CC BY
279
УДК 615.011:615.07
СРАВНИТЕЛЬНОЕ АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНОВ ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО И ЭВКАЛИПТА СЕРОГО
В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, Л.В. Тарасенко, В.М. Рыжов,
Н.Р. Шагалиева, А.В. Азнагулова, Л.В. Марлынова,
ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Куркин Владимир Александрович - e-mail: [email protected]
С использованием цифровой микроскопии в сравнительном плане изучены возможности диагностики сырья эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.) и эвкалипта серого
(Eucalyptus cinerea F.V.Muell. ex Benth.) морфолого-анатомическим, анатомо-гистологическим методами и методом петиолярной анатомии. При этом выявлены характерные морфологические, микроскопические и гистологические диагностические признаки строения листа, стебля и черешка исследуемых видов.
Ключевые слова: эвкалипт прутовидный, Eucalyptus viminalis Labill., эвкалипт серый, Eucalyptus cinerea F.V.Muell. ex Benth., Миртовые, Myrtaceae, листья, стебли, петиолярная анатомия, морфологическое, микроскопическое и гистологическое изучение.
Using of digital microscopy were studied possibilities of diagnostics of materials of Eucalyptus viminalis Labill. and Eucalyptus cinerea F.V.Muell. ex Benth. by morphologo-anatomic, anatomo-histologic methods and a method of petiole anatomy. There were shown typical diagnostic morphological, microscopic and histologic characteristics of the structure of leaf, stem, and petiole.
Key words: eucalyptus viminalis Labill., Eucalyptus cinerea F.V.Muell. ex Benth., Myrtaceae, leaves, stems, petiole anatomy, morphological anatomical, histological characteristics.
Введение
Листья эвкалипта прутовидного [(Eucalyptus viminalis Labill, сем. Миртовые - Myrtaceae] - фармакопейный вид растительного сырья [1]. Кроме того, на территории Российской Федерации произрастает и относительно морозоустойчивый вид - эвкалипт серый, ранее применявшийся в медицине [2]. Научный интерес к данным растениям отечественные и зарубежные ученые проявили давно, в то же время, если аспекты стандартизации и фитохимии данного объекта достаточно всесторонне и глубоко были изучены [3-5], то вопросы, касающиеся анатомо-морфологического исследования, проработаны в недостаточной степени [6].
По морфологическим признакам (форма листовой пластинки, наличие или отсутствие черешка, характер основания листовой пластинки и ее верхушки) различные виды эвкалиптов существенно отличаются друг от друга, однако указанные признаки имеют значение лишь при диагностике цельного сырья. Для измельченного сырья используется анатомо-гистологический метод анализа [7-9].
В литературе описаны анатомические особенности строения листовой пластинки, которая имеет классическое устройство и, как правило, у растений различных родов и семейств отличается незначительно [2, 8].
Кроме того, описанные особенности не являются селективными для близкородственных видов, что может быть причиной случайной или преднамеренной фальсификации [7, 8]. В случае диагностики листьев представителей рода Eucalyptus анатомическая и во многом - гистологическая характеристики листовых пластин сходны и не позволяют отличить листья одного вида эвкалипта от другого. Однако известно, что особенности петиолярной анатомии
(анатомии листового черешка) часто позволяют проводить диагностику растений даже близкородственных видов [10, 11]. Следует отметить, что у некоторых видов эвкалипта листья не имеют выраженных черешков. При этом исследуемые особенности строения черешка листа эвкалипта прутовидного имеют высокое диагностическое значение. Именно для диагностики данного вида нами исследовались возможности петиолярной анатомии.
Цель исследования: углубленное изучение морфологоанатомических особенностей строения листьев, стеблей и черешков эвкалипта прутовидного и эвкалипта серого.
Материалы и методы
Материалом исследования служили листья, стебли и черешки листьев эвкалипта серого, эвкалипта прутовидного, заготовленные в Краснодарском крае (г. Сочи, 2009, 2010 гг.). Кроме того, исследовались промышленные образцы листьев эвкалипта («Красногорсклексредства», 2009-2012 гг.). Пробоподготовку образцов проводили в соответствии с ГФ СССР XI издания [8, 12].
Исследования срезов образцов осуществляли с помощью микроскопов «Мо^с ОМ-111» (Корея) и «Мо^с ОМ-39С-\9СО-А» (Корея) с увеличениями '20, '40, '100, '400, '1000.
