CC BY
25
© Н.Н.Петрищев, А.В.Смирнов, Т.А.Барабанова, А.А.Жлоба, С.Г.Чефу, 2007 УДК 616.61-008.64-036.92:616.149]:615.849.19+577.17-092.4
Н.Н. Петрищев, А.В. Смирное, Т.А. Барабанова, А.А. Жлоба, С.Г. Чефу
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ He-Ne ЛАЗЕРА И L-АРГИНИНА НА ГЛАДКОМЫШЕЧНЫЕ КЛЕТКИ ВОРОТНОЙ ВЕНЫ И МИОКАРД КРЫС С ХПН
N.N. Petrishchev, A.V. Smirnov, T.A. Barabanova, A.A. Zhloba, S.G. Chefu
COMPARATIVE INVESTIGATION OF THE INFLUENCE OF HE-NE LASER AND L-ARGININE ON THE SMOOTH MUSCLE CELLS OF THE PORTAL VEIN AND MYOCARDIUM OF RATS WITH CRF
Центр лазерной медицины, кафедра патофизиологии, научно-исследовательский институт нефрологии и сектор биохимии научно-исследовательского центра Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, лаборатория клинической и экспериментальной кардиологии Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - сравнительное исследование влияния низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с длиной волны 632,8 нм и L-аргинина одновременно на механическую активность кардиомиоцитов и сократимость гладкомышечных клеток (ГМК) воротной вены у крыс линии Вистар с экспериментальной хронической почечной недостаточностью (ХПН при уровне мочевины крови 13,8±3,1 ммоль/л). МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Исследовали влияние НИЛИ и L-аргинина на ГМК воротной вены и кардиомиоциты крыс Вистар с ХПН (резекция 5/6 почечной массы). Механическую активность папиллярной мышцы сердца и сократительную активность воротной вены регистрировали в изометрическом режиме. РЕЗУЛЬТАТЫ. Результаты исследования показали, что лазерное облучение и L-аргинин (1,15 ммоль/л) (при любой последовательности воздействия) вызывают дополнительную релаксацию воротной вены контрольных крыс, но не влияют на тонус вены крыс с ХПН, что свидетельствует о снижении активности NO-синтазы в эндотелии воротной вены у крыс с ХПН. Под влиянием НИЛИ и L-аргинина наблюдалось практически полное восстановление механической активности миокарда крыс с ХПН до уровня интактных животных, что свидетельствует о возможности дополнительного синтеза NO в миокарде при увеличении содержания субстрата в инкубационной среде. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Результаты сравнительного исследования действия НИЛИ и L-аргинина на миокард и ГМК воротной вены одних и тех же крыс с ХПН-1 показали, что, в отличие от миокарда, эффект НИЛИ и L-аргинина на ГМК воротной вены определяется состоянием сосудистого эндотелия: степенью нарушения обмена L-аргинина и активностью NOS.
Ключевые слова: миокард, механическая активность, гладкомышечные клетки воротной вены, авторитмическая сократительная активность, хроническая почечная недостаточность, низкоинтенсивное лазерное излучение, L-аргинин.
ABSTRACT
THE AIM of the investigation was to compare effects of low-intensity laser radiation (LILR) with wave length 632.8 nm and L-arginine simultaneously on mechanical activity of cardiomyocytes and contractility of smooth muscle cells (SMC) of the portal vein in Wistar rats with experimental chronic renal failure (CRF with the level of blood urea 13.8±3.1 mmol/l). MATERIAL AND METHODS. Effects of LILR and L-arginine on SMC of the portal vein and cardiomyocytes of Wistar rats with CRF (resection of 5/ 6 of kidney mass) were investigated. Mechanical activity of the heart papillary muscle and contractile activity of the portal vein were registered in isometric regimen. RESULTS. It was shown that laser irradiation and L-arginine (1.15 mmol/l) (in any succession of exposures) caused additional relaxation of the portal vein of control rats, but failed to influence the vein tone of rats with CRF that is evidence of lower activity of NO-synthase in the portal vein endothelium of rats with CRF. Effects of LILR and L-arginine were followed by practically complete recovery of mechanical activity of the myocardium in CRF rats up to the level of intact animals that suggests a possibility of additional synthesis of NO in the myocardium with increased content of the substrate in the incubation medium. CONCLUSION. The results of the comparative investigation of effects of LILR and L-arinine on the myocardium and SMC of the portal vein of the same rats with CRF-1 have shown that, as distinct from myocardium, the effect of LILR and L-arginine on SMC of the portal vein depends on the state of the vascular epithelium: the degree of disturbance of L-arginine metabolism and activity of NOS.
