CC BY
20
УДК 582.29
М. И. Соловьева, С. С. Кузьмин
Сравнительное исследование антиоксидантной и антимикробной активности лишайников Cetraria islandica (L.) и Cladonia arbuscula (Wallr.)
СВФУ им. М.К. Аммосова, г. Якутск, Россия
Аннотация. В данной статье приведены результаты анализа антиоксидантной и антимикробной активности лишайников Cetraria islandica и Cladonia arbuscula в зависимости от способов обработки слоевищ и соотношения разведения сухого экстракта водой. 40%-й водно-этанольный экстракт был получен из живых частей высушенных лишайников, собранных в экологически чистом районе Якутии. Определение антиоксидантной активности было проведено спектрофотометрическим методом, а определение антимикробной активности выполнено диско-диффузионным методом в агаре. Установлено наибольшее содержание низкомолекулярных антиоксидантов в Cetraria islandica при соотношении сухой экстракт: дистиллированная вода 1:1, а в экстракте из Cladonia arbuscula - при соотношении 1:5. При этом показано, что предварительная механохимическая обработка сырья слоевищ лишайников (размер частиц до 1мм) повышает выход низкомолекулярных антиоксидантов до 50% по сравнению с грубым помолом (размер частиц 2 мм). Проверена антибактериальная активность исследованных лишайников на Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli при разведениях сухого экстракта водой 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5. Наиболее значимый антибактериальный эффект выявлен в экстракте исследованных лишайников в соотношении 1:1. Диаметр бактериостатической зоны на Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и E.coli под действием экстракта Cetraria islandica составил 12±0,14 мм, 11±0,12 мм и 12±0,13 мм соответственно. Подавление зоны роста экстрактом Cladonia arbuscula в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, E.coli было в диаметре 15±0,18 мм, 12±0,20 мм и 13±0,20 мм соответственно. Результаты были соизмеримы с действием оксациллина, но эффективнее действия пенициллина, которые служили контролем.
Ключевые слова: лишайники, Cetraria islandica, Cladonia arbuscula, механоактивация, разведение экстракта, водно-этиловый раствор, антимикробная активность, диско-диффузионный метод, низкомолекулярные антиоксиданты, спектрофотометрический метод.
DOI 10.25587/SVFU.2022.61.66.002
СОЛОВьЕВА Марианна Иннокентьевна - к. б. н., доцент биологического отделения ИЕН, СВФУ им. М. К. Аммосова.
E-mail: cmi79@mail.ru
SOLOVIEVA Marianna Innokentievna - Candidate of Biological Sciences, Assistant Professor of the Department of Biology of the Institute of Natural Sciences of the M.K. Ammosov North-Eastern Federal University.
КУЗьМИНА Саргылана Семеновна - к. б. н., доцент биологического отделения ИЕН, СВФУ им. М. К. Аммосова.
E-mail: sskuzmina@bk.ru
KUZMINA Sargylana Semenovna - Candidate of Biological Sciences, Assistant Professor of the Department of Biology of the Institute of Natural Sciences of the M.K. Ammosov North-Eastern Federal University.
М. И. Соловьева, С. С. Кузьмин. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОй И АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИШАЙНИКОВ CETRARIA ISLANDICA (L.) И CLADONIA ARBUSCULA (WALLR.)_
M. I. Soloveva, S. S. Kuzmina
Тhе comparative study of antioxidant and antimicrobial activity of the lichens Cetraria islandica (L.) and Cladonia arbuscula (Wallr.)