Для обнаружения диагностических признаков в тканях корней растения использовали гистохимические реакции:
1) с раствором сернокислого анилина на лигнифициро-ванные оболочки (окрашиваются в желтый цвет);
2) с раствором Судана III - наличие лизигенных эфирномасличных вместилищ (окрашиваются в оранжевокрасный цвет);
3) с 5% водным раствором гидроксида натрия [2, 12].
Результаты и их обсуждение
Основные анатомические признаки листьев эвкалипта серого аналогичны таковым и для листьев эвкалипта прутовидного. Для указанных видов характерен изолатераль-ный тип листовой пластинки (рис. 1).
А Б
РИС. 1.
Поперечный срез листа эвкалипта прутовидного (х 100).
А - поперечный срез листа эвкалипта прутовидного (обработка раствором щелочи); Б - поперечный срез листа эвкалипта прутовидного (обработка раствором щелочи, окрашивание раствором сернокислого анилина).
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - палисадная паренхима; 3 - губчатая паренхима; 4 - лизигенные вместилища; 5 - флоэма; 6 - ксилема;
7 - склеренхима; 8 - колленхима.
При этом столбчатая хлорофиллоносная паренхима расположена с обеих сторон листовой пластинки в 3-4 ряда (рис. 1). Клетки хлорофиллоносной ткани имеют вытянутую форму и плотно прилегают друг к другу. Межклетники практически не выражены. Губчатая паренхима выражена слабо, располагаясь, в основном, в центре. В клетках мезофилла встречаются кристаллы оксалата кальция обычно призматической формы, реже в форме друз.
Кроме того, для сравниваемых видов эвкалипта характерно наличие мощного слоя эпидермальной кутикулы с обеих сторон листа и лизигенных эфиромасличных вместилищ, окрашивающихся раствором Судана III в оранжево-красный цвет (рис. 2, 3).
А Б
РИС. 2.
Верхний эпидермис листа эвкалипта серого. Базальная часть.
Вид с поверхности (х400). А - фрагмент с пробкой; Б - фрагмент с жилкой.
Обозначения: 1 - клетки эпидермы листовой пластинки;
2 - устьичные аппараты; 3 - клетки эпидермы жилки;
4 - место опробковения.
Общей гистологической особенностью сравниваемых видов является и строение края листовой пластинки в поперечном сечении, которое представлено наличием достаточно большой зоны колленхимы уголкового типа. В области края листа наблюдается увеличение количества монокристаллов и друз оксалата кальция. Эпидермальные клетки по краю листовой пластинки заметно крупнее и имеют более утолщенную кутикулу, чем на основной поверхности листа (рис. 4).
РИС. 3.
Нижний эпидермис листа эвкалипта серого. Базальная часть. Вид с поверхности. А - общий вид (х100); Б - фрагмент края (х400). Обозначения: 1 - гидатода; 2 - щели кутикулы; 3 -клетки эпидермы края листа; 4 - эпидермис листовой пластинки; 5 - эпидермис жилки;
6 - устьичные аппараты.
А Б
РИС. 4.
Край листовой пластины листа эвкалипта прутовидного. Поперечного среза. А - край листа общий вид (х 100);
Б - фрагмент с кутикулой (х400).
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - колленхима; 3 - монокристалл;
4 - губчатый мезофилл; 5 - кутикула края листа.
Несмотря на достаточно большое количество схожих анатомических и гистологических признаков листовые пластинки сравниваемых видов эвкалипта имеют отличительные особенности.
Основным анатомо-гистологическим отличием, не описанным ранее в литературе, является форма центральной жилки листа эвкалипта. Центральная жилка листа эвкалипта серого на поперечном срезе имеет сердцевидную форму (рис. 5). У листьев эвкалипта прутовидного форма проводящего пучка центральной жилки листа имеет округлую форму (рис. 6). Указанная особенность имеет, на наш взгляд, диагностическое значение при определении вида эвкалипта. Кроме того, склеренхима, армирующая пучок у листа эвкалипта прутовидного, выражена значительно меньше (рис. 5).
А Б
РИС. 5.
Центральная жилка листа эвкалипта серого.
Поперечный срез (х100). А - общий вид;
Б - фрагмент с пробкой.
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - столбчатый мезофилл; 3 - друзы;
4 - склеренхима; 5 - ксилема; 6 - флоэма; 7 - вместилище с эфирным маслом; 8 - колленхима.
А Б
РИС. 6.
Жилка второго порядка листа эвкалипта прутовидного. Поперечный срез. (х 100, х400). А - поперечный срез листа эвкалипта прутовидного (обработка раствором щелочи, окрашивание раствором сернокислого анилина); Б - жилка листа эвкалипта прутовидного на поперечном срезе (обработка щелочью, окрашивание раствором сернокислого анилина).