Key words: myocardium, mechanical activity, smooth muscle cells of the portal vein, autorhythmical contractile activity, chronic renal failure, low intensity laser radiation, L-arginine.
ВВЕДЕНИЕ
Нарушение синтеза NO играет ключевую роль в комплексе гемодинамических нарушений, связанных с прогрессированием почечной недостаточности. Длительное угнетение NO-синтазы (NOS)
является одной из причин сердечно-сосудистых нарушений при уремии [1].
У крыс Вистар при удалении 5/6 почечной паренхимы (хирургическая модель хронической почечной недостаточности) снижается общая про-
дукция N0 [2], повышается артериальное давление, отмечается гиперактивность ГМК воротной вены [3,4] и увеличивается количество циркулирующих в крови эндотелиоцитов [5]. Механическая активность миокарда при этом меняется двухфазно: гиперактивность миокарда сменяется подавлением его сократимости и нарушением связи частота-сила [6].
Получен ряд данных об участии системы N0-цГМФ в механизме действия Не-№ излучения [7,8]. Так, ранее нами было показано, что блока-тор N0-синтазы L-NNA т укго не изменяет установившуюся авторитмическую сократительную активность ГМК воротной вены, но препятствует проявлению эффекта лазерного облучения (как на релаксацию сосудистой стенки, так и на рост амплитуды фазно-тонических сокращений) [9].
Система N0-цГМФ играет важную роль в защите клеток, в том числе ишемизированного миокарда, от избытка Са2+, [10,11]. В нормальных условиях основной мишенью N0 является растворимая гуанилатциклаза. Эффект цГМФ и цГМФ-зависимых протеинкиназ реализуется в ак-тивациии Са2+-АТФазы плазматических мембран (ПМ) и саркоплазматического ретикулума (СР) [12,13], гиперполяризации ПМ в результате увеличения калиевой проводимости и снижении при этом входа ионов кальция по потенциалзависимым L-каналам.
При лечении сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время все чаще используется L-аргинин [14,15,16]. Поэтому понятен интерес к исследованию роли дополнительного количества L-аргинина (субстрата для синтеза N0) в эффектах лазерного облучения миокарда и воротной вены у крыс с приобретенной дисфункцией эндотелия. Интерес этот обусловлен также фактом повышения концентрации L-аргинина в крови животных на раннем этапе развития уремии [17], когда уже отмечается дефицит N0 и увеличение количества циркулирующих десквамированных эндотелиоци-тов, свидетельствующее о повреждении эндотелия.
Учитывая вышеизложенное, бесспорный интерес представляет сравнительное исследование действия НИЛИ на сосудистые гладкомышечные клетки (ГМК) и миокард крыс Вистар при сохранении нормальной функции эндотелия и при нарушении обмена аргинина и синтеза N0 у крыс с нефрэктомией.
Поэтому целью данной работы стало сравнительное исследование роли N0-синтазной системы в механизме действия гелий-неонового лазера и L-аргинина на сократительную активность сосудистой стенки воротной вены и миокард крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования выполнялись на фрагментах воротной вены и папиллярнызх мышцах сердца крыс-самцов линии Вистар (РАН, питомник лабораторных животных Института физиологии им. И.П. Павлова, Колтуши). Животные содержались при неограниченном потреблении корма (стандартный рацион для лабораторных крыс) и воды. Возраст крыс с ХПН на момент проведения опытов на воротной вене 18 недель.
В качестве модели приобретенного нарушения синтеза NO использованы крысы с хронической почечной недостаточностью (ХПН) - резекция 5/6 массы почечной ткани [18,19]. У этих животных нарушена функция NOS и снижена продукция NO в органах и тканях [2]. Контролем служили лож-нооперированные животные.
Биохимические анализы крови (содержание мочевины и креатинина) и мочи (содержание альбумина и креатинина) выполнены на биохимическом анализаторе COBAS MIRA. L-аргинин сыворотки определяли спектрофотометрическим методом Сакагучи (спектрофотометр СФ-4 ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия).
Регистрация сократительной активности воротной вены производилась в изометрическом режиме с помощью механоэлектрического преобразователя 6 МХ1С [20]. Описание деталей эксперимента дано ранее [9].
Измерение кровяного давления осуществлялось непрямым фотоэлектрическим методом. Для оценки повреждения эндотелия был использован метод определения количества циркулирующих эндотелиоцитов [21,22].
Механическую активность папиллярной мышцы исследовали в изометрическом режиме. В качестве измеряемых параметров служили: максимум силы изометрических сокращений (Ро), характерное время расслабления t30 [23].
