CC BY
12
Сравнительное исследование образования двунитевых разрывов ДНК в клетках линии РС3 (рака предстательной железы человека) при воздействии гамма излучения сверхвысокой и терапевтической мощности дозы
1 1 2 2 2 3
Шишкин А.М. , Кулинич Т.М. , Крастелев Е.Г. , Быков Ю.А. , Смирнов В. П. , , Иванов А.В.1, Васильев ВН.1, БоженкоВ.К. 1
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России), 117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86
2 и
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Объединенный институт высоких температур Российской академии наук» (ОИВТ РАН), 125412 Москва, ул. Ижорская, д.13, стр. 2
3 u w
Акционерное общество «Научно-исследовательский институт технической физики и автоматизации» Госкорпорации «Росатом», 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 46 Сведения об авторах
Шишкин Александр Михайлович - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Кулинич Татьяна Михайловна - к.м.н., заведующая лабораторией иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Крастелев Евгений Григорьевич - к. физ.-мат.н., главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Объединенный институт высоких температур Российской академии наук»
Быков Юрий Анатольевич - стажер-исследователь Федерального государственного бюджетного учреждения «Объединенный институт высоких температур Российской академии наук»
Смирнов Валентин Пантелеймонович - д. физ.-мат. наук, профессор, действительный член Российской академии наук, главный научный сотрудник Отделения физики
токонесущей плазмы (ОФТП) Научно исследовательского института технической физики и автоматизации ГК Росатом
Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Васильев Владимир Николаевич - старший научный сотрудник лаборатории лучевой терапии ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, зав. отделом молекулярной биологии и
экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Контактная информация: Владимир Константинович Боженко
ул. Профсоюзная, д. 86, г. Москва, 117997
vbojenko@mail.ru
Резюме
Проведено исследование сравнения воздействия терапевтического гамма-излучения и рентгеновского излучения со сверхвысокой мощностью дозы экспериментальной установки «МИР-М» на клетки линии рака предстательной железы человека PC3. Произведена оценка уровня радиоиндуцированных двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. Показано, что излучение со сверхвысокой мощностью дозы, при равноэквивалентных дозах облучения, вызывает большее количество ДНР, и различия возрастают при увеличении дозы облучения.
Ключевые слова: гамма-излучение, сверхвысокая мощность дозы, двунитевые разрывы ДНК, рак предстательной железы PC3
A comparative study of the formation of DNA double-strand breaks in the cells of the PC3 line (human prostate cancer) under exposure to gamma radiation with ultra-high and therapeutic dose rate
1Shishkin A.M., 1Kulinich T.M., 2Krastelev E.G., 2Bykov Y.A., 2,3Smirnov V.P., 1Ivanov A.V., 1Vassiliev V.N., 1Bojenko V.K.
1Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, 117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86 Joint Institute for High Temperatures, 125412, Moscow, Izhorskaya st. 13 Bd. 2
"3
Research Institute of Technical Physics and Automation, 115230, Moscow, Varshavskoe shosse, 46 Summary
We conducted a comparative study of the effects of therapeutic gamma radiation and x-ray radiation with an ultra-high dose rate of the experimental setup "MIR-M" in human prostate cancer cells line PC3. The assessment of the level of double-strand breaks (DSBs) of DNA was performed. In comparison with therapeutic radiation, ultra-high dose rate radiation, at equal equivalent doses of radiation, caused remarkably more DSBs and the differences by the number of DSDs increased with increasing radiation dose.
