CC BY
50
Химия растительного сырья. 2003. №4. С. 51-56
УДК 615.322
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СИБИРСКИХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА CALATHIANA ADANSON
© Л.А. Тихонова, В.Ю. Андреева , Т.П. Березовская, Г.И. Калинкина
Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2, Томск, 634050 (Россия) E-mail: vallary@ssmu.net.ru
Проведено сравнительное химическое и анатомическое исследование надземной части двух видов рода Calathiana - C. uniflora (Georgi) Zuev. и C. angulosa М.В. Установлено, что оба вида содержат флавоноиды, среди которых были идентифицированы: гомоориентин, сапонаретин, 4'-О-глюкозид гомоориентина. Ксантоновый флавоноид мангиферин присутствует только в C. а^и1о8а. Данные анатомического исследования подтверждают видовые различия исследуемых видов.
Введение
Одним из малоизученных таксонов флоры Сибири и Дальнего Востока являются горечавки (Gentiana s.l.). Горечавки как лекарственные растения пользуются большой популярностью у народов Сибири и Дальнего Востока, являются частыми компонентами рецептов тибетской медицины. Данные литературы свидетельствуют о наличии в горечавках флавоноидов, ксантонов, иридоидов, определяющих желчегонный эффект, противовоспалительную, диуретическую, фунгицидную и антивирусную активность, положительное действие на гомеостаз [1-5]. Однако недостаточная изученность химического состава горечавок затрудняет их рекомендацию для использования в медицинской практике.
Нами были проведены сравнительные исследования сибирских представителей горечавок секции Aptera (Gentiana macrophylla, G. decumbens, G. dahurica, G. Kaufmaniana), из которых впервые выделены и идентифицированы флавоноиды: гомоориентин, сапонаретин, 4'-О-глюкозид гомоориентина, 4'-О-глюкозид сапонаретина. Ксантоновый С-гликозид - мангиферин был обнаружен только в G. dahurica [6-8].
В эксперименте установлено, что водно-спиртовые экстракты из надземной части горечавки крупнолистной проявляют выраженное противовоспалительное, ранозаживляющее действие, оказывают положительное влияние на реологические свойства крови и характеризуются низкой токсичностью [9, 10].
Продолжая исследование растений данного рода, мы обратили внимание на два других вида -Calathiana uniflora (Georgi) Zuev. (горечавка одноцветковая) и C. angulosa М.В. (горечавка угловатая). Оба вида во Флоре СССР (Черепанов, 1981) относятся к настоящим горечавкам секции Cyclostigma и трактуются в качестве самостоятельных видов (Гроссгейм, 1952). Во Флоре Западной Сибири (Крылов, 1937) описан только один вид - C. angulosa М.В. По новой классификации горечавковых, предложенной В.В. Зуевым [11], из настоящих горечавок выделяется новый род Calathiana Adanson, в который В.В. Зуев из горечавок флоры Сибири включает один сборный вид Calathiana uniflora.
Исследование данных видов представляет интерес прежде всего с точки зрения их нового систематического положения, предполагающего различия в химическом составе с видами рода Gentiana.
Кроме того, виды рода Calathiana привлекают внимание как возможные источники оригинальных биологически активных веществ, в частности флавоноидов, представляющих большой интерес для медицинской практики.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Целью настоящего исследования явилось сравнительное хромато-спектроскопическое изучение флавоноидов Calathiana uniflora (Georgi) Zuev. и C. angulosa М.В., а также их микроскопический анализ.
Материалы и методы
Материалом для исследования служила надземная часть Calathiana uniflora (Georgi) Zuev., собранная в Усть-Канском районе, на вершине Ябоганского перевала, и C. angulosa М.В., произростающая в Улаганском районе Республики Алтай, в верховье реки Богояш, в период цветения растений в i995 г.
Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, упаковывали в тканевые мешки и хранили в сухом прохладном месте. Для химического анализа среднюю пробу сырья измельчали до размера частиц 2-3 мм.
