CC BY
35
DOI: 10.15690/vramn695
А.П. Пикина1, А.Н. Шкопоров1, Е.В. Кулагина2, Е.В. Хохлова1, А.В. Чаплин1, Н.Н. Володин3, Л.И. Кафарская1, Н.Г. Короткий1, Б.А. Ефимов1
1 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова,
Москва, Российская Федерация 2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Российская Федерация 3 Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачёва,
Москва, Российская Федерация
Сравнительное генетическое типирование изолятов Staphylococcus aureus, выделенных с поверхности кожи, из носовой полости и кишечника у детей, страдающих атопическим дерматитом
Обоснование. Кожные покровы больных, страдающих атопическим дерматитом, с большой частотой колонизированы бактериями, принадлежащими виду Staphylococcus aureus. Топическая антибактериальная и противовоспалительная терапия часто оказываются 367 недостаточно эффективными, что проявляетсяреколонизацией кожных покровов золотистым стафилококком и обострением аллергического процесса. Цель исследования: определить частоту колонизации S. aureus кожных покровов, слизистых оболочек носовой полости и кишечника у детей, страдающих атопическим дерматитом, провести сравнительный анализ выделенных из различных биотопов штаммов S. aureus, используя методы генетического типирования, и на основании полученных результатов оценить вероятность миграции стафилококков между биотопами. Методы. Выделение S. aureus проведено у 38 детей с атопическим дерматитом. Осуществляли видовую идентификацию стафилококков при помощи биохимических (API Staph) и масс-спектрометрических (MALDI-TOFMS) методов. Генетическое типирование выделенных штаммов S. aureus проводилось методами анализа длин участков между генами 16SрРНК и 23S рРНК в многокопийных рРНК-оперонах и высокоразрешающего анализа плавления региона Х гена spa. Результаты. При помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии были успешно идентифицированы 99% выделенных штаммов S. aureus: у 31,6% детей — из всех изучаемых биотопов, у 42% — с поверхности кожи и из носовой полости, у 2,6% — с кожи и из кишечника, у 10,5% — только с кожи, у 2,6% — из носовой полости и кишечника, у 2,6% — только из носовой полости. У 8% детей S. aureus не был обнаружен ни в одном из биотопов. Генотипирование позволило выявить 17 отличающихся генотипов S. aureus. Генотипы S. aureus, выделенные из носовой полости и кишечника, были в 88 и 61% случаев соответственно идентичны генотипу S. aureus, обнаруженному на кожных покровах. Заключение. Высокая частота совпадений генотипов свидетельствует о возможности миграции S. aureus между биотопами в организме человека и об отсутствии выраженной специализации штаммов S. aureus к колонизации какого-либо одного из них. Ключевые слова: атопический дерматит, Staphylococcus aureus, генетическое типирование.
(Для цитирования: Пикина А.П., Шкопоров А.Н., Кулагина Е.В., Хохлова Е.В., Чаплин А.В., Володин Н.Н., Кафарская Л.И., Короткий Н.Г., Ефимов Б.А. Сравнительное генетическое типирование изолятов Staphylococcus aureus, выделенных с поверхности кожи, из носовой полости и кишечника у детей, страдающих атопическим дерматитом. Вестник РАМН. 2016;71(5):367-374. doi: 10.15690/vramn695)
Обоснование
Атопический дерматит — хроническое рецидивирующее заболевание кожи, характеризующееся нарушением целостности эпидермального барьера, снижением гидратации рогового слоя, воспалением; сопровождающееся выраженным психоэмоциональным воздействием на пациента и членов его семьи. По данным разных источников, частота встречаемости атопического дерматита у детей составляет 15-30% [1]. В течение последних десятилетий отмечается прогрессивный рост распространенности атопического дерматита в развитых странах, в том числе в России [1, 2].
В основе патогенеза атопического дерматита лежит конвергенция генетической предрасположенности к заболеванию с воздействием на организм разнообразных внешних факторов, в совокупности приводящих к глубокому и стойкому нарушению важнейших функций кожного покрова, включая проницаемость кожи и антимикробного барьера [3].
Негативные изменения антимикробного барьера при атопическом дерматите часто сопровождаются колонизацией поврежденной и неповрежденной кожи золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus), что отражается в существенном различии качественных и количественных показателей, характеризующих обсеменение кожи больных бактериями этого вида по сравнению с кожей практически здоровых лиц [4].
В то время как в норме кожа редко (2-25%) колонизирована S. aureus (за исключением здоровых хронических носителей S. aureus в эндемичных районах), частота колонизации кожи больных с атопическим дерматитом, по разным данным, варьирует от 76 до 100% [5].
Ранее в серии непрерывных исследований по изучению микробной обсемененности кожных покровов у 26 детей в возрасте от 4 до 16 лет с диагнозом атопического дерматита мы обнаружили колонизацию (в средней концентрации 4,0±1,4 lg KOE/см2) пораженных участков кожи S. aureus в 88,5% случаев. С меньшей частотой выявлялись другие виды стафилококков: S. epidermidis,
S. hominis, S capitis, S. cohnii, S. simulans, S. haemolyticus. На участках неповрежденной кожи, хотя и в меньшей степени, но также определялся патогенный штамм S. aureus (23,1% случаев) в концентрации до3,2±0,8 lg КОЕ/см2 кожного покрова [4].
