CC BY
1320. Nikolaeva M.A., Kulakov V.I., Korotkova IV. et al. // J. Human Reproduction. 2000. 15 (12). P. 2545 — 2553.
21. Principles for evaluating health risks to reproduction associated with exposure to chemicals: Environm. Health
Criteria 225. Geneva: WHO, 2001.
Поступила 11.10.12
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Макутина Валерия Андреевна,
эмбриолог, аспирант ФБУН «ЕМНЦ ПОЗРПП» Роспотребнадзора, ЗАО «Центр семейной медицины». E-mail: makutina_v@rambler.ru
Рослый Олег Федорович,
руководитель отдела медицины труда ФБУН «ЕМНЦ ПОЗРПП» Роспотребнадзора, докт. мед. наук, профессор. E-mail: ro slyof@y mrc.ru Балезин Сергей Леонидович,
зам. директора ЗАО «Центр семейной медицины», канд. мед. наук. E-mail: s.balezin@mail.ru Мамина Вера Павловна,
ст. научн. сотрудник Института экологии растений и животных УрО РАН, канд. биол. наук. E-mail: mamina@ipae.uran.ru Пашнина Ирина Александровна,
научн. сотрудник Института иммунологии и физиологии УрО РАН, зав. лабораторией иммунологии Областной детской клинической больницы № 1, канд. биол. наук. E-mail: irina_pashnina@list.ru
УДК 615.9
Л.И. Привалова1, М.П. Сутункова1, С.В. Пичугова2, Б.А. Кацнельсон1, Л.Г. Тулакина2,
Я.Б. Бейкин2, В.Я. Шур3
СРАВНИТЕЛЬНО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА И ЗОЛОТА НА ФАГОЦИТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ ГЛУБОКИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
1 ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора, Екатеринбург;
2 МБУ «Клинико-диагностический центр»; 3 Центр коллективного пользования «Современные нанотехнологии» Уральского федерального университета, г. Екатеринбург
Судя по цитологической характеристике свободной клеточной популяции глубоких дыхательных путей, полученной при бронхоальвеолярном лаваже через 24 ч после интратрахеального введения равных доз равновеликих наночастиц (НЧ) золота или серебра, оба металла вызывают активную мобилизацию фагоцитирующих клеток с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов, особо выраженном при введении наносеребра. Большее отношение числа этих клеток к числу альвеолярных макрофагов свидетельствует о значительно более высокой цитотоксичности на-носеребра по сравнению с нанозолотом и по сравнению даже с мельчайшими частицами серебра микрометрового диапазона. При электронной микроскопии выявлены однотипные картины внутриклеточного распределения и ультраструктурных нарушений в обоих типах фагоцитирующих клеток при существенных различиях между клетками, фагоцитировавшими наносеребро или нанозолото. Наибольшее значение авторы придают более выраженной склонности наносеребра к агрегации и к проникновению в митохондрии с повреждением последних.
Ключевые слова: наночастицы, серебро, золото, фагоцитоз, цитотоксичность.
L.I. Privalova1, M.P. Sutunkova1, S.V. Pichugova2, B.A. Katsnelson1, L.G. Tulakina2, Y.B. Beykin2, V.Y. Shur3. Comparative experimental assessment of the impact of gold and silver nanoparticles on the phagocyting cells of the lower airways
1 FBSI "Medical Research Center for Prophylaxis and Health Protection of Industrial Workers", Rospotrebnadzor, Ekaterinburg;
2 MBI "Clinical Diagnostic Centre", Ekaterinburg; 3 Collective Exploitation Centre "Modern nanotechnologies", Ural Federal University named after the first President of Russia B.N. Yeltsin, Ekaterinburg
Judging by the cytological characteristics of the free cell population of the lower airways obtained with assistance of the bronchoalveolar lavage in 24 hours after the intratracheal instillation of equal doses
of equidimensional gold or silver nanoparticles, both metals result in active recruitment of phagocytes with domination of neutrophile leukocytes, especially marked after the instillation of the nanosilver. The higher ratio of these cells count to that of alveolar macrophages gives evidence for the significantly higher cytotoxicity of the nanosilver comparing with both nanogold and even the smallest silver particles in the micrometric range. Transmission electron microscopy demonstrates similar pictures of intracellular distribution and ultra-structural damages caused by internalized nanoparticles in both types of phagocytes, while there are significant differences between cells under impact of nanosilver vs. those under impact of nanogold. The highest importance is higher propensity of the nanosilver particles to aggregation and to ingression into mitochondria with damaging these organelles.