Keywords: gamma radiation, ultra-high dose rate, DNA double-strand breaks, prostate cancer, PC3 Введение
В настоящее время показано, что, наряду с такими параметрами как доза, фракционирование, большое влияние на биологическую эффективность фотонного излучения (более традиционный термин - гамма излучение) оказывает такой параметр, как мощность дозы излучения, т.е. плотность излучения во времени, или, другими словами, доставляемая энергия в единицу времени. Эффект мощности дозы хорошо изучен в диапазонах от низких (0,01 Гр/мин) [12] до средних мощностей доз (10-100 Гр/мин) [3, 10]. Общей закономерностью является увеличение ОБЭ при увеличении мощности дозы. Однако эффекты не всегда пропорциональны мощности дозы и могут
иметь участки с отрицательным наклоном, т.е. может наблюдаться снижение биологических эффектов при увеличении мощности дозы. Кроме того, практически открытым остается вопрос биологических эффектов сверхвысоких мощностей доз (ultrahigh dose rate) - диапазон мощностей выше 10 Гр/мин. Это связано, прежде всего, с отсутствием экспериментальных установок, обладающих необходимыми характеристиками. Имеющиеся публикации приводят противоречивые результаты, в то время как теоретические расчеты позволяют предположить, что при переходе на сверхвысокие мощности дозы могут иметь место принципиальные отличия радиоиндуцируемых молекулярных процессов. Из расчета, что средняя энергия фотона медицинского ускорителя с мощностью до 1 кВт составляет порядка 1 МэВ, в клетке с диаметром ~10 мкм усредненно поглощается 10 фотонов в секунду. Таким образом, акты первичного взаимодействия фотонов с внутренней средой клетки отделены промежутком времени 1 - 10 мс, а за счет появления деградационного спектра вторичных электронов это время сокращается в несколько десятков раз. Увеличение мощности дозы до величин 108 Гр/мин и более приводит к увеличению, соответственно, плотности свободных электронов и числа возникающих радикалов в клетке в миллионы раз, что может привести к качественным изменениям реакции клетки на облучение. Возможно также развитие нелинейных эффектов в клетке с множественными, одновременно образующимися повреждениями ДНК. Ранее мы показали, что облучение клеток человека фотонным излучением сверхвысокой мощности дозы приводит к качественным изменениям показателей их гибели (изменение соотношения гибели клеток по пути апоптоза или некроза) [2]. В настоящей работе мы исследовали частоту двойных разрывов в клетках рака предстательной железы человека. Этот показатель отражает не только физические и физико-химические молекулярные процессы, индуцируемые ионизирующим излучением, но и состояние репарационных систем в клетке, что может быть принципиальным при выборе оптимальных режимов облучения в программах лучевой терапии в онкологии.
Цель работы:
Исследование эффекта мощности дозы на образование ДНР ДНК в клетках линии рака предстательной железы человека РС3. Материалы и методы
Облучение клеток на экспериментальной установке «МИР-М»
Установка «МИР-М» представляет собой сильноточный наносекундный ускоритель электронов с выходной энергией до 800 кВ и длительностью импульса 40-60 нсек на полувысоте. Мишенью анодного узла является танталовая фольга толщиной 50 -100 мкм. Для поглощения прошедших через фольгу электронов используется дополнительный фильтр из углеродного композита толщиной 1 мм. Мощность дозы установки «МИР-М» составляет 109 - 1010 Гр/сек.
В работе для дозиметрии использовались термолюминисцентные дозиметры (ТЛД) ДТГ-4 (НПП «Доза», Россия). Оценка поглощенной дозы проводилась с помощью измерения облученных дозиметров на комплексе «ДОЗА-ТЛД» (НПП «Доза», Россия). Для более точной дозиметрии использовались дозиметрические пленки Gafchromic EBT2 (Ashland, США) с погрешностью оценки дозы не более 1%. Образцы клеток облучали в культуральных флаконах по методикам, описанным в [1]. Облучение клеток на гамма-терапевтической установке «Рокус-АМ»
«Рокус-АМ»- представляет собой терапевтическую гамма-установку, использующуюся в клинической практике при лучевой терапии опухолей различных локализаций. Источником излучения служит кобальт-60 (Со-60). В данном исследовании «Рокус-АМ» использовался для сравнительной оценки излучения малой мощности с высокоинтенсивным гамма-излучением. Мощность дозы терапевтических гамма-установок составляет 0,9 Гр/мин (15 мГр/сек), т.е. в 109 - 1010 раз уступает мощности наносекундных ускорителей.
Параметры облучения: расстояние источник-поверхность (РИП) 75 см, поле 10 х 10 см. Облучение производилось со смещением по времени в 1 - 1,5 часа относительно времени облучения на установке сверхинтенсивного гамма-излучения. Работа с культурами клеток
В качестве биологической модели использованы клетки перевивной культуры РС3 (рак предстательной железы человека, коллекция Cell Lines Service (Human Prostate Adenocarcinoma, 300312)).
Перед культивацией клетки подвергали разморозке и отмывке:
1. Клетки в виале быстро размораживали в инкубаторе при 37°С.
2. Размороженную клеточную суспензию помещали в 15 мл полной ростовой среды DMEM с 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), осторожно перемешивали.
3. Центрифугировали 8 мин при 300 g.