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - лизигенные вместилища;
3 - пигмент; 4 - проводящая жилка; 5 - флоэма; 6 - склеренхима;
7 - палисадная паренхима; 8 - губчатая паренхима.
Вторичные жилки листа эвкалипта прутовидного значительно уступают в размерах таковым у эвкалипта серого, они не имеют мощной склеренхимы и окружены слоем клеток содержащих пигмент оранжевого цвета, усиливающийся после обработки раствором щелочи (рис. 7).
А
РИС. 7.
Жилка второго порядка листа эвкалипта серого. Поперечный срез. А - общий вид (х100); Б - фрагмент с верхней эпидермой (окраска раствором сернокислого анилина) (х400); В - фрагмент с нижним эпидермисом (х400). Обозначения: 1 - колленхима нижней стороны листа; 2 - склеренхима; 3 - флоэма; 4 - склеренхима; 5 -кутикула эпидермы; 6 - колленхима верхней стороны листа; 7 -столбчатый мезофилл; 8 - ксилема.
А Б
РИС. 8.
Стебель эвкалипта серого. Поперечный срез. А - до окраски (х 40); Б - окраска раствором сернокислого анилина (х 100). Обозначения: 1 - капля эфирного масла; 2 - эпидермис; 3 - паренхима коры первичной; 4 - флоэма; 5 - ксилема; 6 - разрыв паренхимы сердцевины.
Принимая во внимание то обстоятельство, что при заготовке сырья листья часто срезаются с молодыми побегами, нами проанализированы анатомо-гистологические особенности стеблей молодых побегов эвкалипта серого и эвкалипта прутовидного с целью выявления отличитель-
ных особенностей их строения.
Несмотря на одинаковый возраст стеблей сравниваемых видов, они несколько отличаются по размеру. При этом диаметр поперечного сечения однолетнего стебля эвкалипта серого уступает таковому эвкалипта прутовидного.
Помимо размера отличительной особенностью является форма поперечных сечений. У эвкалипта серого форма поперечных сечений стеблевой части побегов почти округлая со слабозаметными ребрами (рис. 8).
У эвкалипта прутовидного форма поперечного сечения однолетнего побега - бочковидная: она имеет округлые очертания, при этом сплюснута с краёв подобно бочке (рис. 9).
РИС. 9.
Стебель эвкалипта прутовидного. Поперечный срез (х 40).
А - неокрашенный препарат; Б - окраска раствором Судана III. Обозначения: 1 - сердцевина стебля с разрывом; 2 - эфиромасличное вместилище с каплей эфирного масла; 3 - паренхима первичной коры;
4 - флоэма; 5 - ксилема.
Кроме того, характерной особенностью является сильно утолщенная и кутинизированная поверхность эпидермиса стебля (рис. 10, 11).
РИС. 10.
Первичная кора стебля эвкалипта серого. Поперечный срез (х 400).А - фрагмент с вместилищем (неокрашенный препарат); Б - фрагмент с вместилищем (окраска раствором Судана III). Обозначения: 1 - кутикула; 2 - паренхима первичной коры; 3 - капля эфирного масла; 4 - монокристаллы.
А Б
РИС. 11.
Первичная кора стебля эвкалипта серого. Поперечный срез (х 400). А - окраска раствором сернокислого анилина;
Б - окраска раствором Судана III.
Обозначения: 1 - ксилема; 2 - монокристаллы; 3 - склеренхима перициклического происхождения; 4 - паренхима первичной коры;
5 - кутикула эпидермы.
Стебли обоих видов эвкалипта имеют сердцевину, выполненную паренхимой, в которой заметны разрывы.
В перимедулярной зоне на поперечном срезе побегов у сравниваемых видов имеются склеренхимные клетки, расположенные по периферии рыхлой паренхимы сердцевины (рис. 12).
Флоэмная часть проводящих тканей заметно выражена у стеблей эвкалипта серого. Флоэма у обоих видов эвкалипта окружена группами склеренхимных волокон перициклического происхождения. При этом лубяные волокна флоэмы расположены хаотично и значительно мельче склеренхимных волокон перициклического происхождения.
А Б
РИС
Сердцевина стебля эвкалипта серого. Поперечный срез (х 400).
А - не окрашенный препарат; Б - окраска раствором сернокислого анилина.
Обозначения: 1 - разрыв паренхимы сердцевины; 2 - паренхима сердцевины; 3 - склеренхима; 4 - монокристаллы; 5 - ксилема.
