Сравнительное исследование химического состава видов рода хвощ флоры Сибири Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.322

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ВИДОВ РОДА ХВОЩ ФЛОРЫ СИБИРИ

© Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина

Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,

2\7, Томск, 634050 (Россия). E-mail: galina_kalinkina@mail.ru

В данном сообщении представлены результаты сравнительного количественного определения основных групп биологически активных веществ и качественного состава фенольных соединений в надземной части 10 видов хвощей флоры Сибири. Установлены различия в количественном содержании и качественном составе флавоноидов, фенолкарбоно-вых кислот и соединений кремния хвощей подрода Equisetum и подрода Hippohaete, что подтверждает их видовую самостоятельность и предполагает различия в фармакологических свойствах.

Ключевые слова: хвощевые, фенольные соединения, флавоноиды, гидроскикоричные кислоты, кремний, 5-флавон-гликозиды.

Введение

Фармацевтическая практика постоянно требует увеличения ассортимента и количества лекарственного растительного сырья (ЛРС) для получения новых эффективных лекарственных препаратов. Расширение ассортимента ЛРС возможно за счет внедрения в медицинскую практику растений народной медицины и прежде всего видов, систематически близких к официнальным. С этой точки зрения интерес представляют растения рода хвощ, широко распространенные на территории Российской Федерации [1, 2]. В медицинской практике в настоящее время используется только один вид хвоща - хвощ полевой Equisetum arvense, все другие виды хвоща рассматриваются как примеси к официнальному. Проведенные нами предварительные исследования 6 видов хвоща флоры Сибири показали, что они представляют интерес для получения лекарственных средств различного фармакологического действия: противогрибкового, гепатопротекторного, ан-тимутагенного [3-6].

Полученные нами данные явились основанием для исследования химического состава растений рода хвощ. В настоящее время информация о качественном составе биологически активных веществ (БАВ) рода хвощ носит фрагментарный характер: фитохимическая характеристика большинства видов неполная, а у некоторых представителей рода отсутствует. Наиболее изучен фенольный комплекс хвоща полевого, произрастающего в европейской части России, Польше, Японии, Германии; значительное число видов флоры Сибири не изучены [7, 8].

Цель данного исследования - определение содержания различных групп биологически активных веществ (БАВ) и сравнительное хроматографическое изучение фенольных соединений филогенетически близких видов рода хвощ. В дальнейшем на основании этого можно будет предложить методологию прогноза фармакологических свойств хвощей и обосновать необходимость исследования перспективных видов данного рода. Кроме того, данные химического состава можно будет использовать с целью уточнения систематического положения отдельных таксонов рода хвощ.

* Автор, с которым следует вести переписку.

Экспериментальная часть

Объектами исследования являлись надземные части 10 дикорастущих видов рода Equisetum L., подрода Equisetum Sad. (Equisetum arvense L., E. palustre L., E. sylvaticum L., E. fluviatile L., E. pratense Ehrh., E. x litorale Kuehlew.) и подрода Hippohaete Milde (E. hyemale L., E. ramosissimum Desf, E. scirpoides Michx, E. variegatum Schleicher ex F. Weber & D.Mohr). Материал для сравнительного исследования химического состава был собран в течение всего вегетационного периода 1998-2007 гг. в различных регионах Сибири и некоторых областях европейской части России в пределах их естественного ареала.

Сравнительный химический анализ надземной части вышеперечисленных видов проводили с помощью общепринятых в фитохимическом анализе методов: метод избирательной жидкостной экстракции, хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента, колоночная и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), масс-спектроскопия (МС), УФ-спектрофотометрия.

Количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) в надземной части хвощей определяли: сумму флавоноидов - спектрофотометрическим методом; фенолкарбоновых кислот - хроматоспектрофотометрически и спектрофотометрически; сумму сапонинов, полисахаридов и их фракций - гравиметрическим методом; аскорбиновую кислоту - титриметрически; каротиноидов, витамина К и аминокислот -спектрофотометрически [6, 9-14]. Количественное определение соединений кремния в хвощах проводили фотоколориметрическим методом, основанным на способности кремниевой кислоты давать с ионами молибдена в кислой среде (рН=1,5-1,7) растворимую желтую кремнемолибденовую кислоту. Содержание кремния в пересчете на элементарный кремний находили по калибровочному графику, построенному по ряду стандартных растворов кремния, приготовленных из силиката натрия [15].

