CC BY
14
УДК 34.23.17 ГРНТИ 575.22
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕВИРЕМИЧЕСКОЙ ТРАНСМИССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МЕЖДУ КЛЕЩАМИ I. RICINUS
М.А. Хаснатинов1, A. Tuplin2, D.J. Gritsun3, M. Slovak4, M. Kazimirova4, M. Lickova4, S. Havlikova5, B. Klempa '6, M. Labuda5, E.A. Gould7, T.S. Gritsun3
1 ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Россия, 664003 г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16
2 School of Molecular and Cellular Biology and Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds, United Kingdom
3 Oxford Progress Ltd, Oxford, United Kingdom
4 Institute of Zoology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia
5 Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia
6 Charité School of Medicine, Institute of Virology, Berlin, Germany
7 Faculté de Médecine, UMR 190 "Emergence des Pathologies Virales" Aix Marseille Université, Marseille, France
Показано, что штаммы ВКЭ Васильченко (Vs) и Hypr обладают соответственно низкой и высокой эффективностью НВТ между клещами I. ricinus. По нуклеотидным последовательностям генома, эти штаммы относятся к разным субтипам ВКЭ. Штамм Vs принадлежит Сибирскому субтипу, который экологически связан с клещами I. persulcatus. Штамм Hypr относится к Европейскому субтипу, адаптированному к клещам I. ricinus. При этом, в культуре клеток млекопитающих (СПЭВ) Vs и Hypr вызывают слабое и сильное цитопатическое действие (ЦПД) соответственно. Для того чтобы установить молекулярные основы специфичности НВТ ВКЭ, с помощью методов обратной генетики, мы спроектировали ряд жизнеспособных химерных штаммов Vs / Hypr с взаимно замещенными генами. В культуре клеток СПЭВ не было обнаружено существенных различий в скорости репликации между ВКЭ дикого типа и химерными вирусами. Тем не менее, химерный штамм Vs [Hypr str] (содержащий структурные гены Hypr и неструктурные геномные области Vs) показал высокую эффективность НВТ между клещами I. Ricinus, в то время как его аналог Hypr [Vs str] оказался не способен к НВТ. Это показывает, что структурные белки вириона в значительной степени определяют эффективность передачи ВКЭ между клещами. В противоположность этому в культуре клеток, тяжесть ЦПД во многом определяется неструктурными областями генома ВКЭ. Химеры с неструктурными генами Hypr были более токсичным для клеток PS по сравнению с химерами на основе генома штамма Vs.
Ключевые слова: штаммы, вирусный клещевой энцефалит, методы обратной генетики, культура клеток.
COMPARATIVE EFFECTIVENESS RESEARCH OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS'S RECOMBINANT STRAIN TRANSMISSION AMONG TICKS I. RICINUS
M.A. Hasnatinov1, A. Tuplin2, D.J. Gritsun3, M. Slovak4, M. Kazimirova4, M. Lickova4,
S. Havlikova5, B. Klempa5'6, M. Labuda5, E.A. Gould7, T.S. Gritsun3
© М.А. Хаснатинов, A. Tuplin, D.J. Gritsun, M. Slovak, M. Kazimirova, M. Lickova, S. Havlikova, B. Klempa, M. Labuda, E.A. Gould, T.S. Gritsun, 2016_
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1 Federal State Budgetary Scientific Institution "Scientific Centre of Family and Human Reproduction Health Aspects "
Russia, 664003, Irkutsk, ul. Timiryazeva, 16
2 School of Molecular and Cellular Biology and Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds, United Kingdom
3 Oxford Progress Ltd, Oxford, United Kingdom
4 Institute of Zoology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia
5 Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia
6 Charité School of Medicine, Institute of Virology, Berlin, Germany
7 Faculté de Médecine, UMR 190 "Emergence des Pathologies Virales", Aix Marseille Université, Marseille, France
Here, using laboratory-bred I. ricinus ticks, we demonstrate low and high efficiency NVT for TBEV strains Va-silchenko (Vs) and Hypr, respectively. These strains share high sequence similarity but are classified as two TBEV subtypes. The Vs strain is a Siberian subtype, naturally associated with I. persulcatus ticks whilst the Hypr strain is a European subtype, transmitted by I. ricinus ticks. In mammalian cell culture (porcine kidney cell line PS), Vs and Hypr induce low and high cytopathic effects (cpe), respectively. Using reverse genetics, we engineered a range of viable Vs/Hypr chimaeric strains, with substituted genes. No significant differences in replication rate were detected between wild-type and chimaeric viruses in cell culture. However, the chimaeric strain Vs [Hypr str] (Hypr structural and Vs non-structural genomic regions) demonstrated high efficiency NVT in I. ricinus whereas the counterpart Hypr [Vs str] was not transmitted by NVT, indicating that the virion structural proteins largely determine TBEV NVT transmission efficiency between ticks. In contrast, in cell culture, extent of cpe was largely determined by the non-structural region of the TBEV genome. Chimaeras with Hypr non-structural genes were more cytotoxic for PS cells when compared with Vs genome-based chi-maeras.