Keywords: nanoparticles, gold, silver, phagocytosis, cytotoxicity.
Все расширяющееся применение нанотехно-логий в различных областях науки, техники и медицины и ряд особых свойств НЧ, обусловливающих их потенциально высокую биологическую агрессивность, делают крайне актуальной задачу «разработки критериев гигиенического нормирования безопасных условий производства, применения, использования и хранения различных наноматериалов...» [3]. Основой решения этой задачи является глубокое изучение общих и частных закономерностей вредного действия нано-материалов на организм. В этом направлении за последние несколько лет отмечается настоящий научный прорыв при все нарастающем числе публикаций, однако наименее изученным является важнейший вопрос о реагировании физиологических защитных механизмов на воздействие НЧ. Действительно, если эти механизмы, как нередко утверждается в научной литературе, практически неэффективны, установление безопасных уровней воздействия наноматериалов в принципе невозможно.
Ранее проведенные нами исследования [1, 2, 5—7] показали на примере оксида железа Fe3O4 (магнетита), что НЧ обладают значительно более высокой цитотоксичностью для легочных макрофагов, как и более высокой субхронической системной токсичностью, чем частицы микрометрового диапазона при равных массовых дозах и одном и том же химическом составе, но вызывают более активную и эффективную защитную реакцию легочного (альвеолярного) фагоцитоза. Необходимо было выяснить, является ли это закономерностью, присущей также действию других металлических НЧ. Кроме того, среди исследовательских проблем, с решением которых связаны углубление теоретических основ оценки риска для здоровья при производстве и применении металлсодержащих наноматериалов, и их гигиеническое нормирование существенное значение имеет вопрос о том, в какой мере вредное действие наноматериалов на организм зависит не только от нано-размерности как таковой, но и от химической природы наноматериала.
В связи с этим мы поставили перед собой задачу сопоставить реакцию организма на НЧ серебра и золота близкого размера и на микрочастицы серебра.
Как известно, ключевым механизмом самоочищения пульмонарной области респираторного тракта от отложившихся на ее поверхности малорастворимых частиц является мобилизация клеток, способных фагоцитировать эти частицы, тем самым препятствуя их пенетрации в легочный интерстициум и способствуя выведению по пути мукоцилиарного транспорта. Основным эффектором фагоцитарного звена пульмонарного клиренса являются легочные альвеолярные макрофаги (АМ), а вспомогательным — нейтро-фильные лейкоциты (НЛ). При повреждении АМ фагоцитируемыми частицами мобилизация НЛ играет важную компенсаторную роль, а сама контролируется количеством продуктов макрофагального разрушения и поэтому она тем интенсивнее, чем выше повреждающее действие (цитотоксичность) частиц для макрофага [10]. В связи с этим численное отношение НЛ к АМ в клеточной популяции бронхоальвеолярного лава-жа служит косвенным показателем сравнительной цитотоксичности различных частиц.
М а т е р и а л ы и м е т од и к и. Суспензии (коллоидные растворы) НС и НЗ изготавливались методом лазерной абляции металла в жидкости. Средний диаметр частиц обоих на-нометаллов равнялся 50 ± 10 нм и сохранялся стабильным на протяжении недели после приготовления; тем не менее, для каждого введения животным мы использовали свежеприготовленную суспензию. Суспензия микрочастиц серебра со средним диаметром 1,1 ± 0,01 мкм была получена путем сжигания беззольных фильтров, пропитанных нитратом серебра с последующим ультразвуковым диспергированием в деионизо-ванной воде.