Для хроматографического исследования фенольных соединений использовали извлечения, полученные из сырья экстракцией 70% этанолом на водяной бане при t=60-70 °С (соотношение сырья и экстрагента 1 : 10). Экстракты сгущали под вакуумом и подвергали хроматографическому исследованию.

Для хроматографирования использовали бумагу марки «С» и «М» Санкт-Петербургской фабрики №2 имени Володарского; FN-3, FN-12 (Германия). Для тонкослойной хроматографии использовали пластины «Silufol 254» (Kavalier); пластины на алюминиевой подложке Merck KGaA (Germany) Kieselgel 60 F254; «Сорбфил» аналитические на полимерной и алюминиевой подложке ЗАО «Сорбполимер» (Россия).

В качестве растворителей для хроматографии на бумаге использовали: 2, 15, 60%-ный растворы уксусной кислоты; н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 2; 4 : 1 : 5); кислота уксусная - кислота хлористоводородная - вода (10 : 3 : 10). Для хроматографии в тонком слое сорбента использовали: хлороформ - этанол (10 : 1); хлороформ - уксусная кислота (9 : 1); хлороформ - метанол (3 : 1; 9 : 1).

Детектирование фенольных соединений на хроматограммах проводили в УФ-свете до и после проведения качественных реакций со спиртовым раствором алюминия хлорида и диазореактива Паули [16-18].

Для установления природы флавоноидных гликозидов проводили их кислотный гидролиз. Для этого с хроматограммы вырезали не разделяющиеся пятна тёмно-коричневой флюоресценции, измельчали, заливали 8% кислотой хлористоводородной и нагревали на водяной бане. Ход гидролиза контролировали с помощью хроматографии на бумаге в системе растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 2 и системе Форесталя (уксусная кислота - хлористоводородная кислота - вода 30 : 3 : 10). Для идентификации агликонов флавоноидов, элюированных с хроматограмм до и после гидролиза, использовали характер свечения в УФ-свете, величины Rf, окраску пятен на хроматограммах после проявления парами аммиака и раствором хлорида алюминия в сравнении с достоверными образцами и данными литературы. Углеводы, образующиеся в результате гидролиза флавоноидных гликозидов, анализировали методом хроматографии на бумаге в системе растворителей ацетон - н-бутанол - уксусная кислота - вода (7 : 2 : 2 : 2). Детектирование углеводных компонентов проводили бутанольным раствором анилинфталата с последующим прогреванием хроматограмм в сушильном шкафу при t=105 °С до проявления пятен [9, 10, 16]. Идентификацию проводили с использованием аутентичных образцов углеводов.

Для идентификации углеводов, фенолокислот и флавоноидов были использованы стандартные и аутентичные (известные) образцы производства Sigma-Aldrich, Fluka, Merck.

Обсуждение результатов

Проведенные исследования показали, что в надземной части 10 видов хвоща флоры Сибири присутствуют флавоноиды, фенолокислоты, аминокислоты, сапонины, витамины. Отличительной особенностью рода хвощ является наличие такого химического элемента, как кремний, который, несомненно, играет определенную роль в фармакологических свойствах препаратов хвощей. Однако данные о его содержании в видах рода хвощ весьма противоречивы, а для видов подрода Hippohaete практически отсутствуют.

Впервые в видах рода хвощ было определено содержание полисахаридов. Антрагликозиды, сердечные гликозиды, эфирные масла нами не обнаружены. Нами установлено отсутствие кумаринов в видах рода хвощ, что согласуется с данными литературы.