При изучении параметров обсемененности микрофлоры кожи 14 клинически здоровых детей S. aureus не выявлены, а видовой состав стафилококков у них включал только S. epidermidis и S. hominis в низкой концентрации [6].
Штаммы S. aureus, изолированные с кожи больных атопическим дерматитом, как правило, хронически колонизируют покровы тела, и могут быть повторно изолированы даже спустя месяцы после лечения [7].
К непосредственным причинам, вызывающим стойкую колонизацию кожи больных S. aureus, относят, прежде всего, нарушение целостности рогового слоя кожи, изменение pH в щелочную сторону, экссудацию фибриногена из плазмы, повышение синтеза фибронектина под действием интерлейкина 4 и снижение синтеза антимикробных пептидов кератиноцитами [8].
Колонизируя кожу, S. aureus могут вырабатывать эксфолиатины, альфа-гемолизин, а также другие токсины и ферменты, которые вызывают повреждение ке-ратиноцитов. Некоторые штаммы S. aureus синтезируют суперантигены, что вызывает поликлональную актива-368 цию Т лимфоцитов, обусловливающую гиперпродукцию провоспалительных цитокинов и усиление воспалительной реакции. Таким образом, суперантигены, ассоциированные с S. aureus, выступают также и в роли аллергенов [5, 8].
Антибактериальная терапия приводит к снижению тяжести течения атопического дерматита, хотя ее эффек-
тивность ниже ожидаемой вследствие высокой скорости реколонизации пораженных участков кожи. Поскольку у больных атопическим дерматитом колонизация S. aureus с высокой частотой обнаруживается на слизистой оболочке носовой полости, высказано предположение, что именно она является резервуаром патогенных микроорганизмов [9].
Одним из подтверждений того, что можно говорить о переносе бактерий в организме с кожи в носовую полость, могло бы служить обнаружение генетической идентичности штаммов S. aureus, выделенных из разных областей тела у одного больного. Этот же факт мог бы указывать на преимущественную независимую колонизацию конкретного пациента определенными генотипами бактерий внутри вида S. aureus.
Генетическое типирование штаммов S. aureus, выделенных с пораженных участков кожи, а также носовой полости и кишечника больных детей, проводили с использованием двух молекулярно-генетических методов. Первый заключался в сравнительном высокочувствительном анализе кривых температур плавления (High Resolution Melting Analysis, HRM), продуктов амплификации фрагмента хромосомной ДНК S. aureus, кодирующего аминокислотную последовательность гипервариабельного региона X белка А (spa), полученных при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) [10]. Другой метод подразумевал сравнительный анализ длин продуктов амплификации, также полученных при помощи ПЦР, спейсерных участков, располагающихся между генами 16S рРНК и 23S рРНК, многокопийных рРНК-оперонов хромосомной ДНК S. aureus. Показатель уровня внутривидовой вариабельности длин спейсерных участков и
A.P. Pikina1, A.N. Shkoporov1, E.V. Kulagina2, E.V. Khokhlova1, A.V. Chaplin1, N.N. Volodin3, L.I. Kafarskaya1, N.G. Korotkiy1, B.A. Efimov1
1 Russian National Research Medical University, Moscow, Russian Federation 2 Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation 3 D. Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology,
Moscow, Russian Federation
Comparative Genotyping of Staphylococcus aureus Strains Isolated from Skin Lesions, Nasal Cavities, and Feces of Children with Atopic Dermatitis
Background: The lesion ofskin of the majority atopic dermatitis patients is chronically colonized by bacteria belonging to the species Staphylococcus aureus. Topical antibacterial and anti-inflammatory therapy treatment are often ineffective due to fast recolonization by S. aureus and exacerbation of allergic process. Aims: Our aim was to determine a frequency of S. aureus colonization in skin lesions, mucous membranes of the nasal cavity and intestine of children with atopic dermatitis, to compare the genotypes of Staphylococcus aureus strains isolated from different biotopes of atopic dermatitis patients, and to clarify whether the intestinal and nasal cavities microbiota may act as a source of S. aureus recolonization of skin lesions. Materials and methods: Bacteriological examination of fecal samples, skin, and nasal swabs was conducted in 38 atopic dermatitis patients. The pure bacterial cultures of S. aureus were identified using API Staph (Biomerieux, France) and Vitek 2 MS (Biomerieux, France). Isolates of S. aureus were subjected to genotyping by analysis of rRNA internal 16S-23S rRNA spacer regions and high resolution melting analysis (HMR) of polymorphic spa X-regions. Results: 99% S. aureus strains were successfully identified using MALDI-TOF mass-spectrometry. S. aureus cultures were isolated from all biotopes in 31,6% of children, from skin and nasal cavities — in 42% of cases, from skin and feces — in 2,6% of cases, only from skin — in 10,5%, from nasal cavities and feces — in 2,6%, and only from nasal cavities — in 2,6% of cases. In 8% of children, S. aureus was not detected in any of the biotopes. Genotyping of the isolates enabled the detection of 17 different genotypes. A match between the genotypes of skin and nasal strains, and skin and fecal strains was observed in 88% and 61% of the cases respectively. Conclusions: The observed a high-frequency matching genotypes suggests the possibility of migration of S. aureus strains inside biotopes in humans and the absence of specialization to colonization of any of the niches. Key words: atopic dermatitis, Staphylococcus aureus, genotyping.