M.K. Ammosov North-Eastern Federal University, Yakutsk, Russia
Abstract. This article presents the results of the analysis of the antioxidant and antimicrobial activity of the lichens Cetraria islandica and Cladonia arbuscula, depending on the treatment methods of the layers and the ratio of dilution of the dry extract with water. 40% water-ethanol extract was obtained from living parts of dried lichens collected in an ecologically clean area of Yakutia. The determination of antioxidant activity was carried out by spectrophotometric method, and the determination of antimicrobial activity was carried out by the disco-diffusion method in agar. The highest content of low molecular weight antioxidants was found in Cetraria islandica at the ratio of dry extract:distilled water is 1:1, and in the extract from Cladonia arbuscula - at a ratio of 1:5. At the same time, it is shown that the preliminary mechanochemical treatment of raw materials of lichen layers (particle size up to 1 mm) increases the yield of low molecular weight antioxidants by up to 50% compared with coarse grinding (particle size 2 mm). The antibacterial activity of the studied lichens was tested on Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli when diluting the dry extract with water 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5. The most significant antibacterial effect was detected in the extract of the studied lichens in a ratio of 1:1. The diameter of the bacteriostatic zone on Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes and E. coli under the action of the extract of Cetraria islandica was 12 ± 0.14 mm, 11± 0.12 mm and 12± 0.13 mm, respectively. Suppression of the growth zone with Cladonia arbuscula extract against Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, E. coli was 15±0.18 mm, 12±0.20 mm and 13±0.20 mm in diameter, respectively. The results were commensurate with the action of oxacillin, but more effective than the action of penicillin, which served as a control.
Keywords: lichens, Cetraria islandica, Cladonia arbuscula, mechanical activation, extract dilution, water-ethyl solution, antimicrobial activity, disk-diffusion method, low molecular weight antioxidants, spectrophotometric method.
Введение
В связи с растущей устойчивостью патогенных и условно-патогенных микроорганизмов к существующим синтетическим антибиотикам в настоящее время требуются разработка новых лекарственных препаратов и поиск антибиотиков растительного происхождения. В качестве перспективного источника сырья для препаратов с противобактериальными свойствами рассматриваются лишайники [1, 2]. В последнее время активно проводится изучение фармакологических свойств лишайников, включая их противовирусный, антибиотический и противоопухолевый потенциал [3, 4].
Лишайники представляют собой экосистему, состоящую из микобионта (грибы класса аскомицетов и базидиомицетов) и фикобионта (зеленые и желто-зеленые водоросли) [4].
В связи с особым симбиотическим образом жизни лишайники обладают выраженной биологической активностью, исследованной in vitro и in vivo [5, 6]. В слоевищах лишайников содержатся первичные и вторичные метаболиты. Вещества, которые находятся непосредственно в клетке и межклеточном пространстве, участвующие в клеточном обмене, называют первичными метаболитами (углеводы и ферменты и др.). Вторичные метаболиты являются конечными продуктами метаболизма. Высокую устойчивость лишайников к экстремальным физическим воздействиям связывают с синтезом многочисленных вторичных метаболитов в слоевищах этих растений.
Среди лишайниковых метаболитов наиболее изученными считаются лишайниковые кислоты. Усниновая кислота, распространенный фенольный вторичный метаболит лишайников, в настоящее время используется в качестве антибиотика широкого спектра действия: ее натриевая соль используется для лечения ран, ожогов и трещин [7]. В работах Д. В. Тапальского [1] показано, что минимальные подавляющие концентрации экстрактов из лишайников могут располагаться в диапазоне от 100 до 1000 мкг/мл, что превосходит антибиотики широкого спектра действия. Антимикробную и антиоксидантную активность также проявляют вульпиновая, лихестериновая, физодоновая и дифрактаевая кислоты лишайников [7, 8].
Исследование антиоксидантного потенциала метаболитов лишайников является перспективной стратегией для профилактики или лечения различных заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Однако подробные механизмы и сигнальные пути, связанные с антиоксидантной активностью лишайников, недостаточно изучены [3, 4].
В связи с этим целью данного исследования является изучение антиоксидантной и антимикробной активности водно-этиловых экстрактов лишайников Cetraria islandica и Cladonia arbuscula, произрастающих в Якутии.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись кустистые лишайники Cetraria islandica и Cladonia arbuscula, собранные в Республике Саха (Якутия) в августе 2017 г. Надземная фитомасса растений была собрана в 2017 г. на участке площадью 20 м2 в сосново-бруснично-лишайниковом лесу в окрестностях г. Якутска, Центральная Якутия (61°55'22.30" с. ш., 129°32'5.79" в. д.). Определение лишайников проводилось с использованием стандартных процедур [9]. Собранные лишайники очищали, промывали, высушивали и хранили в бумажных конвертах. Для исследования использовали живые части слоевищ растений.