В качестве блокатора синтеза монооксида азота использовали ^нитро^-аргинин (L-NNA) в концентрации 9,1 ммоль/л (ICN Biomedicals, Inc.).
L-аргинин (ICN Biomedicals, Inc.) добавляли в перфузионный раствор в концентрации 1,15 ммоль/л.
Источник лазерного излучения - ШАТЛ-Ком-би (He-Ne канал - 632,8 нм); плотность мощности 15 мВ^м2, экспозиция 3 минуты для воротной вены и 5 минут для папиллярной мышцы; плотность мощности 15 мВт^м2. Луч направлялся на фрагмент сосуда и папиллярную мышцу с расстояния 10 мм.
Статистическая обработка выполнена с использованием пакета многомерного статистического анализа и программы обработки электронных
мН
0,1
0 -0,1 -0,2 -0,3 -0,4 -0,5 -0,6
таблиц Microsoft Excel 7.0 for Windows 95 с применением критериев Стьюдента и Уилкоксона. Все величины, указанные в работе, представлены как средние значения ± среднее квадратичное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Через 1 месяц после второго этапа операции у крыс с нефрэктомией констатирована уремия I степени (13,8±3,1 ммоль/л, р<0,01 по сравнению с контролем) (ХПН-1). Артериальное давление (АД) у крыс с ХПН достигало 135,0±11,3 мм рт. ст. (в контроле - 105,2±9,4) (р<0,01). В контроле количество циркулирующих эндотелиоцитов составляло 3,2±0,8х104/л, а у животных с ХПН - 7,1±1,9х104/л (р<0,01).
Содержание в плазме крови L-аргинина у крыс с ХПН было на 40 % выше, чем в контроле (132,5±8,2 мкмоль/л и 94,3±2,5 мкмоль/л соответственно, р<0,01).
Влияние L-аргинина и НИЛИ на авторитмическую сократительную активность воротной вены контрольных крыс и крыс с ХПН.
Исходные показатели авторитмической сократительной активности ГМК воротной вены крыс с ХПН превышали контрольные значения. Так, суммарная амплитуда фазно-тонических сокращений и выполняемая веной работа у крыс с ХПН были выше в 1,5 раза (р<0,01) (табл. 1).
При добавлении L-аргинина (1,15 ммоль/л) (примерно в 10 раз более высокая концентрация, чем в плазме крови) в среду переживания фрагментов воротной вены контрольных крыс наблюдалась выраженная релаксация сосудистого препарата. К 10-й минуте инкубации снижение базального тонуса достигло 0,224±0,088 мН от исходного уровня (р<0,01). Значимых изменений функциональной активности ГМК воротной вены отмечено не было.
На фоне 10-минутного действия L-аргинина проводили 3-минутное облучение воротной вены He-Ne лазером (8 опытов). Во всех опытах в период облучения наблюдалась тенденция к допол-
Таблица 1
Показатели авторитмической сократительной активности ГМК воротной вены контрольных крыс и крыс с ХПН (Х±m)
L-apr 2 мин
Время опыта
Ьарг 25
Ь-аргЮ облучение мин (без
мин Змин ПРПЮмин облучения)
т I-Ï- <4.
Л- f ' ^ 1
1 * ■■
* * L
*
□ Контроль
■ ХПН
Рис. 1. Влияние 1_-аргинина (1,15 ммоль/л) и 3-минутного лазерного облучения (632,8 нм, 15 мВт/см2) на базальный тонус воротной вены контрольных крыс и крыс с ХПН. По оси ординат - изменение базального тонуса от исходного уровня (последняя минута перед добавлением _-аргинина в среду переживания препарата) в мН. * - р < 0,01 по сравнению с исходным уровнем.
мН
0,1
-0,1 -0,2 -0,3 -0,4
-0,5 -0,6
Время опыта
облучение ПРП10 Ь-аргЮ ПРП 20
3 мин мин Ьарг 2 мин мин мин
□ Контроль
1ХПН
Рис. 2. Влияние 3-минутного лазерного облучения (632,8 нм, 15 мВт/см2) и _-аргинина (1,15 ммоль/л) на базальный тонус воротной вены контрольных крыс и крыс с ХПН. По оси ординат - изменение базального тонуса от исходного уровня (последняя минута перед началом облучения) в мН.
* - р < 0,01 по сравнению с исходным уровнем.