(For citation: Pikina AP, Shkoporov AN, Kulagina EV, Khokhlova EV, Chaplin AV, Volodin NN, Kafarskaya LI, Korotkiy NG, Efimov BA. Comparative Genotyping of Staphylococcus aureus Strains Isolated from Skin Lesions, Nasal Cavities, and Feces of Children with Atopic Dermatitis. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2016;71(5):367-374. doi: 10.15690/vramn695)
числа рРНК-оперонов ранее с успехом был использован для типирования и сравнения клинических изолятов S. aureus [11, 12].
Цель исследования: определение частоты колонизации S. aureus кожных покровов, слизистых оболочек носовой полости и кишечника детей, страдающих атопическим дерматитом, проведение с помощью методов генетического типирования сравнительного анализа выделенных из различных биотопов штаммов S. aureus и оценка вероятности миграции стафилококков между биотопами.
Методы
Дизайн исследования
Проведено одномоментное обсервационное моноцентровое исследование.
Критерии соответствия
В исследование включали детей младше 18 лет, страдающих атопическим дерматитом.
Условия проведения
Исследование проведено на базе кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова (Москва).
Продолжительность исследования
Биоматериал брали однократно; наблюдений за состоянием обследуемых или исследования в динамике в рамках данной работы не проводили. Включение пациентов в исследование и набор материала проходили в течение 2008-2012 гг.
Исходы исследования
Выделяли S. aureus с кожи, из носовой полости и кишечника у детей с атопическим дерматитом. Проводили генетическое типирование выделенных штаммов. Определяли частоту совпадения генотипов штаммов S. aureus из различных ниш организма.
Методы регистрации исходов
Материалом для бактериологического исследования служили смывы с 1 см2 пораженных участков кожи, смывы из носовой полости и фекалии обследуемых. Тампоны со смывами участков кожи помещали в транспортные пробирки, содержащие 2 мл стерильного физиологического раствора. Тампоны со смывами из носовой полости помещали в пробирки с транспортной питательной средой. Фекалии собирали стерильным шпателем и помещали в транспортный контейнер. Для определения количества S. aureus в образцах кожных смывов и фекалий в бактериологической лаборатории из этого материала готовили серийные разведения в стерильном физиологическом растворе. Посев материала на селективную питательную среду проводили из разведений исследуемого материала в 101 и 103 раз. Определение обсемененности носовой полости проводили только качественно — путем высева исследуемого материала с тампонов непосредственно на питательную среду.
Для выделения стафилококков использовали селективную питательную среду Staphylococcus Medium 110 (Difco, США). После посева чашки Петри инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С, на этой среде микроорганизмы вида S. aureus образуют колонии с желтой пигментацией. Морфологию бактерий изучали микроскопи-
ей мазков, окрашенных по Граму. Определение родовой и видовой принадлежности выделенных микроорганизмов проводили на основании изучения каталазной активности и теста на плазмокоагуляцию. Для биохимической идентификации использовали тест-систему API-20 Staph (BioMerieux, Франция).
Кроме этого, для видовой идентификации микроорганизмов использовали метод MALDI-TOF MS (Matrix assisted laser desorption/Ionization time-of-flight Mass Spectrometry), основанный на времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией при содействии матрицы [13, 14]. Масс-спектрометрия была проведена с использованием прибора Vitek 2 MS (BioMerieux, Франция). Анализ спектров осуществляли с использованием программного обеспечения Saramis (BioM-erieux, Франция).
Все штаммы бактерий, принадлежащие к виду S. aure-us, были получены в чистой культуре сначала на плотной питательной среде, а затем в жидкой питательной среде BHI (BBL) для последующего приготовления лиофили-зированных стоков. Лиофилизацию чистых культур бактерий проводили в растворе сахарозы (10%) и желатина (1%) в лиофильной сушке SB1 (Chemlab, Англия). Все последующие манипуляции с чистыми культурами стафилококков осуществляли после их выделения из лиофи-лизированных стоков. 369
Геномную ДНК из чистых культур стафилококков получали путем двухминутного кипячения суспензии бактериальных клеток в ТЕ-буфере и последующего центрифугирования лизата клеток. Супернатант использовали в качестве образцов ДНК в ПЦР.
Амплификацию фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность гипервариабельного региона X белка А S. aureus, проводили в приборе BioRad C 100 с оптическим модулем CFX-96 с использованием готовых ПЦР-смесей (Синтол, Россия), содержащих флуоресцентный краситель EvaGreen (QIAGEN, Германия). Реакционные смеси объемом 25 мкл содержали 0,2 мкл образцов ДНК и специфичные для исследуемой области праймеры 1095F (5'-AGACGATCCTTCGGTGAGC-3') и 1517R (5'-GCTTTTGCAATGTCATTACTG-3') в финальной концентрации 0,2 мкМ каждого. Программа ПЦР в реальном времени состояла из начальной денатурации при 94°С в течение 15 с и 30 циклов амплификации, включавших отжиг праймеров при 60°С в течение 20 с и элонгацию при 72°С в течение 20 с. Затем проводили один цикл программы HRM для построения графиков кривых плавления продуктов амплификации, заключавшейся в линейном повышении температуры реакционной смеси от 75 до 95°С с одновременной регистрацией данных, характеризующих флуоресценцию на каждом шаге повышения температуры на 0,1°С. Время каждого этапа измерения составляло 5 с [10].