Для приготовления экстрактов брали 5 г высушенной и измельченной надземной части растительного сырья, в качестве экстрагента добавляли 100 мл 40%-го водно-этилового раствора. Измельчение высушенного сырья проводили двумя способами: грубый помол (размер частиц 2 мм) и механохимическая обработка в проточной мельнице ЦЭМ-7-80 (размер частиц до 1 мм). Экстрагирование проводили при комнатной температуре в течение 3 дней с периодическим перемешиванием. Далее экстракты фильтровали через бумажные фильтры, выпаривали с помощью роторного испарителя «EyelaCA-111 2 cl». Сухие экстракты из лишайников массой 1,0±0,01 мг растворяли в дистиллированной воде. Для получения растворов экстракта с различной концентрацией - 1; 0,5; 0,33; 0,25; 0,2 мг/мл - были подготовлены образцы с разведением 1мг на 5 мл (1:5), 1 мг на 4 мл (1:4), 1 мг на 3 мл (1:3), 1 мг на 2 мл (1:2), 1 мг на 1 мл (1:1) дистиллированной воды соответственно.
Антиоксидантные свойства определяли по количеству низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО), окисляющих хлорное железо (III) до хлористого железа (II). Количественная реакция осуществлялась по интенсивности окраски при добавлении о-фенантролина на спектрофотометре «ПЭ-5400 УФ» при длине волны 405 нм [10].
Для оценки антимикробной активности полученных экстрактов использовали диско-диффузионный метод. Готовили суспензию тест-микроорганизмов в концентрации
М. И. Соловьева, С. С. Кузьмин. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОй И АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИШАЙНИКОВ CETRARIA ISLANDICA (L.) И CLADONIA ARBUSCULA (WALLR.)_
1,5*108КОЕ/мл: грамположительные бактерии Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и грамотрицательные Escherichia coli наносили в объеме 1 мл на чашку Петри со средой агара Мюллер-Хинтона. На стерильные диски из фильтровальной бумаги наносили 0,01 мл исследуемых экстрактов. После высушивания диски с экстрактами накладывали на посев на расстоянии 2 см друг от друга и инкубировали при 36 0С 18-24 часа. Учет результатов фиксировали путем измерения зон подавления роста бактерий вокруг дисков (включая диаметр самого диска). При зоне подавления роста до 10 мм отмечали устойчивость бактерий к экстракту, при 11-15 мм -промежуточный к экстракту, при 15-25 мм - как чувствительные к экстракту [11].
Результаты представлены в виде среднего арифметического значения и достоверного интервала различия (при р<0,05) по данным пяти экспериментов. Также средние величины исследованных параметров определяли с использованием стандартного пакета программ «Statistical [12].
Результаты и обсуждение
Для эффективной экстракции биологически активных веществ растений большую роль играет процесс механической обработки растений. Повышение скорости экстрагирования и максимальный выход растворимых веществ можно достичь увеличением площади соприкосновения поверхности веществ, учитывая диффузионные процессы. Поэтому для увеличения выделения низкомолекулярных веществ слоевищ лишайников мы использовали механохимическую обработку сырья. Содержание низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО) в 1 г сухого экстракта, полученного из сырья слоевищ лишайников после грубого помола, составило в Cetraria islandica 0,56 мкг*экв/г, в Cladonia arbuscula - 0,82 мкг*экв/г, что было ниже на 56% (p<0,05) и на 10% (p<0,05) по сравнению с экстрактами после механохимической обработки.