4. Сливали среду, осадок ресуспендировали в 5 мл среды DMEM c 15% содержанием FBS и засевали клетки во флакон.
Клетки культивировали с использованием среды DMEM (ПанЭко, Россия) с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (ПанЭко, Россия) и добавлением антибиотика гентамицина во флаконах Tissue Culture Flask (Sarstedt, Германия); в условиях 5% CO2 и 370 С. Пересев осуществляли каждые 4 - 5 дней. Для снятия клеток с адгезивного дна флакона и их пересева использовался раствор трипсина (ПанЭко, Россия). Мониторинг состояния клеточных культур осуществлялся с помощью микроскопа MCX300 (Micros, Австрия).
Цитофлуорометрический анализ проводился на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter (USA), источник излучения - аргоновый лазер (Х=488 нм). Исследование количества ДНР ДНК проведено на основании оценки уровня фосфорилирированного гистона Н2АХ с помощью набора фирмы Millipore (17-344 H2A.X Phosphorylation Assay Kit (for Flow Cytometry)), анализ проводился согласно методике производителя.
Количество ДНР оценивалось по смещению положения пика флуоресценции (Рис. 1) относительно положения пика в контрольных необлученных образцах.
Overlay Plot 1
¥и 1_од
№
а>
1,7 Гр
ТТЛ]-Г 1 Г 1 1ПП т
Р1_1 Ьод
п
<s>
а>
5,6 Гр
¡I mi I
CLi
ш
1,2 Гр
I И II I ! f ! II III I I I ! I II
FL1 Log
v>
□J Ш
3,0 Гр
I I I ill II I I 11 II III I I I 11II
FL1 Log
(f>
Of
Ш
13,3 Гр
Log
тг=—..........1 I I I II ll| I I I 11 II
FL1 Log
Рисунок 1. Пример изменения интенсивности флуоресценции в образцах клеток культуры РС-3 после воздействия высокоинтенсивного рентгеновского излучения по сравнению с контролем (красный пик) (облучение в дозе 0 Гр). Результаты и обсуждение
Образование ДНР является одним из ключевых моментов повреждающего действия ионизирующего излучения на клетку. Как показано в большом количестве исследований [8, 9, 12], во многом, именно уровень ДНР определяет дальнейшую судьбу клетки: запуск систем репарации, остановка деления, индукция апоптоза и др. Таким
образом, количество радиоиндуцированных ДНР можно рассматривать как показатель повреждающего воздействия ионизирующего излучения [7].
На рисунке 2 представлены зависимости относительного уровня ДНР в клетках рака предстательной железы человека РС3 от дозы при двух режимах облучения.
Рисунок 2. Относительный уровень ДНР ДНК в культуре клеток рака предстательной железы человека РС3. Красные квадраты показывают количество ДНР при облучении на гамма-терапевтическом аппарате Рокус М, синие ромбы - при облучении на экспериментальной установке «МИР-М» со сверхвысокой мощностью дозы.
Приведенные результаты показывают принципиальное отличие при воздействии гамма излучения, имеющего терапевтическую мощность дозы, и гамма излучения со сверхвысокой мощностью дозы. Тогда как увеличение дозы при облучении на терапевтическом гамма аппарате приводит к линейному росту числа ДНР, облучение при сверхвысокой мощности дозы приводит к резкому увеличению количества ДНР уже при дозах 2 - 3 Гр, и при возрастании дозы число ДНР продолжает увеличиваться. При этом количество ДНР растет нелинейно. Общее количество ДНР на клетку при воздействии
сверхвысокой мощности дозы в 5 - 6 раз выше, по сравнению с количеством, образуемым при облучении с низкой мощностью дозы при дозах выще 10 - 12 Гр.
