CC BY
18УДК: 616-092: 612.017.1: 577.114: 616.61: 616-073
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДСВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА И С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПОЧЕК НА ГЕМОДИАДИЗЕ И ПЕРИТОНИАЛЬНОМ ДИАЛИЗЕ
А. В. Климчук, В. А. Белоглазов, А. И. Гордиенко
Кафедра внутренней медицины № 2
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И.Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина 5/7, г.Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
E-mail: [email protected], [email protected]
РЕЗЮМЕ
Системное воспаление играет основную роль в развитии атеросклероза и является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и смертности у больных хронической болезнью почек. Известно, что эндотоксин (ЭТ) является одним из сильнейших провоспалительных стимулов. Среди неантительных ЭТ связывающих факторов особое место занимает липополисахаридсвязывающий белок (ЛСБ). Целью нашего исследования стало изучение явилось проведение сравнительного изучения уровня ЛСБ и С-реактивного белка у больных на программном гемодиализе (ГД) и амбулаторном перитонеальном диализе (ПД). Материалы и методы: обследованы 16 больных с хронической болезнью почек 5 стадии (ХБП) на постоянном амбулаторном перитонеальном диализе и 64 пациентов на программном гемодиализе. Для исследования ЛСБ использовали тест-системы «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HL425 производства "Hycult biotechnology" Голландия. Уровень С-реактивного белка определялся методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Результаты: Установлено, что у больных на программном ГД и ПД в крови концентрация ЛСБ и СРБ значительно повышены по сравнению с референсным диапазоном нормы, без существенных межгрупповых различий. Выявлена наличие положительной корреляционная связь между ЛСБ и СРБ.
Полученные данные дают основание полагать, что на концентрацию ЛСБ и СРБ в крови оказывает влияние факт диализа у больных ХБП 5 стадии, а не вид диализа.
COMPARATIVE RESEARCH OF LIPOPOLYSACCHARIDE BINDING PROTEIN
AND C-REACTIVE PROTEIN IN PATIENTS WITH CHRONIC KIDNEY DISEASE ON HEMODIALYSIS AND PERITONEAL DIALYSIS
V. A. Biloglazov, A. V. Klimchuk, A. I. Gordienko
SUMMARY
The systemic inflammation plays the main role in development of atherosclerosis and is independent risk factor cardiovascular diseases and mortality at patients with a chronic kidneys disease. Endotoxin is one of the strongest pro-inflammatory factors. However, influence endotoxin can be blocked by endotoxin bindings systems. Among the other binding factors ET occupies a special place lipopolysaccharide binding protein (LBP). The purpose of our research has been to explore a comparative study of LBP levels and C-reactive protein in patients on hemodialysis (HD) and ambulatory peritoneal dialysis (PD). Materials and methods: inspection 16 patients with chronic kidney disease stage 5 on continuous ambulatory peritoneal dialysis and 64 patients on hemodialysis. To study the LBP used test systems «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HL425 production» Hycult biotechnology «Holland. C-reactive protein was determined by ELISA. Results: The concentration of LSD and CRP in blood of patients with CKD on HD and PD significantly increased in comparison with the reference normal range, with no significant between-group differences. It revealed the presence of a positive correlation between LBP and CRP. The findings suggest that the concentration of LBP and CRP in the blood affects the fact of dialysis in patients with CKD stage 5, but not the kind of dialysis. Keywords: chronic kidney disease, dialysis, chronic inflammation, endotoxin. lipopolysaccharide binding protein.
Ключевые слова: хроническая болезнь почек, диализ, хроническое воспаление, эндотоксин,
липополисахаридсвязывающий белок.
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются главной причиной смертности больных на программном гемодиализе (ГД) и перитонеальном диализе (ПД). Известно, что хроническое воспаление является независимым фактором риска ССЗ и смертности у больных хронической болезною почек (ХБП) [10,11]. Интегральные механизмы формирования системного воспаления при ХБП остаются до конца не изученными.