Для анализа кривых плавления использовали собственное программное обеспечение прибора BioRad C 100 (версия Precision Melt analysis), которое позволяет пользователю несколькими способами визуализировать данные в HRM и на этом основании распределить анализируемые последовательности на HRM-кластеры с вычислением уровня достоверности их принадлежности к соответствующему кластеру.
Идентичность ПЦР-продуктов, полученных при амплификации специфического участка ДНК из штаммов стафилококков, выделенных из смывов носовой полости и испражнений (опытные образцы), ПЦР-продуктам, полученным при амплификации ДНК из штаммов, выделенных из смывов кожи (контрольный образец) соот-
ветствующих пациентов, определялась по результатам анализа кривых плавления.
Для визуализации данных НИМ-анализа были использованы сгенерированные программой кривые:
• кривая зависимости отрицательной производной функции флуоресценции от температуры (Т) (ё// Л), которая главным образом отображает температуру плавления (Тт) продукта амплификации;
• нормализованная исходная кривая, показывающая зависимость уменьшения флуоресценции от повышения температуры;
• разностные кривые, которые отображают определяемую пользователем кривую в качестве базисной линии (т.е. как ось Х) и изображают другие нормализованные кривые по отношению к этой базисной линии. Критерием признания кривых плавления продуктов
амплификации опытных и контрольных образцов как «одинаковые» или «отличающиеся» служило определение их принадлежности к тому или иному НИМ-кластеру. В соответствии с этим кривые плавления, характеризующие опытные штаммы, считались одинаковыми с выбранным контрольным штаммом, если они относились к одному и тому же кластеру. Кроме того, для признания НИМ кривой опытного образца такой же, как кривая контрольного образца, следовала двухступенчатая процедура.
370 Во-первых, проводился сравнительный анализ нормализованной НИМ кривой для опытного образца с нормализованными профилями контрольного образца. Во-вторых, НИМ профиль контрольного образца выбирался в качестве контроля для разностного графика, и сравнение разностных кривых использовалось для определения, был ли опытный штамм одинаковым с контрольным или же отличался от него.
Для анализа количества и размера спейсерных участков между генами 16Б рРНК и 23Б рРНК производилась ПЦР с праймерами IX (5'-GGTGAAGTCGTAACAAG-3') и II (5'-TGCCAAGGCATCCACC-3') [11, 12]. Состав ПЦР-смеси: 8Е-буфер AS (СибЭнзим, Россия), доведенный до 1х; 2,5 мМ MgCl2; 0,4 мМ смеси нуклеотидов; 0,5 мкМ каждого праймера; 1 ед. Taq ДНК полимеразы (СибЭнзим, Россия), 0,2 мкл выделенной ДНК. Программа ПЦР состояла из начальной денатурации при 94°С в течение 2 мин, 30 циклов (денатурация — 1 мин при 94°С, отжиг праймеров — 1 мин при 55°С, элонгация — 40 с при 72°С) и завершающей элонгации в течение 4 мин при 72°С. Для визуализации продуктов амплификации применялся электрофорез в 2% агарозном геле.
В данном исследовании штаммы признавались одинаковыми в том случае, если характеристики температур плавления продуктов амплификации специфического участка гена белка А не отличались между собой по НИМ-профилю, и электрофоретические картины, характеризующие их межгенные спейсерные участки, были неотличимы.
Этическая экспертиза
В соответствии с заключением Этического комитета РНИМУ им. Н.И. Пирогова данное исследование не подлежит этической экспертизе согласно СОП ЭК РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Статистический анализ
Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывали.
Методы статистического анализа данных: частота совпадения генотипов штаммов S. aureus оценивалась с помощью пермутационного теста [15].
Результаты
Объекты (участники) исследования
Изучение параметров колонизации кожных покровов, слизистой оболочки носовой полости и толстой кишки бактериями вида S. aureus проведено у 38 детей обоего пола, страдающих атопическим дерматитом. Возраст обследуемых составлял от 1,5 до 17 лет (средний возраст 6 лет). У наблюдаемых детей в анамнезе количество обострений основного заболевания составляло 2-3 раза в год. Обострения заболевания в большинстве случаев были связаны с нарушениями в питании. Суммарная продолжительность обострений атопического дерматита в год в среднем составляла 2-3 нед. У всех пациентов имелись родственники первой степени родства с атопическими заболеваниями.
Основные результаты исследования
Проведенные исследования показали, что участки пораженной кожи у детей, страдающих атопическим дерматитом, были колонизированы S. aureus в 33 (86,8%) случаях из 38. С применением MALDI-TOF масс-спектрометрии были успешно идентифицированы 99% выделенных штаммов S. aureus: у 12 (31,6%) детей — из всех изученных ниш, у 16 (42,1%) — с поверхности кожи и из носовой полости, у 1 (2,6%) — с кожи и из кишечника, у 4 (10,5%) — только с кожи, у 1 (2,6%) — из носовой полости и кишечника, у 1 (2,6%) — только из носовой полости. У 3 (7,8%) детей S. aureus не были обнаружены ни в одной из ниш.