Общим признаком для стеблей обоих видов, как и для листьев, является наличие эфиромасличных вместилищ лизигенного характера с каплями эфирного масла, окрашивающихся раствором Судана III (рис. 13).
А Б
РИС. 13.
Эфиромасличные вместилища стебля эвкалипта прутовидного. Поперечный срез (х 400). А - неокрашенный препарат;
2Ч ' '
£ Ж
2|/' '
. '
Б - окраска раствором Судана III.
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - кутикула; 3 - полость вместилища;
4 - капля эфирного масла; 5 - клетки паренхимы первичной коры.
Таким образом, сравниваемые виды не имеют достаточных гистологических признаков точной и достоверной диагностики сырья. Поэтому для диагностики близкородственных таксонов успешно используется петиолярная анатомия, позволяющая по особенностям строения черешка листа определить виды, относящиеся к одному роду. В этой связи нами была изучена возможность диагностики фармакопейного вида - эвкалипта прутовидного методом петиолярной анатомии [10].
При этом проводили анатомо-гистологический анализ поперечных, продольных срезов, а также эпидермиса поверхности черешка.
За основные таксономически значимые петиолярные особенности принимали ранее сформулированные некоторыми авторами признаки: очертание черешка на поперечном срезе; число проводящих пучков, их расположе-
ние; наличие внепучковой склеренхимы; топографию колленхимы; степень развития опушения [9, 10].
Помимо вышеизложенных признаков использовали гистохимические реакции, позволяющие выявлять некоторые особенности гистологии, а также локализацию некоторых действующих веществ (эфирное масло в лизигенных вместилищах).
Первым и основным признаком при оценке петиоляр-ных особенностей является очертание черешка листовой пластинки на поперечном сечении.
У эвкалипта прутовидного форма черешка на поперечном сечении овальная немного сплюснутая с адаксиаль-ной стороны (рис. 14).
А Б
РИС. 14.
Поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного (х 40).
А - поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного;
Б - поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного
(окрашивание раствором судана III).
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - лизигенные вместилища;
3 - паренхима черешка; 4 - колленхима; 5 - флоэма; 6 - склеренхима; 7 - ксилема.
А Б
РИС. 15.
Продольный срез черешка эвкалипта прутовидного (х 100).
А - продольный срез черешка эвкалипта прутовидного после промывания 70% спиртом; Б - продольный срез черешка эвкалип-
та прутовидного.
Обозначения: 1 - кутикула; 2 - клетки эпидермиса; 3 - лизигенное вместилище; 4 - остатки эфирного масла; 5 - гиподерма; 6 - паренхима; 7 - монокристаллы; 8 - склеренхимная обкладка; 9 - флоэма.
Проводящие элементы пучка в черешке собраны в один крупный закрытый коллатеральный пучок. Пучок армирован склеренхимными волокнами перициклического происхождения, собранными в группы. Группы склеренхим-ных волокон расположены по периферии пучка с абакси-альной стороны практически замыкая его по кольцу. С адаксиальной (верхней) стороны диагностируется большая группа склеренхимных волокон обособленно стоящих от склеренхимы описанной выше. На продольном сечении склеренхимные волокна имеют сильно вытянутую форму. Их стенки значительно утолщены и имеют заметные поро-вые каналы. В флоэмной части пучка имеется лубяная склеренхима отличающаяся от ранее описанной значительно меньшими размерами клеток на поперечном сечении и не одревесневшими оболочками. Во флоэме наблю-
дается большое количество монокристаллов вытянутой формы (рис. 15, 16).
А Б
РИС. 16.
Продольный срез черешка эвкалипта прутовидного (х 400).
А - фрагмент с флоэмой; Б - фрагмент с трахеидами. Обозначения: 1 - спиральные сосуды; 2 - стенка с окаймленными порами; 3 - полость.
А Б
РИС. 17.
Поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного (х 100). А - поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного;
Б - поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного (окрашивание раствором Судана III).
Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - паренхима черешка; 3 - остатки лизированных клеток; 4 - лизигенные вместилища; 5 - капля эфирного масла; 6 - ксилема; 7 - склеренхима; 8 - флоэма;
9 - паренхима сердцевины; 10 - колленхима.
А Б
РИС. 18.
Поперечный срез черешка эвкалипта прутовидного (х 400). А -поперечный вид лизигенного вместилища черешка эвкалипта прутовидного; Б - поперечный вид лизигенного вместилища черешка эвкалипта прутовидного (окрашивание раствором судана III).