Роль одного из важнейших триггеров системного воспаления при ХБП может играть эндотоксин (ЭТ) грамотрицательной бактерии, который, как известно, представляет собой молекулу ли-пополисахарида (ЛПС), входящую в структуру наружной стенки бактерий и является одним из самых сильных провоспалительных стимулов. Транслокация ЭТ из кишечника, который обильно колонизирован грамотрицательными
2015, т. 5, №2 (18)
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
бактериями, имеет широкий спектр эффектов на сердечно-сосудистую систему: запускает системное воспаление, атеросклероз и оксидатив-ный стресс [6]. Однако, негативные провоспа-лительные эффекты воздействия ЭТ могут нивелироваться иммунной системой (в том числе антителами к ЭТ) если её ответ адекватен уровню эндотоксинемии. Среди неантительных ЭТ связывающих факторов особое место занимает белок связывающий липополисахарид (ЛСБ). ЛСБ является сывороточным белком с молекулярной массой 60 кДа, относится к острофазным белкам, синтезируется гепатоцитами, обладает высокой специфичкностью и аффиностью к ЭТ. Именно ЛСБ образует с ЭТ комплекс, который, воздействуя на CD14 рецепторы, приводит, в конечном итоге, к активации NF-kB, продукции провос-палительных цитокинов (ФНОа, ИЛ1), молекул адгезии (ICAM-1, ICAM-3, VCAM, Е-селектин) [3]. Необходимо отметить, что сравнительных исследований концентрации этих факторов в крови больных на ГД и ПД не проводилось.
Исходя из этого целью нашего исследования явилось проведение сравнительного изучения уровня ЛСБ и С-реактивного белка (СРБ) у больных на программном гемодиализе и амбулаторном перитонеальном диализе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В условиях отделения интенсивной нефрологии и диализа КРУ «КТМО Университетская клиника» г. Симферополя было обследовано 80 пациентов с ХБП 5 стадии. Из них 16 больных на постоянном амбулаторном ПД в среднем возрасте 41,3±2,3 года, 13 женщин (81%) и 3 мужчин (19%), все пациенты получали ПД 3-4 раза в день. А также 64 пациента, находящихся на программном ГД, средний возраст 45,7±1,6 лет от 18 до 75 лет, 46 женщин (72%) и 18 мужчин (28%). Сеансы программного ГД проводились 3 раза в неделю, на аппаратах «искусственная почка» АК-95 (Швеция) и «TINA» (США) с использованием бикар-
Липополисахаридсвязывающий белок и уровень С
ПД и
бонатного буфера и диализатора GFS-16 с мембраной гемофан фирмы «Gambro» (Швеция), длительность сеанса ГД составляла 4-5 часов.
Для исследования ЛСБ использовали тест-системы «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HL425 производства "Hycult biotechnology" Голландия. При проведении исследования строго придерживались инструкции к реактивам. Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационный микропланшете покрытыми антителами против ЛСБ. Во время инкубации ЛСБ связывались с антителами, не связанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к ЛСБ добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептовидин-перк-сидазный коньюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе "StatFox 2100" на длине волны 450 нм. Концентрацию ЛСБ выражали в мкг/мл.
Сожержание СРБ в крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием протоколов, разработанных в отделе клинической иммунологии ЦНИЛ ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского» [1, 2]. Концентрацию СРБ выражали в мг/л. Контрольную группу составили 22 практически здоровых людей, соответствующих больным ХБП по возрастному диапазону и половому распределению.
Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием лицензионной программы «MedStat» (серийный №MS0011 ДНПП ТОВ «Альфа», г. Донецк) для параметрических и непараметрических критериев.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Данные изучения гуморального анти-эндотоксинового иммунитета и концентрацию в периферической крови СРБ у больных ХБП на ПД и ГД представлены в таблице 1.
Таблица 1
-реактивного белка у больных ХБП, находящихся на на ГД
Показатель Статистический показатель Норма Больные ХБП ПД Больные ХБП ГД
ЛСБ мкг/мл Me (25% - 75%) n 5,3 (3,5-8,0) 22 11,4 (8,45-22,6) 16 p<0,01 10,85 (6,6-19,3) 64 p<0,01 р1 =0,282
СРБ мг/л Me (25% - 75%) n 1,4 (0,6-2) 22 12,3 (2,7-28,6) 16 p<0,001 11,2 (5,6-30,8) 64 p<0,001 р1=0,440
Примечание: р - достоверность различий с нормой (р<0,05), р1- достоверность различий между соответствующим показателем больных на ПД и на ГД по '-критерию Вилкоксона для двух независимых выборок; п - количество обследуемых больных.