Далее было определено содержание НМАО в растворах, полученных путем разведения сухого экстракта от 1 до 0,2 мг/мл в дистиллированной воде. Были подготовлены образцы с разведением 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1. В исследованных образцах лишайников Cetraria islandica и Cladonia arbuscula отмечается схожее повышение содержание НМАО, начиная с разведения 1:3 (табл. 1).
В нашей работе действие экстрактов лишайников Cetraria islandica и Cladonia arbuscula при разведении 1:1 явилось максимально эффективным в отношении угнетения роста как грамположительных (S. aureus, S. pyogenes), так и в отношении грамотрицательных (E. coli) бактерий. Следует отметить, что в разведении 1:1 Cladonia arbuscula обладает более выраженными антибактериальными свойствами, чем Cetraria islandica. Влияние на рост Streptococcus pyogenes исследованных экстрактов Cetraria islandica в разведениях 1:5, 1:4, 1:3 было определено как не чувствительный (6 мм). А на штаммы Staphylococcus aureus в разведениях 1:5 и 1:4 в целом действовали слабее. Наибольший эффект
Таблица 1
Содержание НМАО в Cetraria islandica и Cladonia arbuscula в зависимости от разведения сухого экстракта в воде, мкг*экв/г.
Разведение Cetraria islandica Cladonia arbuscula
1:1 0,91±0,05 0,78±0,02
1:2 0,86±0,02 0,96±0,03
1:3 1,27±0,01 1,29±0,01
1:4 1,29±0,03 1,36±0,02
1:5 1,32±0,01 1,35±0,02
Таблица 2
Диаметр зон подавления роста бактерий (мм) экстрактами лишайников в зависимости от разведения
Разведение сухого экстракта Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes E. coli
Cetraria islandica
1 : 5 6 ± 0.10 6 ± 0.15 10 ± 0.13
1 : 4 6 ± 0.13 6 ± 0.12 10 ± 0.14
1 : 3 7 ± 0.11 6 ± 0.18 10 ± 0.12
1 : 2 8 ± 0.10 8 ± 0.12 8 ± 0.14
1 : 1 12 ± 0.14* 11 ± 0.12* 12 ± 0.13*
Cladonia arbuscula
1 : 5 7 ± 0.14 9 ± 0.15 10 ± 0.18
1 : 4 7 ± 0.14 9 ± 0.12 12 ± 0.16*
1 : 3 7 ± 0.12 7 ± 0.15 7 ± 0.17
1 : 2 8 ± 0.16 11 ± 0.16* 7 ± 0.13
1 : 1 15 ± 0.18* 12 ± 0.20* ± 0.20*
*Значимые различия с показателями предыдущих разведений экстрактов (p<0,05)
подавления E. coli проявили экстракты при концентрации 1:1 Cetraria islandica и Cladonia arbuscula, диаметр бактериостатической зоны которых составил 12±0,13 и 13±0,20 мм соответственно, а при подавлении роста оксациллином диаметр составил 12±0,12 мм, пенициллином - 7±0,09 мм (табл. 2). Антимикробное действие экстрактов в разведениях 1:5, 1:4 и 1:3, было менее выраженным по сравнению с оксациллином, но эффективнее пенициллина. Антибактериальное действие экстракта Cladonia arbuscula на E. coli было более значительным по сравнению с экстрактом Cetraria islandica при концентрации 1:1, что, видимо, обусловлено различиями в содержании биологически активных веществ (фенольные соединения).