Средняя концентрация S. aureus на коже составила 4,6± 1,4 КОЕ/см2. В 3 случаях из образцов смывов с кожи было выделено 2 отличающихся по совокупности фенотипических свойств штамма S. aureus (по биохимическим свойствам и чувствительности к антибиотикам). Средняя концентрация S. aureus в кишечнике составила 4,6±0,87 КОЕ/г исследуемого материала.
Всего было выделено 159 штаммов S. aureus.
Для сравнительного генотипирования был отобран 51 штамм, выделенный с поверхности кожи, из носовой полости и испражнений 18 обследованных детей (табл.).
Таблица. Источники выделения, температура плавления (Гот), HRM и 16S-23S рРНК спейсер генотип штаммов S. aureus, выделенных от детей, страдающих атопическим дерматитом
№ п/п № штамма Источник выделения S. aureus Tm(HRM) HRM Генотип Генотип по спейсеру 16S-23S рРНК Генотип по совокупности HRM + спейсер 16S-23S рРНК
1 Смыв с кожи 85.6 4 1 1
1 2 Носовая полость 85.6 4 1 1
3 Кишечное содержимое 85.6 4 1 1
4 Смыв с кожи 85.4 8 2 2
2 5 Носовая полость 85.4 8 2 2
6 Кишечное содержимое 85.4 8 2 2
Таблица. Источники выделения, температура плавления (Tm), HRM и 16S-23S рРНК спейсер генотип штаммов S. aureus, выделенных от детей, страдающих атопическим дерматитом (Окончание)
№ п/п № штамма Источник выделения S. aureus Tm (HRM) HRM Генотип Генотип по спейсеру 16S-23S рРНК Генотип по совокупности HRM + спейсер 16S-23S рРНК
8 Смыв с кожи 82.9 7 4 3
3 9 Носовая полость 82.9 7 4 3
10 Кишечное содержимое 84.4 1 5 4
17 Смыв с кожи 84.4 1 9 5
4 18 Смыв с кожи 84.8 6 8 6
19 Носовая полость 84.4 1 9 5
20 Кишечное содержимое 84.4 1 9 5
5 21 Смыв с кожи 83.9 2 6 7
24 Носовая полость 83.9 2 6 7
6 25 Смыв с кожи 83.8 2 6 7
26 Носовая полость 83.8 2 6 7
30 Смыв с кожи 84.1 10 13 8
7 31 Носовая полость 85.0 11 2 9
32 Кишечное содержимое 84.3 5 3 10
34 Смыв с кожи 84.1 10 13 8
8 35 Носовая полость 84.1 10 13 8
36 Кишечное содержимое 84.1 10 13 8
11 Смыв с кожи 84.4 1 5 4
9 12 Смыв с кожи 83.7 2 7 11
13 Носовая полость 83.8 2 7 11
14 Кишечное содержимое 85.6 4 15 17
38 Смыв с кожи 85.6 4 1 1
10 39 Носовая полость 85.6 4 1 1
41 Кишечное содержимое 85.6 4 1 1
43 Смыв с кожи 84.4 1 12 12
11 45 Носовая полость 84.8 6 10 13
46 Кишечное содержимое 84.8 6 10 13
12 47 Смыв с кожи 84.1 10 13 8
48 Носовая полость 84.1 10 13 8
13 49 Смыв с кожи 85.1 3 11 14
50 Носовая полость 85.1 3 11 14
51 Смыв с кожи 85.1 3 11 14
14 52 Носовая полость 85.1 3 11 14
53 Кишечное содержимое 85.1 3 11 14
15 54 Смыв с кожи 84.5 1 9 5
55 Кишечник 84.5 1 9 5
16 56 Смыв с кожи 84.4 5 3 10
57 Носовая полость 84.4 5 3 10
60 Смыв с кожи 85.6 4 1 1
17 61 Носовая полость 85.6 4 1 1
62 Кишечное содержимое 83.9 2 14 15
63 Смыв с кожи 85.4 8 1 16
18 64 Смыв с кожи 85.7 4 1 1
65 Носовая полость 85.7 4 1 1
66 Кишечное содержимое 85.7 4 1 1
371
Рис. Агарозный электрофорез наборов участков между генами 16S рРНК и 23S рРНК в многокопийных рРНК оперонах. На первой дорожке представлен ДНК-маркер 100 bp + 1.5 Kb (СибЭнзим), на дорожках 2-10 — ПЦР-продукты, полученные из ДНК различных штаммов S. aureus.
У данной группы детей S. aureus был выделен из 2 или 372 3 биотопов. В смывах из носовой полости этих детей S. aureus был обнаружен в 17 (94,4%) случаях из 18 обследованных детей, а в фекалиях — в 13 случаях (72,2%).
Температуры плавления продуктов амплификации участка ДНК, кодирующего гипервариабельный регион X белка А S. aureus, полученные при помощи HRM-анализа, находились в диапазоне от 83,4 до 85,7°С. В соответствии с вышеуказанными критериями, по 51 нуклеотидной последовательности spa было сгенерировано 11 различных типов HRM.