Для исследования качественного состава фенольных соединений из надземной части получали водноспиртовое извлечение путем исчерпывающей экстракции S0% метанолом на кипящей водяной бане с обратным холодильником [i2].
Для обнаружения флавоноидов использовали следующие реакции: цианидиновую пробу, реакцию с 5% раствором алюминия хлорида, реакцию с борно-лимонным реактивом [i2, i3].
Исследование флавоноидов проводили методами двумерной и одномерной хроматографии на бумаге марки «Filtrak» FN-3, FN-i5 в системах растворителей: i5% кислота уксусная; н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : i : 2).
Выделение флавоноидов проводили методом колоночной хроматографии, для чего из водно-спиртового извлечения отгоняли спирт, а водный остаток последовательно обрабатывали хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. Сумму флавоноидов этилацетатной и бутанольной фракций наносили на колонку полиамида и элюировали последовательно хлороформом и смесью хлороформа с метанолом (с увеличением градиента метанола). Индивидуальность выделенных соединений подтверждали хроматографически.
Гидролиз гликозидов проводили б% кислотой хлороводородной, для чего О-гликозиды обрабатывали кислотой и прогревали при температуре i05 °С; С-гликозиды гидролизовали до агликонов йодоводородной кислотой в среде жидкого фенола и уксусного ангидрида [S]. Полученные агликоны хроматографировали в i5% уксусной кислоте.
Идентификацию выделенных флавоноидов проводили по их спектральной характеристике и хроматографическому поведению в сравнении с достоверными образцами, выделенными нами из надземной части Gentiana macrophylla. На хроматограммах гликозиды и агликоны обнаруживали по характеру свечения веществ в УФ-свете при длине волны 3б5 нм до и после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида [i4, i5].
Микроскопический анализ проводили на свежем и фиксированном материале. Исследованию подвергали листья, черешки листьев и стебли растений. Стебли и листья (гербарные экземпляры и воздушно-сухое сырье) фиксировали в смеси спирт - глицерин - вода (i : i : i). Поперечные срезы стеблей, черешков по всей длине производили от руки. Форму эпидермальных клеток исследовали по всей поверхности листовых пластинок на парадермальных препаратах. Рисунки выполнены с помощью рисовального аппарата РА-i ^б].
Результаты и обсуждение
Качественными реакциями в водно-спиртовых экстрактах из надземной части C. uniflora и C. angulosa подтвердили наличие флавоноидов.
Методом двумерной хроматографии в системах: i5% кислота уксусная (I) и БУВ (4 : i : 2) (II) в надземной части C. uniflora (Georgi) Zuev. обнаружили не менее i0 веществ, S из которых по хроматографическому поведению в УФ-свете можно отнести к флавоноидным гликозидам и агликонам. В надземной части C. angulosa М.В. обнаружено тоже не менее i0 веществ, однако флавоноидами предположительно являются лишь 7. Среди них одно соединение В-3 при проявлении в УФ-свете имеет характерную для ксантоновых соединений окраску: до обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида пятно на хроматограмме имеет оранжевое свечение, после проявления - яркое зеленоватоголубое. По хроматографическому поведению при сравнении с известным образцом данное вещество можно идентифицировать с мангиферином (табл. i).
При разделении этилацетатной фракции на колонке с полиамидом выделили 2 индивидуальных соединения В-1 и В-4. Оба вещества устойчивы к кислотному гидролизу и относятся к С-гликозидам, что доказано нами путем их расщепления до агликона и углеводного остатка йодоводородной кислотой в среде жидкого фенола и уксусного ангидрида. Вещество В-4 в УФ спектре имеет 2 максимума поглощения: 271, 333 нм; под воздействием йодоводородной кислоты расщепляется на апигенин и D-глюкозу. На основании полученных данных, а также хроматографически (табл. 1) В-4 идентифицировали с сапонаретином [8].