По содержанию основных групп БАВ виды, представленные в таблице 1, можно условно разделить на 2 группы:

Группа I - виды, близкие по составу хвощу полевому и интересные с точки зрения расширения его сырьевой базы. Эта группа представлена 6 видами подрода Equisetum: х. полевой, х. лесной, х. луговой, х. приречный, х. болотный и х. береговой (прибрежный). Виды первой группы преимущественно содержат фенольный комплекс (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты) до 1,5% и выше. Внутри подрода Equisetum выделяются х. полевой и х. береговой, в которых накапливается 1,39 и 1,21% флавоноидов и 0,57 и 0,60% фе-нолокислот соответственно; х. речной и х. болотный содержат соответственно 0,71 и 0,72% фенолокислот. По-видимому, фенольные соединения играют в этих видах хвощей важную биологическую роль и наряду с сапонинами, полисахаридами, витаминами и каротиноидами, также присутствующими в достаточном количестве, определяют фармакологическую активность данных растений. Фенольные соединения, в частности флавоноиды, можно использовать для стандартизации лекарственного растительного сырья видов группы I.

Группа II - виды, отличающиеся по химическому составу от х. полевого. Ко второй группе отнесены 4 вида хвоща подрода Hippohaete: х. зимующий, х. ветвистый, х. камышковый, х. пестрый. Доминирующей группой БАВ в данных видах являются соединения кремния (до 6%), определяющие как морфологические признаки видов (жесткие и трудно ломающиеся стебли и ветви), так и, возможно, их фармакологические свойства. Соединения кремния также можно рассматривать как ведущую группу БАВ для стандартизации лекарственного сырья видов этой группы. Из других групп БАВ, накапливающихся в достаточном количестве, следует отметить сапонины и полисахариды. Виды подрода Hippohaete относятся к видам, низкопро-дуцирующим флавоноиды и фенолокислоты: содержание флавоноидов не превышает 0,2%, а фенолокислот - 0,07%. Для видов этой группы фенольные соединения следует, вероятно, рассматривать как сопутствующие БАВ, не оказывающие существенного влияния на их фармакологические свойства.

Учитывая значимость фенольных соединений для видов хвоща группы I и их недостаточную изученность, данная группа БАВ выбрана нами для дальнейшего сравнительного хроматографического исследования.

Таблица 1. Результаты количественного определения основных групп БАВ в растениях рода Equisetum Ь. (% на а.с.с.)

Виды

к

0 К §

1

ы

И

О

к

о

ю

*

ч

о

к

о

е

(Й

о

ы

и о к о

а &

о

У

л

н

о

с

<

§

га

О4

ы

д

и

о

н

о

&

о

а

*

Подрод Equisetum Sad.

Equisetum arvense 1,39±0,04 0,57±0,02 7,37±0,31 11,42±0,19 0,53±0,02 0,22±0,006 4,78±0,72 1,31±0,15

Equisetum pratense 0,99±0,018 0,53±0,05 7,08±0,21 6,33±0,20 0,43±0,009 0,32±0,01 2,63±0,11 1,05±0,03

Equisetum sylvaticum 0,91±0,005 0,59±0,07 7,0±0,24 5,96±0,26 0,38±0,02 0,27±0,01 3,89±0,24 1,07±0,05

Equisetum palustre 1,11±0,01 0,72±0,01 8,92±0,17 5,98±0,22 0,46±0,01 0,28±0,01 5,75±0,31 1,23±0,10

Equisetum Атшйіе 1,21±0,004 0,71±0,02 7,86±0,19 6,08±0,14 0,32±0,01 0,34±0,02 4,83±0,21 1,19±0,16

Equisetum х Шогаїе 1Д01±0,003 0,60±0,02 7,58±0,16 9,12±0,18 0,45±0,02 0,30±0,004 4,70±0,60 1,36±0,09

Подрод Hippohaete Milde

Equisetum Иетаїе 0,16±0,009 0,062±0,00 5,75±0,25 4,19±0,07 0,26±0,01 0,29±0,01 0,54±0,04 4,04±0,11

Equisetum variegatum 0,11±0,007 0,056±0,00 3,21± 0,20 3,49±0,06 0,19±0,01 0,26±0,01 0,48±0,03 3,31±0,11