Keywords: strains, tick-borne encephalitis virus, reverse genetics technic, cell culture
Клещевой энцефалит (КЭ) остается одной из наиболее опасных и широко распространенных природно-очаговых болезней в Российской Федерации. Возбудителем заболевания является вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), который относится к семейству Flaviviridae и передается человеку при укусах иксодовых клещей. В России ВКЭ вызывает до 10 тысяч случаев заболевания человека ежегодно [Злобин, 2005; Никитин, 2016].
В естественной среде ВКЭ существует за счет непрерывной передачи вируса между клещами рода Ixodes и их прокормителями. Обычно передача вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) незараженным клещам происходит при их кормлении на зараженных млекопитающих с выраженной виремией [Gritsun, 2003; Chunikhin, 1979; Radda, 1969]. Однако описан и альтернативный механизм передачи вируса от инфицированных клещей к неинфициро-ванным при совместном питании на авиреми-ческом хозяине. Этот механизм передачи определяется как невиремическая трансмиссия (НВТ) и является потенциально гораздо более эффективным, чем виремическая передача, поскольку он не требует развития виремии у хозяина, и вирус может передаваться непосредственно между клещами, даже когда жи-
вотное-прокормитель обладает иммунитетом к ВКЭ и неспособен поддерживать достаточный титр вируса в крови [Labuda, 1997].
В настоящее время выделяют три субтипа ВКЭ: Европейский (EU), Сибирский (SIB) и Дальневосточный (FE), которые генетически очень тесно связаны между собой (96 % аминокислотная схожесть) [Ecker, 1999]. В природе SIB-ВКЭ и FE-ВКЭ экологически связаны с таежным клещом I. persulcatus, в то время как ЕС-ВКЭ, как правило, ассоциируется с пастбищным клещом I. ricinus. SIB-ВКЭ и FE-ВКЭ являются преобладающими подтипами в Сибири и на Дальнем Востоке Азии, где превалирует I. persulcatus, в то время как I. ricinus - единственный вид клещей в Западной Европе, который признается в качестве важного вектора EU-ВКЭ. Генетическая адаптация ВКЭ к этим двум видам клещей подтверждается филогенетическими методами [Dzhivanian, 1974; Gaunt, 2001].
В ходе предварительных исследований, нами было установлено, что штаммы SIB-ВКЭ Васильченко (Vs) и EU-ВКЭ Hypr обладают соответственно низкой и высокой эффективностью НВТ между клещами I. ricinus. Это предполагает существование потенциального «барьера передачи» специфического для
конкретных подтипов ВКЭ. Для того чтобы определить механизм подобной специфичности беспозвоночного хозяина, мы разработали ряд химерных вирусов с различными комбинациями генов Vs и Hypr и сравнили их свойства как в культуре клеток млекопитающих, так и в экспериментах по невиремической трансмиссии между клещами I. ricinus.