Заключение
Полученные нами результаты показали высокий биологический потенциал исследуемых лишайников Cetraria islandica и Cladonia arbuscula, произрастающих в условиях Якутии. В настоящее время изучение антиоксидантной способности лишайников является актуальной темой. В большинстве лишайников важными антиоксидантами являются фенолы, способные поглощать свободные радикалы. Следует отметить, что экстракты представляют собой смесь множества биологически активных веществ растительной ткани и их антиоксидантная активность может являться как результатом отдельных компонентов, так и быть результатом их взаимодействий. В нашем исследовании антиоксидантная активность экстракта Cetraria islandica и Cladonia arbuscula скорее всего является результатом синергетического эффекта нескольких соединений, присутствующих в экстракте, которые в связанном действии способствуют относительно высокому общему антиоксидантному действию. Исследования показывают, что лишайники эффективны не только против чувствительных штаммов бактерий, но также против различных штаммов бактерий с множественной лекарственной
М. И. Соловьева, С. С. Кузьмин. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОй И АНТИМИКРОБНОй АКТИВНОСТИ ЛИШАйНИКОВ CETRARIA ISLANDICA (L.) И CLADONIA ARBUSCULA (WALLR.)_
устойчивостью. Особое значение имеет ингибирование роста мультирезистентных штаммов Streptococcus aureus и микобактерий [7]. Наши результаты также подтверждают важность лишайников как источника антимикробных метаболитов в отношении обоих типов бактерий.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что механо-активация слоевищ лишайников способствует повышению выхода НМАО Cetraria islandica на 56%, а Cladonia arbuscula на 10% по сравнению со слоевищами грубого помола. Наиболее выраженные антиоксидантные свойства лишайников Cetraria islandica и Cladonia arbuscula при приготовлении экстракта в 40-м водно-этанольном растворе проявились в экстракте Cetraria islandica при разведении 1:1 (1,28 мкг*экв/г), а в экстракте из Cladonia arbuscula - при 1:5 (1,16 мкг*экв/г). Антимикробные свойства были установлены при разведении сухого остатка в соотношении 1:1. Выявлен антибактериальный эффект экстракта в разведении 1:1 Cetraria islandica в отношении Staphylococcus aureus подавление зоны роста на 12±0,14 мм, у Streptococcus pyogenes на 11±0,12 мм и E.coli на 12±0,13 мм. Антибактериальный эффект экстракта в разведении 1:1 Cladonia arbuscula в отношении Staphylococcus aureus подавление зоны роста на 15±0,18 мм, у Streptococcus pyogenes на 12±0,20 мм, и E.coli на 13±0,20 мм. Также следует отметить, что при данных условиях исследования антибактериальное действие Cladonia arbuscula было эффективнее по сравнению с Cetraria islandica.
Л и т е р а т у р а
1. Тапальский, Д. В. Антимикробная и противогрибковая активность лишайников, распространенных на территории Беларуси / Д. В. Тапальский, Д. Р. Петренев, О. М. Храмченкова [и др.] // Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии. - 2017. - № 2. - С. 60-65.
2. Тапальский, Д. В. Антибактериальная активность экстракта Hypogymnia Physodes и его комбинаций с антибиотиками в отношении энтерококков / Д. В. Тапальский, К. М. Косенкова // Проблемы здоровья и экологии. - 2018. - № 4 (58). - С. 52-56.
3. Femandez-Moriano, C. Antioxidant potential of lichen species and their secondary metabolites. A systematic review / C. Fernandez-Moriano, M. P. Gomez-Serranillos, A. Crespo // Pharm. Biol. - 2016. - V. 54. - P. 1-17.
4. Xu, M. Secondary metabolites from cetrarioid lichens: Chemotaxonomy, biological activities and pharmaceutical potential / M. Xu, S. Heidmarsson, E.S. Olafsdottir, R. Buonfiglio, T. Kogej, S. Omarsdottir // Phytomedicine. - 2016. - V. 23 (5). - P. 441-459.
5. Boustie, J. Bioactive lichen metabolites: alpine habitats as an untapped source / J. Boustie, S. Tomasi, M. Grube // Phytochem. - 2011. - V. 10. - P. 287-307.
6. Fernández-Moriano, C. Protective effects of lichen metabolites evernic and usnic acids against redox impairment-mediated cytotoxicity in central nervous system-like cells / C. Fernández-Moriano, P. K., Divakar, A. Crespo, M. P. Gómez-Serranillos // Food Chem Toxicol. - 2017. - V. 105. - P. 262-277.