Equisetum ramosissimum 0,17±0,009 0,058±0,00 3,56± 0,23 3,55±0,07 0,19±0,01 0,19±0,01 0,40±0,04 3,53±0,09

Equisetum scirpoides 0,12±0,006 0,033±0,00 3,44± 0,10 2,23±0,04 0,09±0,01 0,10±0,01 0,22±0,04 3,44±0,10

Результаты хроматографического анализа спиртовых экстрактов хвощей, представленные в таблице 2, показывают, что при детектировании в УФ-свете до и после проведения качественных реакций, на хроматограммах было обнаружено 29 веществ фенольной природы.

По характерной окраске пятен в УФ- и видимом свете, значениям в сравнении с известными вещест-

вами идентифицированы кофейная, п-кумаровая, феруловая, п-оксибензойная, галловая, хлорогеновая, ванилиновая и протокатеховая кислоты.

Вещества на хроматограммах, имеющие в УФ-свете темно-коричневую, слабо-желтую и бурую флюоресценцию, отнесены к флавоноидам. После обработки хроматограмм 2% спиртовым раствором хлорида алюминия эти пятна приобретали окраску, характерную для гликозидированных флавонов и флавонолов. Для установления их природы проводили кислотный гидролиз. По хроматографическому поведению (характерному свечению в УФ-свете, величине Яс окраске пятен на хроматограмме после проявления парами аммиака и раствором алюминия хлорида) в сравнении с достоверными образцами и данными литературы агликоны флаво-ноидов идентифицированы как кверцетин, лютеолин, кемпферол, апигенин. Углеводы, образующиеся в результате гидролиза флавоноидных гликозидов, идентифицированы как Б-глюкоза и Ь-рамноза.

Таблица 2. Результаты хроматографического исследования фенольных соединений растений рода Equisetum Ь.

Значение

Окраска пятен

Виды

В

м

К

о

о

о

СЛ

К

о

О4

К

о

о

о

№

К

о

о4

2

р 3

о к о

он

ра

§ Й

©

О

<

&

и

ч

Па

еакт

е

р

о

3

и

подрод Equisetum Sad.