Эффективность невиремической трансмиссии (ЭТ) рассчитывали как долю зараженных нимф после совместного питания 15 неза-раженных нимф и 2 инфицированных ВКЭ самок I. ricinus. В нашем исследовании наблюдались высокодостоверные различия (p <0,01) в ЭТ между контрольными штаммами Hypr IC (62,5 %) и Vs IC (13 %), что соответствовало ранее наблюдаемым различиям в ЭТ штаммов Vs и Hypr дикого типа.
Наиболее замечательным результатом оказалась повышенная до 84 % ЭТ рекомби-нантного ВКЭ Vs [Hypr str]. Этот показатель был существенно выше, чем ЭТ любого другого ВКЭ в нашем наборе, включая контрольный ЗЕ ВКЭ Hypr IC. Характерно, что комплементарный штамм Hypr [Vs str] полностью потерял способность передаваться между клещами I. ricinus. Очевидно, что эффективная несистемная трансмиссия ВКЭ между клещами I. ricinus полностью определяется свойствами структурных белков С, prM и E.
На следующем этапе мы проверили ЭТ рекомбинантных ВКЭ, с замены генов Е и prM-E, чтобы оценить вклад каждого структурного гена в обеспечение эффективной циркуляции ВКЭ между клещами. При замене гена Е у Hypr IC гомологичным геном Vs IC происходит существенное снижение ЭТ с 62,5 до 7 % (Hypr [Vs E]), что указывает на критическую роль оболочечного белка Е в адаптации ВКЭ к передаче между клещами I. ricinus. Замена prM-E на неспецифичный фрагмент также привела к снижению ЭТ, хотя и в гораздо меньших масштабах - до 47 %. Вероятнее всего, это обусловлено биологической ролью белка prM. Он является шапероном для корректного складывания белка Е внутри клетки хозяина и обеспечивает эффективное формирование оболочки вириона [Stadler, 1997]. Наличие соответствующих друг другу белков prM и Е может существенно увеличить эффективность репликации вируса даже в том случае, если эти белки не оптимально адаптированы к организму клеща-хозяина.
Рекомбинантные СИБ ВКЭ на основе генома Vs IC и содержащие ген Е (Vs [Hypr E]) или prM-E (Vs [Hypr prM-E]) от EU-ВКЭ передавались между клещами I. ricinus существенно лучше, чем родительский вирус Vs IC. И хотя отличия не были столь значительны, как при модификации Hypr IC отдельными структурными генами Vs IC, они были высоко достоверны.
В совокупности полученные данные доказывают регуляторную роль белка Е в процессе НВТ ВКЭ между клещами I. ricinus. Однако необходимо отметить, что как активирующий, так и подавляющий эффект белка Е, изолированного или в сопровождении prM, не сравним по масштабу с изменениями, вызываемыми заменой комплекса структурных генов целиком. Так, совокупное увеличение ЭТ, вызванное заменой Е и prM в Vs IC на гомологичные гены Hypr IC, составило порядка 10 %, тогда как замена фрагмента генома 5'НТР-С^гМ-Е привела приблизительно к 80 %-ному увеличению способности Vs IC циркулировать среди клещей I. ricinus. Можно сделать вывод, что либо фрагмент 5'НТР-С обеспечивает какой-то критический этап неви-ремической передачи ВКЭ, либо для эффективной трансмиссии необходима структурная целостность вириона, состоящего из максимально адаптированных к организму клеща элементов - белков С, М и Е.
В итоге установлено, что устойчивая не-виремическая трансмиссия ВКЭ возможна только при точном соответствии целого региона генома, кодирующего 5' нетранслируемый регион, капсидный белок С, мембранный белок prM и оболочечный белок Е, специфичному виду клеща. Нарушение целостности этого региона приводит к драматическому падению эффективности трансмиссии, а его полная замена на неспецифичный фрагмент генома полностью блокирует передачу ВКЭ между зараженными и незараженными клещами. При этом вирулентность ВКЭ для клеток млекопитающих определяется свойствами неструктурных генов вируса. На наш взгляд, искусственное снижение специфичности взаимодействия поверхностных белков ВКЭ с клетками хозяина в естественных популяциях клещей могло бы нарушить процесс невиремической трансмиссии клещевых микроорганизмов и привести к снижению зараженности клещей ВКЭ в природе.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
REFERENCES
1. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики // Вопросы вирусологии. 2005. Т. 50. № 3. С. 26-31.