Параметры Группа животных
контроль (n=16) ХПН-I (n=16)
Частота сокращений за 1 минуту Средние значения амплитуды фазно-тонических сокращений, мН Выполняемая воротной веной работа, условные единицы 14,0±2,3 0,912±0,166 44,8±8,6 15,5±3,6 1,340±0,112 * 68,7±13,3 *
Различия достоверны по сравнению с контролем: * - р < 0,01
иительиой релаксации. В пострадиационный период снижение тонуса продолжалось и на 10-й минуте достигало 0,157±0,066 мН по сравнению с последней минутой до начала облучения (p<0,01). Таким образом, суммарное снижение тонуса воротной вены к концу опыта составило 0,381±0,086 мН. Без облучения (8 опытов) тонус сосуда к этому времени оставался на достигнутом к 10-й минуте инкубации с L-аргинином уровне (рис. 1).
В следующей серии опытов (8 животных) L-аргинин в вышеуказанной концентрации добавляли в среду переживания препарата воротной вены контрольных крыс на 11-й минуте пострадиационного периода после 3-минутного лазерного облучения. В данной серии опытов базальный тонус на 10-й минуте пострадиационного перио-
да был на 0,302±0,092 мН ниже исходного (р<0,01). С первых минут после добавления Ь-аргинина наблюдалась дополнительная релаксация, на 10-й минуте достигавшая 0,114±0,042 мг по сравнению с 10-й минутой пострадиационного периода (р<0,01). В данной серии опытов суммарное снижение тонуса воротной вены к концу опыта составило 0,416±0,093 мН (рис. 2).
Таким образом, низкоинтенсивное лазерное облучение с длиной волны 632,8 нм и добавление субстрата для синтеза N0 дополняли релаксиру-ющий эффект друг друга (рис. 1 и 2).
Ь-аргинин никоим образом не влиял ни на ба-зальный тонус воротной вены крыс с ХПН, ни на частоту и амплитуду сокращений (8 опытов). Трехминутное лазерное облучение, проведенное на препаратах воротной вены крыс с ХПН после 10 минут инкубации с Ь-аргинином, также не оказывало действия ни на базальный тонус (рис. 1), ни на характер фазно-тонических сокращений. В пострадиационный период изменений авторитмической сократительной активности воротной вены также не наблюдалось.
В следующей серии (8 опытов), как и в контроле, Ь-аргинин добавляли в среду переживания препарата воротной вены крыс с ХПН после лазерного облучения. У крыс с ХПН лазерное облучение не изменяло тонус воротной вены ни в период облучения, ни в пострадиационный период. Добавление в перфузионный раствор Ь-аргинина 11-й минуте пострадиационного периода после 3-минутного лазерного облучения также не приводило к изменениям базального тонуса ГМК воротной вены (рис. 2). Характер фазно-тонических сокращений в данных сериях опытов не изменялся.
Таким образом, добавление в инкубационный раствор дополнительного субстрата для синтеза N0 не влияло ни на базальный тонус и характер фазно-тонических сокращений воротной вены крыс с редукцией массы функционирующих нефронов, ни на способность сосудистых ГМК реагировать на низкоинтенсивное лазерное излучение с длиной волны 632,8 нм.
Влияние Ь-аргинина, Ь-ИИЛ и НИЛИ на механическую активность миокарда контрольных крыс и крыгс с ХПН.
При добавлении Ь-аргинина в перфузионный раствор (8 опытов) сила изометрических сокращений и скорость расслабления кардиомиоцитов контрольных крыс к 10-й минуте инкубации увеличивалась в среднем на 49,0±5,2 % и 10,0±2,9 % соответственно. После 10-минутной инкубации папиллярной мышцы в растворе с Ь-аргинином проводили лазерное облучение. Во всех опытах в пе-
Рис. 3 А
%
200
150 100 50
Рис. 3 Б
Рис. 3. Влияние 5-минутного лазерного облучения (632,8 нм, 15 мВт/см2) на силу изометрических сокращений папиллярной мышцы миокарда крыс на фоне действия _-ар-гинина (0,2 мг/мл) в % к исходному уровню: А - Контрольные животные; Б - Крысы с ХПН; 1 - 10 мин действия _-аргини-на; 2 - 5 мин действия лазерного облучения; 3 - 10 мин пострадиационного периода; 4 - 15 мин пострадиационного периода; * - р < 0,01 по сравнению с исходным уровнем.
риод 5-минутного облучения Не-№ лазером не наблюдалось дополнительных сдвигов регистрируемых параметров. В пострадиационном периоде отмечалось постепенное увеличение силы изометрического сокращения и скорости расслабления, которое достигало максимума на 10-й минуте и составляло 55,6±4,9 % и 15,0±2,6 % соответственно (рис. 3 А). Таким образом, эффекты действия Ь-аргинина и НИЛИ суммировались.