Вещество В-1 в УФ области дает максимумы поглощения: 257 пл., 272, 350 нм. Йодоводородной кислотой расщепляется до лютеолина и D-глюкозы. Полученные данные и результаты хроматографирования с достоверным образцом (табл. 1) позволяют заключить, что В-1 представляет собой гомоориентин [8].
из бутанольной фракции на колонке с полиамидом выделили вещество В-8, которое гидролизуется в 6% хлороводородной кислоте до гомоориентина и D-глюкозы. Природа вещества В-8 установлена хроматографически до и после гидролиза в сравнении с известным образцом (табл. 1); В-8 идентифицировано как 4'-О-глюкозид гомоориентина.
Таким образом, установлено, что в экстрактах из надземной части C. angulosa и C. uniflora присутствуют: гомоориентин, сапонаретин, 4'-О-глюкозид гомоориентина; кроме того, в C. angulosa содержится мангиферин. Полученные данные позволяют предположить видовую самостоятельность исследуемых нами видов. Для подтверждения данного факта нами проведен микроскопический анализ этих растений.
Установлено, что у исследуемых видов имеется ряд общих анатомических признаков в строении вегетативных органов. Они имеют ребристый стебель непучкового типа со слабо дифференцированной ксилемой, гипостоматный тип листа с гомогенной структурой мезофилла. Для них характерно наличие папилл на поверхности листа, капель жира в клетках мезофилла и эпидермы листа (рис. 1, 2). Наряду с этим четко выражены различия (табл. 2) - у Calathiana uniflora внутренняя флоэма стебля представлена изолированными участками, а у С. angulosa - сплошным цилиндром. Клетки эпидермы листа у С. uniflora крупные, тонкостенные, со слабо выраженной складчатостью. У C. angulosa клетки эпидермы листа толстостенные, с крупными папиллами и складчатой кутикулой. Устьичный аппарат неоднородный, преобладает парацитный тип.
Таблица 1. Сравнительная хроматографическая характеристика спиртовых извлечений из надземной
части сибирских представителей рода Calathiana Adansonis
Виды Calathiana angulosa Calathiana uniflora
Код вещества Величина R f в системах
I II I II
В-1 (гомоориентин) 0,32 0,94 0,34 0,92
В-2 0,38 0,50 0,38 0,50
В-3 (мангиферин) 0,43 0,48 - -
В-4 (сапонаретин) 0,53 0,61 0,54 0,61
В-5 - - 0,50 0,32
В-6 0,73 0,34 0,73 0,36
В-7 0,71 0,49 0,71 0,50
В-8 (4'-О-глюкозид гомоориентина) 0,66 0,38 0,66 0,39
В-9 - - 0,33 0,70
Примечание. I - 15% кислота уксусная. II - БУВ (4 : 1 : 2)
Таблица 2. Анатомо-морфологическая характеристика стебля и листа сибирских представителей рода
Calathiana Adanson
Признаки Виды
Calathiana uniflora Calathiana аngulosa
Форма поперечного среза Беспорядочно расположено 6-7 ребер Симметричные 4 ребра
Стебель Тип ткани под эпидермой 3 слоя уголковой колленхимы 1 слой гиподермы
Ксилема Мощно развита Слабо развита
Наружная флоэма Прерывистое кольцо Сплошной цилиндр
Интеркалярная флоэма Отдельные тяжи Сплошной цилиндр
Тип строения Гипостоматный Гипостоматный
Характер мезофилла Аэренхима Аэренхима
Тип пучка в центральной жилке Центроксилемный Центроксилемный
Тип устьичного аппарата Аномоцитный Анизоцитный
Лист Верхняя сторона листа Извилистостенные Прямостенные
эпидермы Нижняя сторона листа Извилистостенные Извилистостенные, клеточные оболочки толстые
Образование па эпидерме Папиллы Папиллы, складчатость
Включения Кристаллы Капли жира Есть Есть Есть
Рис. 1. Фрагменты микроскопической структуры стебля и листа Calathiana аngulosa
Условные обозначения: I - схема поперечного среза стебля;
II - схема поперечного среза центральной жилки листа;
III - эпидерма нижней стороны листа; IV - эпидерма верхней стороны листа, эп - эпидерма; фл - флоэма; вн. фл -внутренняя (интерксилярная) флоэма; к - камбий; кс -ксилема; с.кс. - сосуды ксилемы; у - устьице; скл. - склеренхима; кр - кристалы; пл - папиллы; АК.П - амфикрибральный пучок; БК.П - биколатеральный пучок
20мкм
Рис. 2. Фрагменты микроскопической структуры стебля и листа Calathiana uniflora.