При анализе характеристик спейсерных участков между генами 16S рРНК и 23S рРНК было выявлено 15 вариантов электрофоретических картин (рис.). Суммарно при использовании двух методов генотипирования было выделено 17 отличающихся генотипов S. aureus, причем кожные покровы детей были колонизированы
13 различными генотипами, носовая полость — 11, кишечник — 10. С наибольшей частотой среди обследованных пациентов были распространены штаммы S. aureus, отнесенные нами к генотипам 1 и 8: бактерии этих генотипов были обнаружены в различных анатомических областях у 4 и 3 детей соответственно. Генотипы 4, 5, 7, 10 и
14 S. aureus встречались каждый у двух разных пациентов. Только штаммы 10 генотипов (2, 3, 6, 9, 11, 12, 13, 15, 16 и 17) S. аureus колонизировали по одному ребенку.
В 15 (88,2%) случаях из 17 генотипы S. aureus, колонизирующие носовую полость и кожные покровы детей, совпадали. В 8 (61,5%) случаях из 13 генотип S. aureus, колонизировавший кишечник, был идентичен генотипу стафилококков, колонизирующих кожные покровы. Подобная высокая частота совпадений свидетельствует о возможности миграции S. aureus между биотопами в организме человека и отсутствии выраженной специализации штаммов к колонизации какому-либо одному из них. Для установления статистической значимости полученной частоты совпадений был применен пермутационный тест [16]: генотипы штаммов подвергались 10 000 случайных перемешиваний, после чего считалась частота совпадений генотипов штаммов между биотопами организма. В результате, случайная частота совпадения генотипов в сравнении «кожа-носоглотка» составила 9,6±6,8%, в сравнении «кожа-кишечник» — 10,0+8,0%. Таким об-
разом, в обоих случаях наблюдаемая частота совпадений (88,2 и 61,5% соответственно) значимо отличались от частоты, которая бы наблюдалась при случайных совпадениях (р<0,0001, пермутационный тест).
Обсуждение
Резюме основного результата исследования
По результатам исследования показана высокая частота колонизации S. aureus поврежденных участков кожных покровов, слизистой оболочки носовой полости и кишечника детей, страдающих атопическим дерматитом. Генетическое типирование выделенных штаммов S. aureus позволило выявить 17 отличающихся генотипов, обладающих высоким уровнем специфичности колонизации индивидуального организма. В большинстве случаев генотипы S. aureus, колонизирующие носовую полость и кишечник детей, страдающих атопическим дерматитом, были идентичны генотипу микроорганизмов, обнаруженных на их кожных покровах.
Обсуждение основного результата исследования
Атопический дерматит является наиболее распространенным хроническим воспалительным дерматозом. Заболевание характеризуется ранним началом, обычно в детском возрасте, кожным зудом, хронизацией с рецидивами и ремиссиями, наличием других сопутствующих атопиче-ских заболеваний (астма, сенная лихорадка), семейным анамнезом атопии и типичными изменениями вовлеченной в патологический процесс кожи. Кожа пациентов с атопическим дерматитом часто колонизирована S. aureus, причем как само наличие, так и количественный уровень колонизирующих кожу S. aureus коррелирует с усилением тяжести течения заболевания [6].
Временная эрадикация S. aureus путем применения антибиотикотерапии или антисептиков, даже когда кожа не имеет клинических признаков инфицирования, часто приводит к клиническому улучшению течения атопиче-ского дерматита. Однако эффективность антибактериальной терапии оказывается ниже ожидаемой из-за высокой скорости реколонизации пораженных участков кожи штаммами S. aureus [7, 17]. Проведенные ранее исследо-
вания показали, что возможными причинами реколони-зации кожных покровов у больных атопическим дерматитом могут быть устойчивость бактерий к применяемым антибактериальным препаратам, интраназальное и/или подногтевое носительство стафилококков и микробная контаминация лекарственных препаратов, используемых для местной терапии [7, 16]. В другом исследовании с применением молекулярных методов генетического ти-пирования штаммов S. aureus в качестве одного из потенциальных источников реколонизации кожных покровов у детей с атопическим дерматитом идентифицировали носительство S. aureus в носовой полости у родителей больных детей [17]. Так, в исследовании было показано, что по крайней мере один из родителей больного ребенка в 65% семей являлся носителем S. aureus в носовой полости. При этом 84% штаммов S. aureus, выделенных от детей и их родителей, обладали схожим генотипом. Исследований, посвященных сравнительному генетическому типированию штаммов стафилококков, выделенных из испражнений детей, страдающих атопическим дерматитом, ранее не проводилось. В то же время известно, что течение атопического дерматита часто сопровождается выраженным зудом. При расчесывании кожи бактерии вместе с эпителиальными клетками попадают на руки пациента и в подногтевое пространство, что в свою очередь может вести к контаминации ротовой и носовой полости либо прямо, либо опосредованно через предметы окружающей среды, например игрушки, к которой прикасается ребенок обсемененными руками и затем берет ее в рот. Контаминация ротовой полости может приводить к проникновению бактерий в носовую полость или в кишечник больного ребенка. Также существует вероятность того, что дети, страдающие атопическим дерматитом, контактным или воздушно-капельным механизмом могут загрязнять колонизирующими их штаммами стафилококков тесно контактирующих с ними людей, а те в свою очередь за счет тех же механизмов способны возвращать эти бактерии обратно детям. Кроме того, колонизирующие кишечник штаммы S. aureus с каловыми массами могут загрязнять перианальную область кожи и далее контактным механизмом распространятся на другие участки кожной поверхности. Однако эти предположения должны быть подвергнуты тщательному научному исследованию.