2.Никитин А.Я., Носков А.К., Андаев Е.И. и др. Эпидемиологическая ситуация по клещевому вирусному энцефалиту в Российской Федерации в 2015 г. и прогноз на 2016 г. // Пробл. особо опасных инф. 2016; 1:40-43.
1. Zlobin V.I. Kleshchevoj entsefalit v Ros-siyskoy Federatsii: sovremennoe sostoyanie problemy i strategiya profilaktiki // Voprosy virusologii. 2005. T. 50. № 3. S. 26-31.
2. Nikitin A.Ya., Noskov A.K., Andaev E.I. i dr. Epidemiologicheskaya situatsiya po kleschevomu virus-nomu encefalitu v Rossiyskoy Federatsii v 2015 g. i prognoz na 2016 g. // Probl. osobo opasnyh inf. 2016; 1:40-43.
3.Chunikhin S.P., Kurenkov V.B. et al. Viraemia in Clethrionomys glareolus - a new ecological marker of tick-borne encephalitis virus // Acta Virol. 1979; 23 (3): 257-260.
4. Dzhivanian T.I., Lashkevich V.A., Bannova G.G. et al. On the possible association of the DS marker of tick-borne encephalitis virus strains with species of tick vectors // Arch Ges Virusforsch. 1974; 45:209-214
5. Ecker M., Allison S.L., Meixner T. et al. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol. 1999; 80: 179-185.
6. Gaunt M.W., Sall A.A., X. de Lamballerie et al. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography // J Gen Virol. 2001; 82: 1867-1876.
7. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. et al. Tick-borne encephalitis // Antiviral Res. 2003; 57 (1-2):129-146.
8. Labuda M., Kozuch O., Zuffova E. et al. Tick-borne encephalitis virus transmission between ticks cofeed-ing on specific immune natural rodent hosts // Virology. 1997; 235(1): 138-143.
9. Radda A., Hofmann H., Pretzmann G. et al. Threshold of viraemia in Apodemus flavicollis for infection of Ixodes ricinus with tick-borne encephalitis virus // Acta Virol. 1969; 13 (1): 74-77.
10.Stadler K., Allison S., Schalich J. et al. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by furin // Journal of virology, Nov. 1997. P. 8475-8481.
Хаснатинов Максим Анатольевич - канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»; (khasnatinov@yandex.ru).
Hasnatinov Maksim Anatol'evich - Cand. Sc. {Biology}, Senior Research Scientist of the Arthropod-borne Infection Laboratory at Federal State Budgetary Scientific Institution "Scientific Centre of Family and Human Reproduction Health Aspects"; (khasnatinov@yandex.ru).
Andrew Tuplin, School of Molecular and Cellular Biology and Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds, United Kingdom (a.k.tuplin@leeds.ac.uk) Dmitri J. Gritsun, Oxford Progress Ltd, Oxford, United Kingdom (dm79grit@gmail.com) Mirko Slovak, Institute of Zoology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia (slo-vak.mirko@gmail.com)
Maria Kazimirova, Institute of Zoology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia (uzaemkaz@savba. sk)
Martina Lickova, Institute of Zoology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia (Marti-na.Lickova@savba.sk)
Sabina Havlikova, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia (sabina.havlikova@gmail.com)
Boris Klempa, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia; Charité School of Medicine, Institute of Virology, Berlin, Germany (burkosilo@gmail.com)
Milan Labuda, Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia Ernest A. Gould, Faculté de Médecine, UMR 190 "Emergence des Pathologies Virales", Aix Marseille Université, Marseille, France (eagvirology@gmail.com)
Tamara S. Gritsun, Oxford Progress Ltd, Oxford, United Kingdom.