Эксперимент проведен на белых аутбредных крысах-самках с начальным весом тела 150 — 220 г. Крысам вводили интратрахеально по 1 мл водной суспензии, содержащей 0,5 мг НС или
Что введено Число клеток, млн НЛ/АМ
Общее Альвеолярные макрофаги (АМ) Нейтрофильные лейкоциты (НЛ)
Наносеребро 4,25 ± 0,77*° 1,16 ± 0,14 2,99 ± 0,71*° 2,47 ± 0,33*°
Микросеребро 1,99 ± 0,25^ 1,24 ± 0,19^ 0,73 ± 0,15*^ 0,66 ± 0,13*^
Нанозолото 2,30 ± 0,93 0,94 ± 0,09 0,63 ± 0,15*^ 0,63 ± 0,13*^
Вода (контроль) 1,41 ± 0,33 0,89 ± 0,18 0,13 ± 0,04 0,14 ± 0,023
Что
введено
Число клеток, млн
Обще
Альвеолярные макрофаги
(АМ)
Нейтрофильные лейкоциты
(НЛ)
НЛ/АМ
Наносеребро
4,25 ± 0,77*°
1,16 ± 0,14
2,99 ± 0,71*°
2,47 ± 0,33*°
Микросеребро
1,99 ± 0,25^
1,24 ± 0,19^
0,73 ± 0,15*^
0,66 ± 0,13*^
Нанозолото
2,30 ± 0,93
0,94 ± 0,09
0,63 ± 0,15*^
0,63 ± 0,13*^
Вода (контроль)
1,41 ± 0,33
0,89 ± 0,18
0,13 ± 0,04
0,14 ± 0,023
* Статистически значимое различие с контрольной группой; • с группой «наносеребро»; ° с группой микросеребро (р < 0,05 по ^критерию Стьюдента).
НЗ или стерильной дистиллированной воды без частиц; параллельно оценивалась реакция на введение равной дозы микрочастиц серебра. Спустя 24 ч после инстилляции проводился бронхоальве-олярный лаваж. Общая клеточность полученной при этом жидкости (БАЛЖ) оценивалась ме-ланжерным методом, а клетки, осажденные при ее центрифугировании, исследовались с помощью оптической и электронной микроскопии.
Р е з у л ь т а т ы и и х о б с у ж д е н и е. Данные оптической микроскопии. Как видно из таблицы, введение наночастиц золота вызвало выраженное, хотя и статистически недостаточно значимое, повышение общей клеточности БАЛЖ и числа АМ при статистически значимом 5-кратном увеличении числа НЛ. Однако наночастицы серебра вызвали значительно более активную реакцию по всем показателям, причем по отношению НЛ/ АМ различие реакций на НЗ и НС статистически значимо, свидетельствуя о том, что НС существенно более цитотоксично, чем НЗ. Как и при сравнении нано- и микрочастиц оксида железа [1, 5—7], сравнение нано- и микросеребра свидетельствует о том, что при одной и той же химической природе нано- и микрочастиц последние гораздо менее цитотоксичны и поэтому вызывают менее интенсивную мобилизацию НЛ. Вместе с тем, как показывает наш опыт, число АМ в БАЛЖ (отражающие противоположно направленные влияния их мобилизации и разрушения) при действии более цитотоксичных частиц нередко бывает меньшим, чем при действии менее цитотоксичных; именно это соотношение имеет место при сравнении нано-и микросеребра. В других случаях мобилизация новых АМ, которая так же, как и мобилизация НЛ, управляется количеством образующихся продуктов макрофагального разрушения, но при ином типе математической зависимости между их дозой и числом мобилизуемых клеток [10] превалирует над их разрушением, так что число АМ оказывается более высоким при действии более цитоток-сичных частиц.
Данные трансмиссионной электронной микроскопии. В каждой исследованной клетке НЧ золота обнаружены в количестве от 15—20 до 70—80. В качестве примера приведена микрофотография АМ (рис. 1). Проникновение через цитоплазматическую мембрану происходит с образованием фагосомы, отграниченной тонкой мембраной. В цитоплазме НЧ преимущественно обнаруживаются в фагосомах, преимущественно одиночных, не контактирующих ни с какими органеллами. Конгломераты НЧ не выявлены в цитоплазме ни одной из просмотренных клеток. На 72 изученных микрофотографиях АМ и НЛ только 15 частиц обнаружены внутри митохондрий, где они локализуются на кристах или на внутренней поверхности митохондриальной мембраны. У таких митохондрий отмечается выраженная деструкция крист, гомогенизация мито-хондриального матрикса, лишь частичная сохранность двухконтурной мембраны. В клетках, в ци-
Рис. 1. Альвеолярный макрофаг, увеличение х 22 000.