В нашем исследовании мы провели оценку частоты одновременного обнаружения S. aureus у детей с атопи-ческим дерматитом на коже, в носовой полости и в испражнениях. Кроме того, было проведено генетическое типирование выделенных штаммов S. aureus с целью подтверждения роли слизистых оболочек носовой полости и кишечника как вероятных источников реколонизации кожных покровов S. aureus.
Результаты бактериологического исследования подтвердили высокую частоту колонизации S. aureus поврежденных участков кожных покровов детей, страдающих атопическим дерматитом. Так, кожа 86,8% обследованных детей была колонизирована S. aureus. Кроме того, при бактериологическом исследовании смывов из носовой полости и образцов испражнений детей бактерии вида S. aureus были обнаружены в 79 и 37% случаев соответственно.
Генетическое типирование S. aureus позволило выявить 17 отличающихся генотипов S. aureus, причем кожные покровы 18 детей были колонизированы 13 различными генотипами этих бактерий, носовая полость — 11, кишечник — 10. Интересно, что только два из идентифицированных генотипов (генотипы 1 и 8) S. aureus были обнаружены более чем у двух обследованных детей. В
частности, S. aureus этих генотипов были обнаружены на коже, слизистой оболочке носа и в кишечном содержимом, каждый — у трех разных детей. Еще у одного ребенка стафилококки генотипа 1 были выделены только с поверхности кожи и из носовой полости. Генотипы 4, 5, 7, 10 и 14 были обнаружены каждый у 2 детей. Штаммы S. aureus оставшихся 10 генотипов (2, 3, 6, 9, 11, 12, 13, 15, 16 и 17) колонизировали только по одному ребенку. Эти данные свидетельствуют о высоком уровне специфичности колонизации S. aureus детей, страдающих атопи-ческим дерматитом, что выражается в индивидуальной склонности организма больного ребенка к контаминации определенными, характерными только для него генотипами S. aureus.
Кроме того, было установлено, что в 88% случаев генотип S. aureus, колонизирующий носовую полость, ив 61% случаев генотип S. aureus, колонизирующий кишечник детей, страдающих атопическим дерматитом, был идентичен генотипу S. aureus, обнаруженных на их кожных покровах. С учетом возможности сенсибилизации организма аллергенами S. aureus их длительная персистенция в указанных биотопах может влиять на течение как непосредственно кожного процесса, так и провоцировать возникновение воспалительных процессов в кишечном тракте, а также аллергического ринита, возникающего впоследствии как этап атопического марша.
Ограничения исследования
Основным ограничением исследования является анализ параметров колонизации различных биотопов у детей, страдающих атопическим дерматитом, только стафилококками, относящимися к виду S. aureus.
Из 159 выделенных штаммов S. aureus для сравнительного генотипирования использовали 51 штамм стафилококков, выделенных с поверхности кожи, из носовой полости и испражнений у 18 из 38 детей. У данной группы детей S. aureus выделялся из 2 или 3 биотопов.
Заключение
Высокая частота совпадений генотипов штаммов S. aureus, выделенных из носовой полости, кишечника и с поверхности кожных покровов, свидетельствует о возможности миграции S. aureus между различными биотопами организма и отсутствии выраженной специализации штаммов S. aureus к колонизации какого-либо одного из них. Исходя из этого, поиск оптимальных методов предупреждения перекрестной микробной контаминации у детей, страдающих атопическим дерматитом, должен вестись с учетом их эффективности в отношении S. aureus во всех биотопах.
Источник финансирования
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова.
Конфликт интересов
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки исследования/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.
373
ЛИТЕРАТУРА
374
1. Семенов В.Ю., Руголь Л.В., Матвеев Э.Н. Повозрастные показатели нуждаемости детского населения в специализированной стационарной медицинской помощи на примере Московской области // Социальные аспекты здоровья населения. — 2010. — T.16. — №4 — C. 10. [Semenov VYu, Rugol LV, Matveev EN. Age-related indicators of children population's needs in the specialized stationary medical care by an example of the Moscow region. Sotsial'nye aspekty zdorov'ya naseleniya. 2010;16(4):10. (In Russ).]
2. Bieber T. Atopic dermatitis. Ann Dermatol. 2010;22(2):125-137. doi: 10.5021/ad.2010.22.2.125.
3. Leung DY. New insights into atopic dermatitis: role of skin barrier and immune dysregulation. Allergol Int. 2013;62(2): 151-161. doi: 10.2332/allergolint.13-RAI-0564.
4. Ефимов Б.А., Короткий Н.Г., Постникова Е.А. и др. Изучение качественного состава стафилококков кожи у больных атопическим дерматитом // Стерилизация и госпитальные инфекции. — 2007. — T.3. — №5 — C. 17-20. [Efimov BA, Korotkii NG, Postnikova EA, et al. Izuchenie kachestvennogo sostava stafilokokkov kozhi u bol'nykh atopicheskim dermatitom. Sterilizatsiya igospital'nye infektsii. 2007;3(5):17-20. (In Russ).]
