CC BY
30
УДК: 615.371: 578.832.1
ПОРІВНЯЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ АКТИВНОСТІ СТИМУЛЯТОРІВ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ В ЕКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
О.А. Романова, А.В. Мартинов, Н.І. Ігумнова, Т.А. Сидоренко, В.І. Чернявський,
М.В. Смілянська, С.Д. Перемот
Інститут мікробіології і імунології імені 1.1. Мечникова АМН України, м. Харків, Україна РЕЗЮМЕ
З метою пошуку ад’ювантної складової пероральної антисиньогнійної спліт-вакцини проведено порівняння імуностимулюючої активності тималіну, його ацильованої форми та неспецифічного препарату рослинного походження - глюкорибіну в дослідах in vitro з використанням інтегральних реакцій клітинного імунітету людини і тварин. Найвищий потенціюючий ефект було відмічено у похідного чорної смородини, тоді як у ацильованої форми тималіну він виявився найслабшим.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: імуностимулятори, лімфоцити, клітинний імунітет
Поширеність ускладнень лікарняних інфекцій, незважаючи на наявність нових антисептичних засобів і постійне удосконалення протимікробних препаратів, з новою гостротою становить питання специфічної профілактики шляхом вакцинації. Причиною сучасних гнійно-септичних хірургічних ускладнень найчастіше є грам-негативні бак-те-рії, серед яких переважає (27-39%) P.aerugi-nosa [1]. Складність подолання інфекцій, викликаних синьогнійною паличкою, обумовлена її множинною антибіоти-корезистен-тністю і особливостями перебігу інфекцій-ного процесу. Тому створення дієвої вакцини для профілактики синьогнійної інфекції на сьогоднішній день мало б вирішальне значення для упередження гнійно-септичних ускладнень після хірургічних або діагностичних інвазивних втручань.
В рамках науково-дослідної роботи Інституту «Ацильовані похідні білків та полісахаридів антигену синьогнійної палички, розробка на їх основі вакцини» (№ держреє-страції 0106U003265) в лабораторії імуноре-абілітології розробляється антисиньогнійна спліт-вакцина. Метою даного дослідження було порівняльне вивчення імуностимулю-ючих можливостей ряду препаратів специи-фічної та неспецифічної дії (тималіну [2], ацильованого тималіну, синтезованого за методом [3], та глюкорибіну - препарату чорної смородини [4]) як потенційних складових антисиньогнійної вакцини з ад’ювантни-ми властивостями.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
В експериментах in vitro, що відображають інтегральні реакції клітинного імунітету, були використані тимоцити щурів-самців
лінії Wistar та лімфоцити периферичної крові здорових донорів-людей.
Оцінка спонтанної проліферації тимоц-итіе щурів
Для отримання клітин тимусу тварин морталізували декапітацією під ефірним наркозом, готували в стерильних умовах на льоду суспензію тимоцитів. Вилучений тимус гомогенізували, отриману клітинну суспензію фільтрували через капроновий фільтр, тричі відмивали у повному культуральному середовищі. Для проведення культивування використовували суспензію з концентрацією 5х10б кл/мл. Досліджувані препарати додавали до клітинної культури в кількості: тималін та ацильований тималін -по 280хЮ"7 мг/мл, глюкорибін - 104,5><10"5 г/мл (в перерахунку на альбумін за методом Флореса). Тимоцити інкубували протягом З діб у вологій камері, в атмосфері, збагаченій СОг, в повному культуральному середовищі з додаванням і без додавання препаратів. Після закінчення культивування з клітинних суспензій готували препарати-мазки для морфологічного дослідження. В препаратах, пофарбованих за Романовським-Гімза, визначали відсоток лімфобластів по відно-шен-ню до загальної кількості лімфоїдних клітин, підраховуючи не менше 250 лімфоїдних клітин на препарат.
Оцінка експресії рецепторів на Т-лімфо-цитах людини і тварин
Для фенотипування дозрілих Т-лімфоци-тів у периферичній крові донорів використо
вували МКАТ CD3+, помічені ФІТЦ. Моно-нуклеари периферичної крові виділяли за допомогою центрифугування у градієнті густини фікола-верографіна при d = 1,077. Перед фенотипуванням зразки гепаринизованої периферичної крові інкубували з досліджуваними препаратами протягом 1 години. Ре-
акцію оцінювали на люмінісцентному мікроскопі. Підрахунок здійснювали на 100 лімфоцитів, результат виражали у відсотку клітин, що виявляли люмінісценцію.