Наночастицы золота равномерно распределены в цитоплазме и ядре (стрелки без номера). Духконтур-ность мембраны ядра сохранена не на всем протяжении. Видна митохондрия (стрелка 1), не взаимодействующая с наночастицами, но их сохранена фрагментарно
топлазме которых обнаруживаются частицы, но они непосредственно не взаимодействуют с митохондриями, в последних также видны признаки деструкции, которые, однако менее выражены, чем при проникновении НЧ внутрь органеллы.
НЧ золота выявляются в ядрах всех просмотренных клеток. В некоторых случаях частицы проникают внутрь ядра без выраженного изменения ядерных мембран; в других случаях проникновение частиц сопровождается разрыхлением ядерной мембраны, нарушением ее двухконтур-ности. Аналогичные изменения ядерной мембраны выявляются и при множественном расположении частиц вблизи ядерной мембраны. Изменений хроматина вокруг частиц в ядре почти не выявлено, лишь в единичных случаях отмечается его разрежение.
Все вышеизложенное в принципе в равной степени характерно для АМ и НЛ.
НЧ серебра обнаруживаются не в каждой клетке, от единичных или умеренного числа, до большого количества. В фагосомах, располагающихся в глубине клетки, обнаруживаются и одиночные частицы, и их скопления, однако невозможно судить, проникли ли последние в клетку в преформированном состоянии или образовались уже внутри сливающихся фагосом. Наиболее часто выявляются скопления частиц, локализованные внутри митохондрий либо на кристах, либо на внутренней поверхности мембран (рис. 2 и 3). В некоторых митохондриях скопления настолько крупные, что занимают почти всю органеллу. У митохондрий, как взаимодействующих с частицами, так и не взаимодействующих с ними, выявляются признаки деструкции: сохранены лишь единичные кристы или видны только их фрагменты, отмечается гомогенизация митохондриально-го матрикса; двухконтурная мембрана сохранена фрагментарно или не видна совсем.
Во всех просмотренных клетках НЧ серебра, находящиеся внутри ядра, или в контакте с ядерной мембраной, не выявлены. Вблизи ядра обнаруживаются и единичные частицы. Изменения ядерной мембраны при этом неоднородны. Отмечается разрыхление ядерной мембраны и нарушение ее двухконтурности на участке вблизи крупной одиночной частицы, но вместе с тем, вблизи небольшого скопления, состоящего из некрупных частиц, ядерная мембрана четкая, двухконтурность хорошо просматривается.
Разницы в локализации частиц внутри АМ и НЛ, как и при действии НЗ, не выявлено.
Таким образом, основные различия электронно-микроскопической картины легочных фагоци-
тов после воздействия нанозолота и наносеребра сводятся к следующему.
— Частицы НЗ чаще видны в единичном состоянии и относительно равномерно распределенными, а частицы НС более склонны к образованию конгломератов.
— Частицы НС, в отличие от частиц НЗ, почти не видны внутри клеточных ядер.
— Частицы НС проявляют больший, чем частицы НЗ, тропизм к митохондриям, накапливаясь в них в большем количестве и вызывая деструкцию мембраны и крист.
Рис. 2. Альвеолярный макрофаг, увеличение х 28 000.
Проникновение наночастиц серебра из скоплений в цитоплазме в митохондрии. В ядре наночастицы серебра не обнаружены.
Рис. 3. Альвеолярный макрофаг, увеличение х 36 000.
Видны наночастицы серебра (одиночные и в скоплениях) на внутренней поверхности митохондриальной мембраны. Отмечается деструкция крист, гомогенизация митохондриального матрикса, мембраны митохондрий сохранены частично. В ядре частицы серебра не обнаружены
С неодинаковой способностью к повреждению митохондрий и, тем самым, к индуцированию оксидативного стресса, с которым многие исследователи связывают повреждение ДНК под влиянием НС «ин витро» (например, [4, 8, 9]) можно сопоставить значительно более высокую генотоксичность НС «ин виво» по сравнению с НЗ, показанную в другом эксперименте с теми же образцами нано-металлов (Б.А. Кацнель-сон, О.Г. Макеев и др. в печати). По-видимому, этот опосредованный механизм генотоксичности сравниваемых НЧ важнее, чем их прямой внутриядерный контакт с ДНК, вероятность которого, как показывает электронная микроскопия, значительно выше в случае НЗ.