£

а

14

к 8 £ -3 8 £ х 8 .¡а 'К а 8 1 о 8 8 3 §

14 еч еч ЕЧ ЕЧ ЕЧ ЕЧ ЕЧ

подрод Hippohaete МіМє

Флавоноиды

Ф-1 0,72 0,43 0,23 коричн. т/ж + + + + + + - - - +

Ф-2 0,59 0,12 0,04 0,58 гол. гол. + - - - - + - - - -

Ф-3 0,50 0,15 0,06 0,46 я/г я/г ++ - - - - + - - - -

Ф-4 0,33 0,07 0,02 0,35 я/г желт. ++ - - - - + - - - -

Ф-5 0,58 0,32 0,18 - ж/кор. желт. ++ + + - - - - - - -

Ф-6 0,52 0,58 0,03 коричн. ж/бур. + + + + + + + + + +

Ф-7 0,74 0,05 т/ж желт. + - - - ++ + - - - -

Ф-8 0,73 0,44 0,21 т/бур. желт. - - - + - - - + - +

Ф-9 0,56 0,50 сл/ж желт. - - - + - - - - - -

Ф-10 0,60 0,57 0,37 коричн. т/ж - + + + - - - - - -

Ф-11 0,52 0,67 0,48 сл/ж желт. - +

Ф-12 0,45 0,51 0,32 коричн. желт. - + ++ - - - - - - -

Ф-13 0,42 0,49 0,25 коричн. желт. + - + - - - - - - -

Ф-14 0,30 0,63 0,48 т/ж желт. + + + + + + + + + +

Ф-15 0,41 0,57 0,37 коричн. ж/бур. - +

Ф-16 0,45 0,76 коричн. ж/бур. ++

Ф-17 0,45 0,71 0,54 коричн. ж/бур. - - - + - - - - - -

Ф-18 0,37 0,76 0,61 коричн. ж/бур. - - - + - - - + - -

Ф-19 0,28 0,67 0,51 темная ж/бур. - +

Ф-20 0,15 0,67 коричн. ж/бур. + + ++ - ++ + - - - -

Ф-21 0,11 0,65 0,54 коричн. ж/бур. - - - - - - + + + +

Фенолкарбоновые кислоты

Фк-2 0,63 0,66 гол. кор. + - - - + + - - - -

Фк-3 0,91 0,68 0,87 б/цв роз/кр сл сл - - сл сл - - - -

Фк-4 0,71 0,40 0,74 0,80 син/ф кр/кор + + + + + + + + + +

Фк-5 0,76 0,46 0, 24 фиол. кр/кор сл - - - - - + + + +

Фк-6 0,89 0,80 0,76 фиол. красн. сл - - - сл - - - - -

Фк-7 0,89 0,47 фиол. оранж. + + + + + + + + + +

Фк-8 0,83 0,52 0,31 гол. кор. + - - - + + + - - -

Фк-9 0,80 0,35 0,30 гол. кор. +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - -

Примечание: «+» - вещество присутствует; «-» - вещество не обнаружено; сл - следы. Флюоресценция: коричн.- коричневая; гол. - голубая; я/г - ярко-голубая; т/ж - темно-желтая; син/ф - сине-фиолетовая; кр/кор - красно-коричневая; желт.-желтая; красн. - красная; ж/бур. - желто-бурая; сл/ж - слабо-желтая; т/бур. - темно-бурая; ж/кор. - желтокоричневая; роз/кр - розово-красная; оранж. - оранжевая.

При хроматографическом исследовании фенольных соединений хвощей в тонком слое сорбента (ТСХ) в надземной части хвоща полевого было также обнаружено несколько веществ флавоноидной природы. Из них 3 вещества с около 0,35, 0,46 и 0,58 относятся к 5-оксифлавонам. Данные вещества отличаются

от других флавоноидов по характерной ярко-голубой флюоресенции [6-8, 16-17]. Сравнительное исследование хвоща полевого из разных мест сбора выявило наличие на хроматограммах как трех, так и двух зон адсорбции с подобным свечением. Так, в образцах из Томской, Кемеровской, Новосибирской, Иркутской областей, Республики Алтай обнаружены три характерные зоны адсорбции. В некоторых образцах из Московской, Ленинградской, Иркутской областей выявлены две зоны адсорбции, которые идентифицировали как 5-О-Р-Б-глюкопиранозиды апигенина и генкванина. При этом на хроматограммах с двумя зонами адсорбции отсутствовало ярко-голубое пятно с 0,35, соответствующее 5-О-р-Б-глюкопиранозиду лютеоли-

на. Таким образом, можно предположить для хвоща полевого наличие двух хемотипов, которые отличаются накоплением лютеолин - 5-О-глюкозида. Данный факт учтен нами в новой редакции фармакопейной статьи для ГФ XII издания «Хвоща полевого трава».

На хроматограммах экстрактов хвоща лесного, х. лугового, х. болотного, х. зимующего, х. камышкового, х. пестрого и х. ветвистого пятна, характерные для 5-оксифлавонов, не обнаружены. При исследовании некоторых образцов, идентифицированных первоначально как хвощ речной, были получены хроматограммы идентичные хвощу полевому, в том числе обнаружены 5-оксифлавоны. Это не совпадало с полученными нами ранее данными о том, что 5-оксифлавоны лютеолина, апигенина и генкванина - вещества, специфичные только для хвоща полевого и в других видах хвоща отсутствуют. В ходе дальнейшего детального ана-томо-морфологического исследования эти образцы были идентифицированы как хвощ прибрежный (береговой) - Equisetum х Шога1е Kuehlew, который является гибридом хвоща полевого и хвоща речного [1,19]. Кроме того, в экстракте хвоща прибрежного обнаружены вещества, по хроматографическому поведению близкие веществам хвоща речного. Таким образом, полученные результаты подтверждают данные литературы о том, что химический состав гибридов близок химическому составу родителей [19].

