cluster analysis of microarray data // Bioinformatics. 2002. Vol. 18, №1. P. 207-208.

11. Wu A.S., Kalghatgi S., Dobrynin D., Sensenig R., Cerchar E., Podolsky E., Dulaimi E., Paff M., Wasko K., Arjunan K.P., Garcia K., Fridman G., Balasubramanian M., Ownbey R., Barbee K.A., Fridman A., Friedman G., Joshi S.G., Brooks A.D. Porcine intact and wounded skin responses to atmospheric nonthermal plasma // J Surg Res. 2013. Vol. 179, №1. P. e1-e12.

2011;60(Pt 1):75-83.

Heinlin J, Morfill G, Landthaler M, Stolz W, Isbary G, Zimmermann JL, Shimizu T, Karrer S. Plasma medicine: possible applications in dermatology. Journal of the German Society of Dermatology. 2010;8(12):968-76.

Kalghatgi S, Kelly CM, Cerchar E, Torabi B, Alekseev O, Fridman A, Friedman G, Azizkhan-Clifford J. Effects of non-thermal plasma on mammalian cells. PLoS One. 2011;6(1):e16270.

Kanat E, Alp A, Yurtkuran M. Magnetotherapy in hand osteoarthritis: a pilot trial. Complementary therapies in medicine. 2013;21(6):603-8.

Markov M. XXIst century magnetotherapy. Electromagnetic biology and medicine. 2015;34(3):190-96.

Sturn A, Quackenbush J, Trajanoski Z. Genesis: cluster analysis of microarray data. Bioinformatics. 2002;18(1):207-8.

Wu AS, Kalghatgi S, Dobrynin D, Sensenig R, Cerchar E, Podolsky E, Dulaimi E, Paff M, Wasko K, Arjunan KP, Garcia K, Fridman G, Balasubramanian M, Ownbey R, Barbee KA, Fridman A, Friedman G, Joshi SG, Brooks AD. Porcine intact and wounded skin responses to atmospheric nonthermal plasma. J Surg Res. 2013;179(1):e1-e12.