В следующей серии (8 опытов) Ь-аргинин добавляли в перфузионный раствор на 11-16 минутах пострадиационного периода после 5- минутного облучения. К этому времени проявлялся эффект действия НИЛИ. На фоне устойчивого увеличения силы изометрического сокращения и скорости расслабления Ь-аргинин в первые 5 минут перфузии не оказывал видимого действия на регистрируемые параметры, но к 10-й минуте перфузии отмечалось дополнительное увеличение амплитуды в среднем на 24,7±3,2 %. Скорость расслабления при этом не изменялась. Общий прирост амплитуды составлял 60,3±4,2 % (рис. 3 Б).
Таким образом, действие НИЛИ и Ь-аргинина
Таблица 2
Влияние L-NNA и лазерного облучения (632,8 нм, 15 мВт/см2) на механическую активность папиллярной мышцы миокарда
контрольных крыс (за 100 % приняты исходные значения до добавления в среду переживания препарата L-NNA) (Х±m)
Показатели _-ЫЫА Облучение Пострадиационный
(10-я мин) (5-я мин) период (10-я мин)
Сила изометрических сокращений, % 93,8±1,7 94,2±2,3 96,2±2,6
Время достижения максимума, % 92,5±3,4 93,2±3,1 95,9±3,5
было однонаправленным и суммарный эффект не зависел от последовательности их влияния и составлял в среднем 57,8±5,1 %. Дополнительное введение субстрата для синтеза N0 в перфузион-ный раствор усиливало эффект действия НИЛИ на механическую активность миокарда контрольных крыс.
У крыс с экспериментальной ХПН (8 опытов) регистрировалось снижение силы изометрических сокращений и скорости расслабления по сравнению с контрольными животными. Действие Ь-ар-гинина на силу изометрических сокращений крыс
/
X
X * У * У
/ *
У п
У
- - / /
60 50 40 30 20 10 0
Рис. 4 А
1
%
200
'И
150
100
50
5пШ
Рис. 4 Б
Рис. 4. Влияние Ьаргинина на фоне выраженного действия НИЛИ на силу изометрических сокращений папиллярной мышцы миокарда крыс. А - Контрольные животные; Б -Крысы с ХПН; 1 - 5 мин действия лазерного облучения; 2 -10 мин пострадиационного периода; 3 - 5 мин действия _-аргинина; 4 - 10 мин действия _-аргинина; * - р < 0,01 по сравнению с исходным уровнем.
с ХПН и контрольных животных было однонаправленным. Однако количественная выраженность эффекта у крыс с ХПН была значительно выше. Сила сокращений миокарда крыс с ХПН под влиянием Ь-аргинина приближалась к значениям контрольных животных (рис. 4 А). Скорость изометрических сокращений увеличивалась незначительно: 1 уменьшалась на 8 - 12 %.
Действие НИЛИ на миокард крыс с ХПН на фоне выраженного эффекта Ь-аргинина было однонаправленным и усиливало эффект последнего. Однако в 5-минутный период непосредственного облучения дополнительного роста силы изометрических сокращений не наблюдалось, а в пострадиационном периоде отмечалось резкое повышение сократимости - сила сокращений увеличивалась в 2,5 - 3 раза (рис. 4 А). Скорость расслабления при этом изменялась незначительно, 1 снижалась лишь на 15,2±3,2 %.
Суммарный эффект Ь-аргинина и НИЛИ на миокард крыс с ХПН превышал эффект действия на миокард контрольных крыс в 2 - 2,5 раза. Таким образом, добавление субстрата для синтеза N0 в перфузионный раствор усиливало действие НИЛИ на миокард крыс с ХПН и приводило к полному восстановлению патологически низкой механической активности миокарда этих животных до уровня контрольных крыс через 10 минут после прекращения облучения. Дальнейшее наблюдение показало, что через 15-20 минут после прекращения облучения Р0 достигало еще больших величин, свидетельствующих о гиперактивности миокарда.
У контрольных крыс и крыс с ХПН при действии НИЛИ без добавления Ь-аргинина к 10-й минуте пострадиационого периода прекращался рост силы изометрического сокращения и Р0 не изменялось в течение последующих 10-20 минут наблюдения. На фоне Ь-аргинина пострадиационный период изменений механической активности миокарда крыс с ХПН удлинялся до 25-30 минут.