7. Cocchietto, M. A review on usnic acid, an interesting natural compound / M. Cocchietto, N. Skert, P. L Nimis, G. Sava // Naturwissenschaften.- 2002. - V. 89(4). - P.137-146.
8. Kosanic, M. Antioxidant and antimicrobial properties of some lichens and their constituents / M. Kosanic, B. Rankovic // J Med Food. - 2011. - V. 14 (12). - P. 1624-1630.
9. Рыкова, Ю. В. Определитель листовых и кустистых лишайников Якутии : учебное пособие / Ю. В. Рыкова. - Якутск : Издательство Якутского госуниверситета, 1996. - 91 с.
10. Рогожин, В. В. Методы биохимических исследований : учебное пособие / В. В. Рогожин. -Якутск, 1999. - 113 с.
11. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам : методические указания (МУК 4.12.1890-04). - Москва : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - 2008.
12. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - [Перевод с английского]. - Москва : Практика, 1998. - 459 с.
R e f e r e n c e s
1. Tapal'skij, D. V. Antimikrobnaya i protivogribkovaya aktivnost' lishajnikov, rasprostranennyh na territorii Belarusi / D. V. Tapal'skij, D. R. Petrenev, O. M. Hramchenkova [i dr.] // Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii. - 2017. - № 2. - S. 60-65.
2. Tapal'skij, D. V. Antibakterial'naya aktivnost' ekstrakta Hypogymnia Physodes i ego kombinacij s antibiotikami v otnoshenii enterokokkov / D. V. Tapal'skij, K. M. Kosenkova // Problemy zdorov'ya i ekologii. - 2018. - № 4 (58). - S. 52-56.
3. Fernandez-Moriano, C. Antioxidant potential of lichen species and their secondary metabolites. A systematic review / C. Fernandez-Moriano, M. P. Gomez-Serranillos, A. Crespo // Pharm. Biol. - 2016.
- V. 54. - P. 1-17.
4. Xu, M. Secondary metabolites from cetrarioid lichens: Chemotaxonomy, biological activities and pharmaceutical potential / M. Xu, S. Heidmarsson, E.S. Olafsdottir, R. Buonfiglio, T. Kogej, S. Omarsdottir // Phytomedicine. - 2016. - V. 23 (5). - P. 441-459.
5. Boustie, J. Bioactive lichen metabolites: alpine habitats as an untapped source / J. Boustie, S. Tomasi, M. Grube // Phytochem. - 2011. - V. 10. - P. 287-307.
6. Fernández-Moriano, C. Protective effects of lichen metabolites evernic and usnic acids against redox impairment-mediated cytotoxicity in central nervous system-like cells / C. Fernández-Moriano, P. K., Divakar, A. Crespo, M. P. Gómez-Serranillos // Food Chem Toxicol. - 2017. - V. 105. - P. 262-277.
7. Cocchietto, M. A review on usnic acid, an interesting natural compound / M. Cocchietto, N. Skert, P. L Nimis, G. Sava // Naturwissenschaften.- 2002. - V. 89(4). - P.137-146.
8. Kosanic, M. Antioxidant and antimicrobial properties of some lichens and their constituents / M. Kosanic, B. Rankovic // J Med Food. - 2011. - V. 14 (12). - P. 1624-1630.
9. Rykova, Yu. V. Opredelitel' listovyh i kustistyh lishajnikov Yakutii : uchebnoe posobie / Yu. V. Rykova.
- Yakutsk : Izdatel'stvo Yakutskogo gosuniversiteta, 1996. - 91 s.
10. Rogozhin, V. V. Metody biohimicheskih issledovanij : uchebnoe posobie / V. V. Rogozhin. - Yakutsk, 1999. - 113 s.
11. Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam : metodicheskie ukazaniya (MUK 4.12.1890-04). - Moskva : Federal'nyj centr gossanepidnadzora Minzdrava Rossii. - 2008.
12. Glanc, S. Mediko-biologicheskaya statistika / S. Glanc. - [Perevod s anglijskogo]. - Moskva : Praktika, 1998. - 459 s.
^■Mír^ír