При изучении концентрации в крови ЛСБ выявлено, что у пациентов ХБП данный показатель повышен до 11,4 (8,45-22,6) мкг/мл в группе ПД и до 10,85 (6,6-19,3) мкг/мл (р<0,01), без существенных межгрупповых различий (р =0,282).
Из полученных данных нами установлено, что у больных ХБП V стадии, находящихся на ПД имеется значительное повышение уровня СРБ - в 8,8 раз (р<0,001) по сравнению с показателями здоровых доноров. У больных получающих программный ГД мы также отмечали повышение в 8 раз СРБ (р<0,001). При этом достоверных межгрупповых различий между больными на ПД и ГД не выявлено (р=0,440).
Выявлено наличие корреляционной связи между уровнем СРБ и ЛПБ по коэффициенту Кендала Таи>0 (Таи=0,550), на уровне значимости р<0,01 для группы больных на ПД и Таи>0 (Таи=0,692), на уровне значимости р<0,01 для группы больных на ГД.
Известно, что пациенты с ХБП подвергаются значительной эндотоксинемии. циркулятор-ная эндотоксинемия увеличивается с ростом стадии ХБП и её резкий подъем наблюдается у пациентов в терминальной стадии ХБП при начале ГД и обусловлен, по-видимому, индуцированным ГД системным циркуляторным стрессом и рецидивирующей регионарной ишемией ведущей к увеличению транслокации ЭТ из кишечника в портальную кровь и по порто-кавальным шунтам в системную циркуляцию. В ряде исследований, выполненных в последние годы, отмечается, выраженная корреляционная взаимосвязь между уровнем ЭТ и объемом ультрафильтрации при ГД, что авторами связывается со значительным снижением перфузии в критических органах, му-козальной и мезентеральной ишемией. У этих больных предиализный ЭТ коррелирует с плазменным сердечным тропонином Т и СРБ, а эн-дотоксинемия ассоциируется с системным воспалением и снижением выживаемости [7,8,9]. Известно также, что эндотоксинемия распространена и среди пациентов на ПД, кроме этого степень эндотоксинемии у этих больных связанна с тяжестью системного воспаления и атеросклероза. Кроме этого, исследования продемонстрировали, что транслокация кишечной флоры является причиной грамотри-цательных перитонитов у пациентов с ПД [4]. Исходя из этого, можно судить, что у больных в терминальной стадии ХБП на ПД также как и у пациентов на ГД присутствует нарушение кишечного барьера, что, в свою очередь, может способствовать транслокации ЭТ и быть одной из причин эндотоксинемии, описанной многими авторами у этой категории пациентов.
Как было отмечено ранее, ЛСБ образует с ЭТ комплекс, являющийся активационным сигналом для СБ14/ТЬК4 рецепторов, что приводит к индукции провоспалительного ответа. В связи с тем, что СБ14 рецептор не может передать сигнал внутрь клетки, не имея внутрицитоплазматического домена, передает сигнал ТЬЯ4. Поэтому СБ14 структуры иногда называют корецептором ТЬЯ4 [12]. Низкие дозы ЭТ требуют обязательного присутствия ЛСБ. В присутствии ЛСБ концентрация ЭТ, необходимая для стимуляции секреции ФНО-а моноцитами/макрофагами, снижается на три порядка. Высокие концентрации ЭТ действуют на клетки независимо от ЛСБ и СБ14 [3], как было установлено через СБ11Ь рецепторы [5].
В литературе существуют противоречивые мнения относительно участия С-реактивного белка (СРБ) в связывании ЭТ. СРБ, как известно, являясь фактором врожденного иммунитета, может связываться с микробными компонентами, такими как фосфорилхолин или различными углеводными детерминантами бактерий, Бе-рецепторами клеток и стимулировать элиминацию патогенов путем опсонизации или активации классического пути системы комплемента. С другой стороны, СРБ является классическим белком острой фазы воспаления и маркером повреждения, инфекции и воспаления. [18].
Выявленная нами ассоциация высоких уровней ЛСБ и СРБ у пациентов получающих программный ГД и ПД свидетельствует о высоком уровне системного воспаления и хронической эндотоксинемии у больных в терминальной стадии ХБП и не зависит от метода заместительной почечной терапии. Полученные данные дают основание полагать, что на концентрацию ЛСБ и СРБ в крови оказывает влияние факт диализа у больных ХБП 5 стадии, а не вид диализа.
Вероятно, развитие методов снижающих уровень системного воспаления у этих больных, могут привести к улучшению прогноза и качества жизни больных терминальной стадией ХБП на диализе.