При терапевтической мощности дозы 1,5 - 2 Гр/мин в клетке с характерным размером ~ 10 мкм усреднено поглощается ~ 100 квантов в секунду с энергией ~ 100 кэВ. Таким образом, акты воздействия отделены временем 1 - 10 мсек. Репарационные процессы в клетке, идущие с более коротким временем, должны успевать устранять повреждения. Значительное увеличение интенсивности дозы, достигнутое на установке «МИР-М», сокращает время между последовательными актами взаимодействия излучения на 6 - 7 порядков величины, что приводит к изменению реакции клетки на облучение. Возможно также, что увеличение числа ДНР связано с наличием/развитием нелинейных эффектов в клетке с множественными одновременно образующимися повреждениями. Отличия в уровне ДНР, полученные при облучении клеток линии РС3 на установке «МИР-М», могут быть связаны как с процессами образования ДНР, так и с эффективностью работы систем репарации в клетке. Недостаточность, неэффективность репаративных механизмов в опухолевых клетках показана в ряде экспериментальных исследований [4, 11], также отмечается, что эффективность репарации зависит как от типа и интенсивности воздействия, так и от функциональных особенностей клеток [6]. При облучениях, характеризующихся высокой мощностью дозы, параметры радиочувствительности клеток меняются, возрастает количество остаточных, нерепарированных ДНР [5, 9]. Мы ранее показали, что разные линии клеток злокачественных опухолей человека обнаруживают неодинаковую реакцию при воздействии фотонного облучения сверхвысокой мощности [2]. Таким образом, можно предположить, что вклад эффекта мощности дозы в повреждение клетки определяется, в первую очередь, состоянием системы репарации. Поиск эффективных методов оценки прогноза чувствительности к параметрам фотонного излучения имеет принципиальное значение при разработке методов клинического применения излучения высокой мощности
дозы [8]. Полученные нами результаты позволяют высказать предположение о перспективности исследований гамма излучения со сверхвысокой мощностью дозы для возможного его дальнейшего применения в лучевой терапии злокачественных опухолей.
Исследование выполнено при поддержке проекта РНФ № 16-15-10355.
Список литературы
1. Грабовский Е.В., Олейник Г.М., Крастелев Е.Г. и др. Анализ индукции апоптоза лимфоцитов периферической крови человека сверхинтенсивным гамма-излучением invitro. Вестник РГМУ. 2017. Т. 6. С. 59-66.
2. Шишкин А.М., Смирнов В.П., Грабовский Е.В. и др. Сравнение индукции апоптоза в клеточных культурах при фотонном облучении низкой и сверхвысокой мощности. Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России. 2017. Т. 17. № 3. http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v17/docs/bozhenko.pdf (Дата доступа 14. 08. 2018).
3. Betlazar C., Middleton R.J., Banati R.B., Liua G.J. The impact of high and low dose ionising radiation on the central nervous system. Redox Biol. 2016. V. 9. P. 144-156.
4. Cleri F., Landuzzi F., Blossey R Mechanical evolution of DNA double-strand breaks in the nucleosome. PLoS Comput Biol. 2018. V. 14. No. 6: e1006224.
5. Dokic I., Mairani A., Niklas M., et al. Next generation multi-scale biophysical characterization of high precision cancer particle radiotherapy using clinical proton, helium-, carbon- and oxygen ion beams. Oncotarget. 2016. V. 7. No. 35. P. 56676-56689.
6. Hojo H., Dohmae T., Hotta K., et al. Difference in the relative biological effectiveness and DNA damage repair processes in response to proton beam therapy according to the positions of the spread out Bragg peak. Radiat Oncol. 2017. V. 12. No. 1: 111.
7. Kadhim M., Salomaa S., Wright E., et al. Non-targeted effects of ionizing radiation-implications for low dose risk. Mutat Res. 2013. V. 752. No. 1. P. 84-98.
8. Keta O., Todorovic D., Popovic N., et al. Radiosensitivity of human ovarian carcinoma and melanoma cells to y-rays and protons. Arch Med Sci. 2014.V. 10. No. 3. P. 578-586.
9. Lakomiec K., Kumala S., HancockR., Rzeszowska-Wolny J., Fujarewicz K. Modeling the repair of DNA strand breaks caused by y-radiation in a minichromosome. Phys Biol. 2014. V. 11. No. 4: 045003.
10. Lee S.Y., JeongE.K., Ju M.K., et al. Induction of metastasis, cancer stem cell phenotype, and oncogenic metabolism in cancer cells by ionizing radiation. Mol Cancer. 2017. V. 16. No. 1: 10.
11. Sheng Y., Xu M., Li C., et al. Nm23-H1 is involved in the repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks in the A549 lung cancer cell line. BMC Cancer. 2018. V. 18. No. 1: 710.
12. Suetens A., Konings K., Moreels M., et al. Higher Initial DNA Damage and Persistent Cell Cycle Arrest after Carbon Ion Irradiation Compared to X-irradiation in Prostate and Colon Cancer Cells. Front Oncol. 2016. V. 6: 87.