В следующей серии (8 опытов) последовательность действия Ь-аргинина и НИЛИ была изменена. Ь-аргинин вводился в перфузионный раствор после 10-15-минутного пострадиационного периода, то есть когда прекращались изменения силы и скорости расслабления миокарда крыс с ХПН. НИЛИ оказывало обычное действие: увеличение силы сокращения и незначительное повышение скорости расслабления. Максимальный эффект действия Ь-аргинина на силу изометрических со-
кращений регистрировался только к 10-й минуте перфузии и увеличение Р0 составляло в среднем 59,7±5,6 % по сравнению с исходным уровнем (1015 минутный пострадиационный период - рис. 4 Б). Следующие 15 - 20 минут амплитуда изометрических сокращений не изменялась. Скорость расслабления увеличивалась за весь период наблюдения на 15,4±2,9 %. Таким образом, как и в предыдущей серии исследований, Ь-аргинин и НИЛИ дополняли эффект один другого. Суммарный эффект их действия не зависел от последовательности влияния на миокард. НИЛИ приводило к практически полному восстановлению механической активности миокарда крыс с ХПН при мочевине крови 13,8±3,1 моль/л. Добавление Ь-аргинина усиливало механическую активность миокарда и формировало адаптивную гиперактивность. Скорость расслабления при гиперактивности не изменялась. Подводя итог исследованию роли субстрата для синтеза N0 в действии НИЛИ на миокард крыс с ХПН следует отметить, что Ь-аргинин вызывал рост продолжительности действия НИЛИ и увеличение количественной выраженности эффекта.
При добавлении блокатора N0-синтазы L-NNA в перфузионный раствор наблюдалось незначительное снижение силы изометрических сокращений миокарда контрольных крыс (8 опытов). Облучение Не-Ые лазером на фоне действия L-NNA не оказывало никакого влияния на параметры механической активности миокарда (табл. 2), как и в наших предыдущих опытах на воротной вене [9].
ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ результатов исследования суммарного эффекта действия Ь-аргинина и НИЛИ на активность воротной вены и миокарда крыс с ХПН свидетельствует об исключительной роли эндотелия в действии этих факторов на сосудистые ГМК. Нарушение функции эндотелия, приводящее к снижению образования N0, не компенсируется добавлением субстрата для его синтеза: ни Ь-аргинин, ни НИЛИ при его высокой концентрации в перфу-зионном растворе не вызывают снижение тонуса воротной вены крыс с ХПН, в отличие от контрольных животных.
Мы полагаем, что отсутствие релаксации фрагментов воротной вены крыс с экспериментальной уремией при действии НИЛИ связано с неспособностью эндотелиоцитов вырабатывать достаточное для этого количество N0. Это предположение основано на том, что хирургическая модель ХПН одновременно является и моделью системной дисфункции эндотелия [24]. О системном повреждении эндотелия у наших крыс с ХПН свидетельству-
ет повышение числа циркулирующих в крови дес-квамированных эндотелиоцитов.
N0 играет важную роль в механизме гемоди-намических нарушений, связанных с почечной патологией [25,26]. В наших опытах мы наблюдали у крыс с ХПН рост АД и одновременно - повышенную концентрацию аргинина в плазме крови. Накопление аргинина в плазме при хирургической модели ХПН связывают с нарушением его метаболизма [17].
Основной путь утилизации аргинина - орнити-новый цикл Кребса. Второй по значимости путь утилизации аргинина заключается в превращении последнего в цитруллин. В случае торможения ор-нитинового цикла следует ожидать увеличения утилизации аргинина с генерацией цитруллина в N0-синтазной реакции. У крыс после резекции 5/6 почечной массы снижается экспрессия всех изоформ N0-синтазы и выработка N0 [1,2], но повышается содержание цитруллина в плазме [17]. В таком случае, если различные виды N0-синтазной активности не повышены, другим логичным объяснением накопления цитруллина может быть угнетение метаболической функции почки. Как известно, регенерация аргинина из цитрулина происходит именно в почках [27].
Снижение синтеза аргинина в почках при прогрессивном снижении их метаболической функции может быть компенсировано снижением превращения аргинина в орнитин аргиназой, которая в изобилии присутствует в почках [27]. Гипертрофия проксимальных канальцев оставшихся нефронов увеличивает их аргинин-синтазную емкость, гиперфильтрация увеличивает порцию проходящего через них цитруллина и повышенная концентрация цитруллина в плазме способствует сохранению почечного синтеза аргинина [17]. Кроме того, повышение концентрации мочевины в крови у крыс с нефрэктомией и по принципу обратной связи может подавлять превращение Ь-аргинина в печени в орнитиновом цикле [28].