ВЫВОДЫ
1. У больных ХБП, находящихся на ГД и ПД, выявлено достоверное повышение ЛСБ соответственно до 10,85 (6,6-19,3) и 11,4 (8,45-22,6) мкг/мл.
2. У всех больных на ГД и ПД выявлен повышенный уровень СРБ: до 11,2 (5,6-30,8) мг/л у больных на ГД и до 12,3 (2,7-28,6) мг/л у больных на ПД.
3. Выявлена положительная корреляционная связь между ЛСБ и СРБ по коэффициенту Таи>0 (Таи=0,550), на уровне значимости р<0,01 для группы больных на ПД и Таи>0 (Таи=0,692) , на уровне значимости р<0,01 для группы больных на ГД.
2015, т. 5, №2 (18)
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
ЛИТЕРАТУРА
1. Гордieнко A.I. Високочутл иви й iмуноферментний метод кшькюного визнaчення змюту С-реaктивного бiлкa в кровi./ Гордieнко A.I., Бiлоглaзов В.О., Бaковa A.A. // lнформaцiйний лист про нововведення в ^CTeMi охорони здоров'я №139.-К., УКРMЕДПATЕНTIНФОРM, 2010.- 4 с.
2. ^^енко A.I. Пaтeнт 70193 А. СпоЫб визнa-чення aнтитiл до лiпополiсaхaридiв грaмнeгaтивних бaктeрiй./ Гордieнко A.I., Бiлоглaзов В.О. // Зaявл. 29.12. 2003; 0публ.15.09. 2004. - Бюл. №9.
3. Brass D. CD14 is an essential mediator of LPS-induced airway disease/ Brass D., Hollingsworth J., McElvania-Tekippe E., Garantziotis S. et al. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007. - Vol.293, №7.- P. L77-L83.
4. Cheuk-Chun Szeto. Endotoxemia is Related to Systemic Inflammation and Atherosclerosis in Peritoneal Dialysis Patients. / Cheuk-Chun Szeto, Bonnie Ching-Ha Kwan, Kai-Ming Chow, [et al] // Clin J Am Soc Nephrol -2008 -№ 3 - p. 431-436.
5. Jeyaseelan S. Distinct roles of pattern recognition receptors CD14 and Toll-like receptor 4 in acute lung injury/ Jeyaseelan S., Chu H.W., Young S.K., Freeman M.W. et al. // Infect. Immun. - 2005. - Vol.73, №5. - P. 1754-1763.
6. Mayr F.B. Effects of low dose endotoxaemia on endothelial progenitor cells in humans./ Mayr F.B., Spiel
A.O., Leitner J.M., [et al] // Atherosclerosis - 2007- № 191- p.e202-e206.
7. McIntyre C.W. Circulating endotoxemia: a novel factor in systemic inflammation and cardiovascular disease in chronic kidney disease. / McIntyre C.W., Harrison L.E., Eldehni M.T. [et al] // Clin J Am Soc Nephrol. - 2011 - Jan;6(1) - p.133-41.
8. Mehrotra R. Similar outcomes with hemodialysis and peritoneal dialysis in patients with end-stage renal disease. / Mehrotra R., Chiu Y.W., Kalantar-Zadeh K. [et al] // Arch Intern Med - 2011 - №171 - p.110-118.
9. Robinson B.M. International haemodialysis patient outcomes comparisons revisited: the role of practice patterns and other factors. / Robinson BM, Port F. // Clin J Am Soc Nephrol - 2009 - № 4 (suppl 1) -p. S12-S17.
10. Weinhandl E.D. Propensity-matched mortality comparison of incident haemodialysis and peritoneal dialysis patients. / Weinhandl E.D., Foley R.N., Gilbertson D.T. [et al] // J Am Soc Nephrol - 2010 - № 21 - p.499-506.
11. Weiner D.E. Cardiovascular outcomes and all-cause mortality: exploring the interaction between CKD and cardiovascular disease. / Weiner D.E., Tabatabai S., Tighiouart H. [et al] // Am J Kidney Dis - 2006 -№ 48 -p.392-401.
12. Xiaoyuan Wang. Endotoxins: Structure, Function and Recognition./ Xiaoyuan Wang, Peter J. Quinn. -Springer Science+Business Media B.V., 2010 - 415 p.