Условные обозначения те же, что и на рисунке 1
Выводы
1. Сравнительное хроматографическое исследование показало, что в надземной части Calathiana uniflora (Georgi) Zuev. содержится не менее 8 веществ флавоноидной природы, в C. angulosa М.В. - не менее 7 флавоноидов.
2. Хроматоспектроскопически в сравнении с известными веществами флавоноиды идентифицированы как гомоориентин, сапонаретин, 4'-О-глюкозид гомоориентина.
3. Ксантоновый флавоноид мангиферин присутствует только в C. angulosa, что позволяет рассматривать ее как самостоятельный вид.
4. Данные анатомического исследования показывают наличие как общих признаков, так и существенных отличий в строении вегетативных органов Calathiana uniflora (Georgi) Zuev. и C. angulosa М.В.
Список литературы
1. Галинская В.Д. Содержание флавоноидов в некоторых сибирских видах горечавковых // Растительные ресурсы Сибири и их использование. Новосибирск, 1978. С. 50-56.
2. Карпович В.Н. Фитохимическое исследование забайкальских видов горечавковых // Вопросы фармакогнозии. Л., 1961. С. 201-208.
3. Бутаяров А.И., Батиров Э.Х., Таджибаев М.М., Маликов В.М. Ксантоны и флавоноиды Gentiana algida и Gentiana karelinii // Химия природных соединений. 1992. №3. С. 280-282.
4. Goetz M., Hostettmann K. C-Glucosides flavoniques et xanthoniques de Gentiana cruciata L. // Phytochemestry. 1976. V. 15. №12. Р. 2015.
5. Hostettmann-Kaldas M., Hostettmann K., Sticher O. Xanthones, flavones and secoiridoids of american Gentiana species // Phytochem. 1981. V. 20. P. 443-446.
6. Тихонова Л.А., Березовская Т.П. Флавоноиды из горечавки лежачей // Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке. Томск, 1991. Ч. 1. С. 190.
7. Тихонова Л.А., Серых Е.А., Березовская Т.П., Ханина М.А. Фенольные соединения горечавок секции Aptera // Ресурсоведческое и фитохимическое изучение лекарственной флоры СССР: Научные труды ВНИИФ. М., 1991. С. В4-В9.
В. Тихонова Л.А., Комисаренко Н.Ф., Березовская Т.П. Флавоновые С-гликозиды из Gentiana macrophylla // Химия природных соединений. 19В9. №2. С. 2В7-2ВВ.
9. Плотников М.Б., Колтунов А.А., Алиев О.И., Калинкина Г.И. и др. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих флавоноиды // Растительные ресурсы. 199В. Т. 34. Вып. 1. С. В7-90.
10. Тихонова Л.А., Буторин И.Ю., Березовская Т.П. Влияние экстракта горечавки крупнолистной па пролиферацию опухолевых клеток in vitro // Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений. Новосибирск, 199В. С. 159-1б0.
11. Зуев В.В. Горечавковые Сибири (эволюция, филогения). Новосибирск, 1991. 111 с.
12. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 19В3. 17б с.
13. Государственная фармакопея СССР. 9-е изд. М., 1990. Вып. 2. 39В с.
14. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.Л. Тонкослойная хроматография флавоноидов // Химия природных соединений. 19В3. №1. С. 20.
15. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Раститительные ресурсы. 19б5. Т. 1. Вып. 4. С. 591-597.
16. Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М., 1979. 155 с.
Поступило в редaкцию 29 октября 2003 г.