Обозначения: 1 - паренхима черешка; 2 - капля эфирного масла;
3 - остатки лизированных клеток; 4 - лизигенное вместилище;
5 - клетки эпидермиса; 6 - кутикула; 7 - пигмент.
Черешок листа эвкалипта прутовидного имеет похожее строение эпидермы с сильно утолщенной кутикулой, окрашивающейся раствором судана III. Эпидермис черешка не опушен. Форма эпидермальных клеток одинакова как в поперечном, так и в продольном сечении. В виду отсутствия ребер на черешке колленхима как таковая практически не выражена (рис. 17).
В паренхиме коры первичной по окружности равномерно расположены разноразмерные лизигенные вместилища округлой формы. В них часто заметны капли эфирного
масла желто-оранжевого цвета, окрашивающегося раствором судана III (рис. 18).
При рассмотрении с поверхности эпидермис черешка представлен мелкими клетками неправильной формы с сильно утолщенными, стенками. При этом необходимо отметить характерный рисунок кутикулы эпидермы, заметный при наведении на неё фокуса микроскопа (рис. 19).
А Б
РИС. 19.
Эпидермис черешка эвкалипта прутовидного, фокус на кутикулу (х 400). А - эпидермис черешка эвкалипта прутовидного;
Б - эпидермис черешка эвкалипта прутовидного (окрашивание раствором судана III).
Обозначения: 1 - кутикула; 2 - разлом в кутикуле.
Выводы
1. Проведенные морфологические и анатомогистологические исследования листьев и стеблей эвкалиптов серого и прутовидного позволили подтвердить имеющиеся данные и выявить ранее не описанные отличительные особенности сырья обоих видов.
2. Проанализированы анатомические особенности стеблей двух видов эвкалипта, исследуемые образцы несколько отличаются по размеру и по форме поперечных сечений.
3. Основным впервые выявленным анатомогистологическим отличием является форма центральной жилки листа эвкалипта: у эвкалипта серого центральная жилка листа на поперечном срезе имеет сердцевидную форму; у листа эвкалипта прутовидного - округлую форму.
4. Впервые изучены возможности петиолярной анатомии для диагностики фармакопейного вида - эвкалипта прутовидного, что позволяет более объективно подойти к вопросам диагностики цельного и измельченного лекарственного растительного сырья.
5. Результаты проведенных исследований позволили предложить новую редакцию раздела «Микроскопия» фармакопейной статьи «Эвкалипта листья».
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. МЗ СССР. 11-е изд. М.: Медицина, 1990. Вып. 2. 398 с.
2. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтически! вузов. Изд. 2-е, перераб. и доп. Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамПМу Росздрава», 2007. 1239 с.
3. Цыбулько Н.С. Исследование и стандартизация биологически активных соединений препарта «Эвкалимин»: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Москва, 1994. 22 с.
4. Зилфикаров И.Н. Совершенствование стандартизации сырья и фитопрепаратов эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis L. сем. Myrtaceae) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сборник научных трудов. Пятигорск.: Пятигорская ПФА, Санкт-Петербургская ПХФА. 2007. Вып. 62. С. 57-59.
Nh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
5. Зилфикаров И.Н. Новые подходы в разработке и стандартизации фитопрепаратов из эфирномасличного сырья: дисс. ... докт. фармац. наук. Пятигорск, 2008. 370 с.
6. Саного Мамаду. Морфолого-анатомические особенности листьев различных по антимикробной активности видов эвкалипта: дисс. ... канд. биологических наук. Москва, 1984. 144 с.
7. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Морфолого-анатомическое исследование
лекарственного растительного сырья: практикум по фармакогнозии. М.: Медицина, 1977. 255 с.
8. Самылина И.А., Аносова О.Г. Фармакогнозия. Атлас: учебное пособие: в 2-х томах. Т. 2. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 384 с.
9. Березовская Т.П., Дощинская Н.В., Серых Е.А. Методы микроскопического анализа ботанических объектов. Томск, 1978. 113 с.
10. Савинов И.А. Система и эволюция порядка Celastrales на основе данных сравнительной морфологии: автореф. дис. ... канд. биолог. наук. СПб., 2011. 50 с.
11. Сдобнина Л.И. Диагностические признаки лекарственных растений в петиолярной анатомии // Биоразнообразие: проблемы и переспективы сохранения: Материалы Международной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения И.И. Спрыгина 13-16 мая 2008 г. Ч.І. ПГПУ им. В.Г. Белинского. Пенза, 2008. С. 75-77.
12. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. МЗ СССР. 11-е изд. М.: Медицина, 1987. Вып. 1. 334 с.