5. Mempel M. Staphylococcus aureus and atopic eczema. In: Ring JPB, Przybilla B, Ruzicka T, editors. Handbook of atopic eczema. Berlin: Springer Science & Business; 2006. p. 406-409.
6. Park HY, Kim CR, Huh IS, et al. Staphylococcus aureus colonization in acute and chronic skin lesions of patients with atop-ic dermatitis. Ann Dermatol. 2013;25(4):410-416. doi: 10.5021/ ad.2013.25.4.410.
7. Gilani SJ, Gonzalez M, Hussain I, et al. Staphylococcus aureus re-colonization in atopic dermatitis: beyond the skin. Clin Exp Dermatol. 2005;30(1):10-13. doi: 10.1111/j.1365-2230.2004.01679.x.
8. Elias PM, Schmuth M. Abnormal skin barrier in the etiopathogen-esis of atopic dermatitis. Curr Allergy Asthma Rep. 2009;9(4):265-272. doi: 10.1007/s11882-009-0037-y.
9. Arisawa T, Arisawa S, Yokoi T, et al. Endoscopic and histological features of the large intestine in patients with atopic derma-
titis. J Clin Biochem Nutr. 2007;40(l):24-30. doi: 10.3164/ jcbn.40.24.
10. Stephens AJ, Inman-Bamber J, Giffard PM, Huygens F. Highresolution melting analysis of the spa repeat region of Staphylococcus aureus. Clin Chem. 2008;54(2):432-436. doi: 10.1373/ clinchem.2007.093658.
11. Gürtler V, Barrie HD, Mayall BC. Use of denaturing gradient gel electrophoresis to detect mutation in VS2 of the 16S-23S rDNA spacer amplified from Staphylococcus aureus isolates. Electrophoresis. 2001 ;22(10): 1920-1924. doi: 10.1002/1522-2683(200106)22:10<1920::aid-elps1920>3.0.co;2-0.
12. Saruta K, Matsunaga T, Kono M, et al. Rapid identification and typing of Staphylococcus aureus by nested PCR amplified ribosom-al DNA spacer region. FEMS Microbiol Lett. 1997;146(2):271-278. doi: 10.1016/s0378-1097(96)00487-9.
13. Nomura F. Proteome-based bacterial identification using matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim Biophys Acta. 2015;1854(6):528-537. doi: 10.1016/j.bbapap.2014.10.022.
14. Zhu W, Sieradzki K, Albrecht V, et al. Evaluation of the Bio-typer MALDI-TOF MS system for identification of Staphylococcus species. J Microbiol Methods. 2015;117:14-17. doi: 10.1016/j. mimet.2015.07.014.
15. Good P. Permutation tests: a practical guide to resampling methods for testing hypotheses. Springer series in statistics. New York: Springer Science & Business Media; 2013. 228 p.
16. Kim BS, Park JY, Song CH, et al. Clarifying the transmission route of Staphylococcus aureus colonizing the skin in early childhood atopic dermatitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 2012;109(6):448-453. doi: 10.1016/j.anai.2012.09.015.
17. Bonness S, Szekat C, Novak N, Bierbaum G. Pulsed-field gel elec-trophoresis of Staphylococcus aureus isolates from atopic patients revealing presence of similar strains in isolates from children and their parents. J Clin Microbiol. 2008;46(2):456-461. doi: 10.1128/ JCM.01734-07.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Пикина Алла Павловна, старший преподаватель кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: +7 (495) 434-16-77, e-mail: apikina@mail.ru SPIN-код: 3542-4060, ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7232-3288
Шкопоров Андрей Николаевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии и биобезопасности РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: +7 (495) 434-16-77, e-mail: a.shkoporov@gmail.com Кулагина Елена Валерьевна, научный сотрудник Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Адрес: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32, тел.: +7 (499) 135 98 46, e-mail: elenka176@yandex.ru SPIN-код: 3437-5000, ORCID: http://orcid.org/0000-0002-5381-1785
Хохлова Екатерина Викторовна, научный сотрудник лаборатории микробиологии и биобезопасности РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: +7 (495) 434-16-77, e-mail: a.shkoporov@gmail.com Чаплин Андрей Викторович, ассистент кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: +7 (495) 434-16-77, e-mail: okolomedik@gmail.com SPIN-код: 6434-2207, ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1377-7153
Володин Николай Николаевич, доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачёва
Адрес: 117997, Москва, ул. Саморы Машела, д. 1, тел.: +7 (495) 287-65-70, e-mail: info@fnkc.ru
Кафарская Людмила Ивановна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии и
вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: +7 (495) 434-16-77, e-mail: likmed@mail.ru
Короткий Николай Гаврилович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой дерматовенерологии
РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Адрес: 117997, Москва, Ленинский проспект, д. 117, тел.: +7 (495) 936-90-16, e-mail: korotkiy_ng@rsmu.ru Ефимов Борис Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1, тел.: +7 (495) 434-16-77, e-mail: efimov_ba@mail.ru