Все вышесказанное позволяет объяснить повышенную концентрацию Ь-аргинина в плазме крови у крыс с нефрэктомией в наших опытах. Таким образом, дефицита субстрата для eN0S у этих крыс не было. Инкубация фрагментов воротной вены нефрэктомированных животных с Ь-аргини-ном не сопровождалась релаксацией или восстановлением чувствительности к действию НИЛИ. Следовательно использование Ь-аргинина для синтеза N0 в воротной вене было резко ограничено.
Иначе ведет себя миокард этих животных. Добавление Ь-аргинина приводило к значительному увеличению силы изометрических сокращений
и незначительному росту скорости расслабления, что свидетельствует о восстановлении механической активности патологически измененного миокарда крыс с ХПН, характеризующихся нарушением функции эндотелия сосудов, а следовательно, синтеза NO. Создается впечатление, что повреждение эндотелия, как и патологическое снижение механической активности миокарда у крыс с ХПН, не влияет на характер ответа на L-аргинин и НИЛИ. Более того, действие НИЛИ на миокард этих животных превышает его эффект, зарегистрированный у контрольных крыс. Мы полагаем, что восстановление патологически измененной механической активности миокарда крыс с ХПН под влиянием L-аргинин и НИЛИ обусловлено наличием эндокардиальных клеток и ростом уровня L-аргинина в крови животных на ранних стадиях развития ХПН. В миокарде, видимо, L-аргинин используется для синтеза NO эндокардиальными клетками [29]. В ряде работ отмечено положительное инотропное действие NO и влияние на процессы расслабления. Эндогенный NO повышает сократимость миокарда только в низких концентрациях, что, видимо, имеет место при действии НИЛИ и L-аргинина в исследуемых концентрациях [30,31].
Таким образом, реакция миокардиальных клеток и ГМК на НИЛИ и L-аргинин у одних и тех же крыс не совпадает. Гиперактивность сосудистых ГМК у крыс с ХПН-1 регистрируется наряду со снижением механической активности миокарда. Снижение сократимости кардиомиоцитов у экспериментальных животных естественно рассматривается как переход во вторую фазу функциональных изменений, характерных для развития ХПН-II. Однако факт практически полного восстановления функции миокарда до уровня интактных животных под влиянием НИЛИ и L-аргинина свидетельствует о возможности дополнительного синтеза NO в миокарде при 10-кратном увеличении содержания субстрата в инкубационной среде при данном уровне мочевины у крыс с экспериментальной ХНП. Очевидно, что в этот период развития ХПН активно функционируют эндокардиальные клетки, обеспечивающие в миокарде синтез необходимого количества NO и кардиопептидов [29,32].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты сравнительного исследования действия НИЛИ и L-аргинина на миокард и ГМК воротной вены одних и тех же крыс с ХПН-1 показали, что, в отличие от миокарда, эффект НИЛИ и L-аргинина на ГМК воротной вены определяется состоянием сосудистого эндотелия: степенью нарушения обмена L-аргинина и работой NOS.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Vaziri ND. Effect of cronic renal failure on nitric oxide metabolism. Am J Kidney Dis 2001; 38 [4 Suppl 1]: S74-S79
2. Kim SW, Lee J, Paek YW et al. Decreased nitric oxide synthesis in rats with chronic renal failure. J Korean Med Sci 2000; 15 (4): 425-430
3. Барабанова ВВ, Береснева ОН, Мирошниченко ЕЛ и др. Функциональная активность воротной вены как отражение метаболических изменений при экспериментальной хронической почечной недостаточности. ФизиолЖурн СССР им. И. М. Сеченова 1993; 79 (1): 64-72
4. Potter GS, Johnson RJ, Fink GD. Role of endothelin in hypertension of experimental chronic renal failure. Hypertension 1997; 30 (6): 1578-1584
5. Барабанова ВВ, Чефу СГ. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (^=632,8 нм, плотность мощности 15 мВт/см2) на функциональную активность сосудистых глад-комышечных клеток воротной вены и миокард крыс с экспериментальной хронической почечной недостаточностью. Нефрология 2003; 7 (Прил 1): 139-140
6. Барабанова ТА, Пенчул НА. Экспериментальная хроническая почечная недостаточность, фуросемид и сократимость миокарда. Нефрология 1998; 2(3): 80-84