Интересно также сопоставить электронно-микроскопические картины при действии НЗ и НС с полученными нами при методически аналогичном изучении действия наночастиц оксида железа Fe3O4 — магнетита [2, 6, 7]. Можно отметить, что изменения, вызванные наномаг-нетитом, по некоторым особенностям (склонность к образованию конгломератов частиц и к накоплению в митохондриях с выраженным повреждением последних, отсутствие видимых на-ночастиц внутри ядра) ближе к вызванным действием наносеребра, чем действием нанозолота.
В ы в о д ы. 1. После интратрахеально-го введения равных доз близких по размеру НЧ золота или серебра оба металла вызывают активную мобилизацию фагоцитирующих клеток с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов, особо выраженную при введении наносеребра. 2. Судя по отношению числа нейтрофилов к числу альвеолярных макрофагов, наносеребро обладает значительно более высокой цитотоксичностью по сравнению с нанозолотом и с даже мельчайшими микрометровыми частицами металлического серебра. 3. При электронной микроскопии в обоих типах фагоцитирующих клеток выявлены однотипные картины внутриклеточного распределения и ультраструктурных нарушений, но при существенных различиях между клетками, фагоцитировавшими наносеребро или нанозолото. Особого внимания заслуживает более выраженная склонность наносеребра по сравнению с нанозолотом к агрегации частиц и к их проникновению в митохондрии с повреждением последних.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Кузьмин С.В. и др. // Токсикол. вестн. 2010. № 2. С. 18—25.
2. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Сутунко-ва М.П. и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2011. № 11. С. 560—563.
3. Онищенко Г.Г. // Гиг. и сан. 2011. № 2. C. 4—9.
4. Choi J.E., Kim S., Ahn J.H. et al. // Aquatic Toxicology. 2010. № 100 (2). P. 151—159.
5. Katsnelson B.A., Privalova L.I., Kuzmin S.^. et al. // Internat. J. Occupât. and Environm. Health. 2010. Vol. 16. P. 508—524.
6. Katsnelson B.A., Privalova L.I., Degtyareva T.D. et al. // Central. Europ. J. Occup. Environm. Med. 2010. № 16 (1—2). P. 47—63.
7. Katsnelson B.A., Privalova L.I., Sutunkova M.P. et al. // J. Nanomedic. and Nanotechnol. 2012. № 3 (1). P. 1—8.
8. Kim H.R., Kim M.J.. Lee S.Y. et al. // Mutat Res. 2011. № 726 (2). P. 129—135.
9. Li N.. Xia T, Nel A. E. // Free Rad. Biol. Med. 2008. № 44. P. 1689—1699.
10. Privalova L.I., Katsnelson B.A.. Osipenko A.B. et al.// Environm. Health Perspect. 1980. № 35. P. 205—218.
Поступила 11.10.12
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Привалова Лариса Ивановна.
зав. лабораторией научных основ биологической профилактики ФБУН «ЕМНЦ ПОЗРПП» Роспо-требнадзора, докт. мед. наук, профессор. E-mail: privalova@ymrc.ru Сутункова Марина Петровна.
ст. научн. сотрудник ФБУН «ЕМНЦ ПОЗРПП» Роспотребнадзора, канд. мед. наук. E-mail: marinasutunkova@yandex.ru Пичугова Светлана Владимировна.
врач клинической лаб. диагностики МБУ «Клинико-диагностический центр». E-mail: ekb-lem@mail.ru Кацнельсон Борис Александрович.
зав. отделом токсикологии и биопрофилактики ФБУН «ЕМНЦ ПОЗРПП» Роспотребнадзора, докт. мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ. E—mail: bkaznelson@etel.ru Тулакина Людмила Геннадьевна.
зав. лабораторией электронной микроскопии МБУ «Клинико-диагностический центр», канд. мед. наук. Бейкин Яков Борисович.
главный врач МБУ «Клинико-диагностический центр», докт. мед. наук, профессор. Тел.: (343) 25737-69
Шур Владимир Яковлевич.
директор Центра коллективного пользования «Современные нанотехнологии» Уральского федерального университета, докт. физ.-мат. наук, профессор. E—mail: vladimir_shu@yahoo.com