Експресію рецепторів до еритроцитів барана на тимоцитах щурів в присутності іму-ностимуляторів визначали за тестом Е-ро-зеткоутворення [5]. Перед виконанням реакції виділені тимоцити інкубували з препаратами протягом 1 години. Підраховуючи 200 лімфоцитів, Е-розеткоутворюючі клітини (Е-РУК) визначали за приєднанням не менше трьох еритроцитів. Результат виражали у відсотку Е-РУК по відношенню до загального числа підрахованих лімфоцитів.
В експериментах було досліджено 11 зразків периферичної крові здорових донорів і 13 тимусів щурів.
При статистичному аналізі результатів використовували параметричні методи. Визначали середнє арифметичне (X) та помилку середнього арифметичного (эХ). Вірогід-ність різниці між показниками різних груп оцінювали за критерієм Стьюдента і вважали значущою при р< 0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
За оцінки здатності тималіну, ацильова-ного тималіну та глюкорибіну викликати проліферацію лімфоцитів встановлено, що всі препарати мали здатність достовірно збільшувати мітотичну активність, проте найвищим потенціалом серед них відрізнявся препарат чорної смородини, який майже вдвічі посилював РБТ (табл.). Характерно, що дана речовина спричинювала активацію бластогенезу на 35% вищу, ніж класичний препарат корекції функцій вилоч-кової залози і Т-системи імунітету - тималін. Що стосується мітогенної дії отриманої шляхом ацилювання нової форми тималіну, вона виявилась найслабшою (-37% перевищення спонтанної проліферації).
Вивчення впливу досліджуваних препаратів на Е-розеткоутворюючу здатність тимо-цитів продемонструвало її підвищення на 35,4% та 39,7% у випадках застосування тималіну і глюкорибіну відповідно, тоді як ацильований тималін не викликав достовірних змін цієї функції клітин. Застосування глюкорибіну в реакції імунофенотипування СЮЗ -лімфоцитів людської крові також по
казало спроможність цього препарату до сутність у зразках периферичної крові Тима-
підвищення активації експресії рецептору ліну або його ацильованої форми достовір-
дозілих Т-лімфоцитів на 37% у порівнянні із них змін експресії CD3+ не виявила,
зразками, в які препарат не додавався. При-
Т аблиця
Вплив препаратів-імуностимуляторів на реакції клітинного імунітету in vitro (X±sX)
Препарати Проліферація лімфоцит ів,% Експресія рецепторів до ЕБ,% Експресія рецепторів CD3+, %
Без препаратів 26,0±2,4 37,5±2,8 49,0±4,0
Т ималін 42,5±3,7* 50,8±4,3* 56,1±6,7
Ац.тималін 35,8±2,9* 41,2±4,3 51,3±5,2
Глюкорибін 51,6±4,5* 52,4±3,9* 67,3±5,8*
*- достовірність відмінностей у порівнянні з контролем, р<0,05.
Таким чином, в результаті експериментів виявилось, що досліджений рослинний препарат неспецифічної дії має достатньо високий імуностимулятивний потенціал у застосованих тестах in vitro, що характеризують функції лімфоцитів. Відомо, що Т-лімфоци-ти є найважливішим елементом кровотворного мікрооточення [6]. Інтерлейкін-3 (ІЛ-3), що продукується активованими Т-лімфоци-тами, належить до найбільш ранньодіючих гемопоетинів, які стимулюють процеси проліферації та диференціювання ранніх кровотворних попередників [7]. Окрім цього фактора, Т-лімфоцити також продукують ІЛ-6, ІЛ-7, ГМ-КСФ - цитокіни, що справляють стимулюючий вплив на гемопоез. Через активацію макрофагів та ретикулоцитів, що формують мікрооточення, Т-лімфоцити здатні опосередковано конторлювати і регулюва-
ти мієло- та лімфопоез у кровотворній тканині [8, 9]. Отже, вплив на Т-компартмент імунітету є надважливим як для стимуляції В-ланки, тобто спрямування проліферації лімфоцитів в бік формування дозрілих В-клітин, так і на активацію кровотворення взагалі, що має неабияке значення для корекції імунної відповіді у поширених випадках наявності імунодефіциту. З цього боку застосування у вакцинації проти синьо-гнійної інфекції, препарату, стимулюючого клітинну ланку імунітету, є вельми доцільним. Можна припустити, що таким препаратом, після додаткового тестування in vivo та in vitro, може виявитись глюкорибін.