7. Петрищев НН, Смирнов АВ, Барабанова ВВ и др. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 632, 8 нм на сердечно-сосудистую систему крыс с экспериментальной хронической почечной недостаточностью. Нефрология 2004; 8 (Прил 2): 282
8. Brill AG, Brill GE, Shenkman B et al. Low power laser irradiation of blood inhibits platelet function: role of cyclic GMP. SPIE 1998; 3569: 4-9
9. Петрищев НН, Барабанова ВВ, Михайлова ИА, Чефу СГ. Влияние излучения He-Ne лазера на функциональную активность гладкомышечных клеток воротной вены. Рос Физиол Журн им. И.М. Сеченова 2001; 87 (5): 659- 664
10. Барила ГГ. Некоторые клинические и биохимические данные эффективности лечения больных ишемической болезнью сердца лучами лазера. II съезд кардиологов УССР. Тезисы докладов. Киев, 1983: 30-31
11. Реутов ВП, Сорокина ЕГ, Охотин ВЕ, Косицин НС. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. Наука, М., 1998
12. Веренинов АА, Марахова ИИ. Транспорт ионов у клеток в культуре. Наука, М., 1986
13. Lincoln TM, Komalavilas Р, Сornwell TL. Pleiotropic regulation of vascular smooth muscle tone by cyclic GMP-dependent protein kinase. Hypertension 1994; 23 (6 Pt 2): 11411147
14. Efron DT, Barbul A. Arginine and nutrition in renal disease. J Ren Nutr 1999; 9(3):142-144
15. Goumas G, Tentolouris C, Tousoulis D et al. Therapeutic modification of the L-arginine-eNOS pathway in cardiovascular diseases. Atherosclerosis 2001; 154(2):255-267
16. Wu G, Meininger CJ. Arginine nutrition and cardiovascular function. J Nutr 2000; 130(11): 2626-2629
17. Bouby N, Hassler C, Parvy P, Bankir L. Renal synthesis of arginine in chronic renal failure: in vivo and in vitro studies in rats with 5/6 nephrectomy. Kidney Int 1993; 44 (4): 676-683
18. Harris C, Meyer TW, Brenner BM. Nephron adaptation to renal injury. The kidney. Philadelphia, London, Tokio, 1986: 1555-1565
19. Ormrod D, Miller T. Experimental uremia. Nephron 1980; 26 (5): 249-254
20. Блаттнер Р, Классен Х, Денерт Х, Деринг Х. Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц: пер. с англ. Мир, М, 1983
21. Hladovec J, Prerovsky I, Stanec V, Fabian J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris. Klin Wochenshr 1978; 56: 1033-1036
22. Петрищев НН, Беркевич ОА, Власов ТД и др. Диагностическая ценность определения десквамированных эн-дотелиальных клеток в крови. КлиничЛабДиагностика 2001; (1): 50-52
23 Барабанова ТА, Петрищев НН, Смирнов АВ. Влияние излучения He-Ne лазера на механическую активность миокарда крыс при экспериментальной хронической почечной недостаточности. Нефрология 2003; 7 (1): 91-97
24. Vaziri ND, Ni Z, Oveisi F et al. Enhanced nitric oxide inactivation and protein nitration by reactive oxygen species in renal insufficiency. Hypertension 2002; 39 (1): 135-141
25. Шестакова МВ, Кутырина ИМ, Рагозин АК. Роль сосудистого эндотелия в регуляции почечной гемодинамики. Тер Арх 1994; 66 (2): 83-86
26. Aiello S, Noris M, Remuzzi G. Mario Negri. Nitric oxide/ L-arginine in uremia. Miner Electrolyte Metab 1999; 25(4-6): 384-390
27. Dhanakoti SN, Brosnan JT, Herzberg GR, Brosnan ME. Renal arginine synthesis: studies in vitro and in vivo. Am J Physiol 1990; 259(3 Pt 1): E437-E442
28. Mora J, Martuscelli J, Ortiz Pineda J, Soberon G. The regulation of urea-biosynthesis enzymes in vertebrates. Biochem J 1965; 96:28-35
29. Leskinen H, Vuolteenaho O, Leppaluoto J, Ruskoaho H. Role of nitric oxide on cardiac hormone secretion: effect of NG-nitro-L-arginine methyl ester on atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide release. Endocrinology 1995; 136(3): 1241-1249
30. Cotton JM, Kearney MT, MacCarthy PA et al. Effects of nitric oxide synthase inhibition on basal function and the force-frequency relationship in the normal and failing human heart in vivo. Circulation 2001; 104(19): 2318-2323
31. Weiss HR, Sadoff JD, Scholz PM, Klabunde RE. Nitric oxide reduces myocardial contractility in isoproterenol-stimulated rat hearts by a mechanism independent of cyclic GMP or cyclic AMP. Pharmacology 1997; 55(4): 202-210
32. Lang RE, Thocken H, Gauten D. Atrial natriuretic factor - circulating hormone stimulated by volume loading. Nature 1985; 314: 264-266
Поступила в редакцию 21.09.2007 г.
Принята в печать 12.11.2007 г.