Из литературы известно, что присутствие 5-оксифлавонов в растениях - факт довольно редкий, и поэтому их нахождение в хвоще полевом и хвоще береговом представляет диагностическое значение для видов рода хвощ, а также таксономический интерес [7, 10, 16].

Выводы

1. Обобщая результаты сравнительного исследования химического состава хвощей флоры Сибири, следует отметить, что биологически активные вещества видов данного рода представлены флавоноидами, фе-нолкарбоновыми кислотами, соединениями кремния, аминокислотами, полисахаридным комплексом, сапонинами, витамином К, каротиноидами.

2. По содержанию основных групп БАВ (фенольных соединений и соединений кремния) род хвощ разделен на две группы: I - виды, близкие по составу хвощу полевому, преимущественно содержат фенольный комплекс до 1,5% и выше; II - виды, отличающиеся по химическому составу от хвоща полевого, в которых доминирующей группой БАВ являются соединения кремния (до 6%).

3. С использованием методов хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента установлены различия в качественном составе флавоноидов, фенолкарбоновых кислот хвощей подрода Equisetum и подрода Hippo-haete, что подтверждает их видовую самостоятельность и предполагает различия в фармакологических свойствах. Веществами-маркерами видов рода хвощ являются 5-оксифлавоны, представляющие диагностическое и таксономическое значение для данного рода.

Список литературы

1. Флора Сибири Ьусоро&асеае -НуёгосИагИасеае / сост. Кашина Л.И., Красноборов И.М., Шауло Д.Н и др. Новосибирск, 1988. 200 с.

2. Черепанов С.К. Сосудистые растения СССР. Л., 1981. 510 с.

3. Дмитрук С.Е., Коломиец Н.Э., Дмитрук В.С., Мальцева О.А. Грибковые заболевания и альтернативные возможности фитотерапии // Бюллетень СО РАМН. 2001. №3. С. 9-14.

4. Коломиец Н.Э., Михалева Л.К., Шейкин В.В. Изучение гепатопротекторных свойств хвоща полевого // Фармация. 2005. №4. С. 38-40.

5. Коломиец Н.Э., Ефимов С.Н. Антимутагенные свойства растений рода хвощ // Фармация. 2005. №5. С. 31-32.

6. Коломиец Н.Э. Сравнительное химико-фармакологическое исследование растений рода Equisetum : автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Томск, 2003.

7. Сырчина А.И. Химическое исследование фенольных соединений хвоща полевого (Equisetum arvense L.) : автореф. дис. ... канд. хим. наук. Иркутск, 1981.

8. Veit M., Beckert C., Hohne C., Bauer K., Geiger H. Interspecific and intraspecific variation of phenolic in the genus Equisetum subgenus Equisetum // Phytochemystry. 1995. V. 38. N4. P. 881-891.

9. Клышев Л.К., Бандюкова В.А., Алюкина А.С. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования). Алма-Ата, 1978. 220 с.

10. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of Flavonoids. New York.: Springer-Verlag, 1970. 354 p.

11. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. М., 1989. 400 с.

12. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 174 с.

13. Андреева В.Ю., Калинкина Г.И. Химическое исследование надземной части манжетки обыкновенной // Химия растительного сырья. 2000. №2. С. 79-85.

14. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. М., 1964. 360 с.

15. Мышляева Л.В., Краснощеков В.В. Аналитическая химия кремния. М., 1972. 273 с.

16. Harborne J.B. Comparative biochemistry of the flavonoids. London ; New York, 1967. 383 p.

17. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов // Химия природных соединений. 1983. №1. С. 20-24.

18. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. Т. 1. Вып. 4. С. 591-597.

19. Veit M., Bauer K., Beckert C., Kast B., Geiger H., Czygan F.-C. Phenolic characters of British hybrid taxa in Equisetum subgenus equisetum // Biochemical Systematics and Ecology. 1995. V. 23. N1. P. 79-87.

Поступило в редакцию 23 февраля 2009 г.

После переработки 3 марта 2010 г.