ВИСНОВКИ
1. Неспецифічний препарат рослинного походження глюкорибін має виражений
ефект стимуляції клітинних імунних реакцій.
2. Отримана шляхом ацилювання нова форма тималіну продемонструвала найнижчу імуностимулюючу здатність
ЛІТЕРАТУРА
1. Романова О.А., Смілянська М.В., Городницька Н.І., та ін. // Аннали Мечниківського Інституту. -2006. - №3. - С.4-18.
2. Дранник Г.М., Гриневич Ю.Я., Дизик Г.М. Імунотропні препарати. -К.:Здоров’я. - 1994. - С. 61, 269.
3. Martynov A.V., Smelyanskaya M.V. // J. of Interf. & Cytokine res. - 2005. - Vol.25. - №7. - P. 414-417.
4. Савченко B.H., Яблучанский Н.И., Хворостинка В.H., Сокол К.М. Лекарственные растения и фитотерапия. -Харьков:Гриф. - 2004. - С. 11, 176.
5. Передерий В.Г., Земсков А.М., Бычкова Н.Г., Земсков В.М. Иммунный статус, принципы его оценки и коррекции иммунных нарушений. -К.:Здоров’я. - 1995. - 210 с.
6. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. -М. :Наука. -1980. -244 с.
7. Дыгай А.М., Богдашин И.В., Шерстобоев Е.Ю., и др. // Иммунология. - 1991. - № 2. - С. 20-26.
8. Дыгай А.М., Шахов В.П. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. - Томск. 1989. - 165 с.
9. Натан Д.Г., Зифф К.А. //Гематол. и трансфузиол. - 1994. - Т. 39. - № 2. - С. 3-10.
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ СТИМУЛЯТОРОВ ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
Е.А. Романова, А.В. Мартынов, Н.И. Игумнова, Т.А. Сидоренко, В.И. Чернявский,
М.В. Смелянская, С.Д. Перемот
Институт микробиологии и иммунологии имени И.И. Мечникова АМН Украины г. Харьков, Украина
РЕЗЮМЕ
С целью поиска адъювантной составляющей антисинегнойной сплит-вакцины проведено сравнение иммуностимулирующей активности тималина, его ацилированной формы и неспецифического препарата растительного происхождения - глюкорибина в экспериментах in vitro с использованием интегральных реакций клеточного иммунитета человека и животных. Наиболее высокий потенцирующий эффект был отмечен у производного черной смородины, тогда как у ацилированной формы тималина он оказался наиболее слабым.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммуностимуляторы, лимфоциты, клеточный иммунитет
COMPARATIVE INVESTIGATION OF IMMUNOPOTENTIATION DRUGS AKTIVITY IN VITRO
EA. Romanova, A. V. Martynov, N.I. Igumnova, T.A. Sydorenko, V.I. Chernyavsky,
M. V. Smelyanskaya, S.D. Peremot
I.I. Mechnykov Institute of Microbiology and Immunology of the Academy of Medical Science of Ukraine, Kharkiv
SUMMARY
As ajuvant components of psevdomonas split vaccine were investigated in immunotropic properties of same substances: timaline, it’s acylated derivative and vegetable proteoglican glucoribin from Ribes Nigrum. In the study were used in human’s and animal cell immunologic reactions.
In the results was established high immunotropic effect in glucoribine, but in timaline and it’s acylated derivative such effect was minimal.
KEY WORDS: immunopotentiating drugs, lymphocytes, cell immunity
порівня-но з тималіном та глюкорибіном, що ви-ключає можливість її потенційного застосування у складі антисинь-огнійної вакцини.
